特立帕肽對(duì)大鼠藥物相關(guān)性頜骨壞死模型作用的 實(shí)驗(yàn)研究

廖晨羽，徐陸晨，李運(yùn)峰

（1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正頜及關(guān)節(jié)外科，成都 610041；2.同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072）

藥物相關(guān)性頜骨壞死（MRONJ）是一種使用抗骨吸收藥物、抗血管生成藥物后產(chǎn)生的嚴(yán)重不良反應(yīng)[1]；臨床上主要表現(xiàn)為頜骨壞死、骨暴露及感染（如腫脹、疼痛、流膿）長(zhǎng)期存在，其具體的發(fā)病機(jī)制仍不明確，可能包括骨改建抑制、微循環(huán)障礙、炎癥、感染及持續(xù)存在的微創(chuàng)傷等[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的可導(dǎo)致MRONJ 發(fā)生的藥物包括抗骨吸收藥物雙膦酸鹽類(lèi)藥物（bisphosphonates，BPs）、狄諾塞麥（denosumab）、抗血管生成藥貝伐單抗（bevacizumab）、酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）舒尼替尼（sunitinib）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑西羅莫司（sirolimus）等[3]。

關(guān)于MRONJ 的治療，臨床上所使用的治療方法主要包括保守治療及手術(shù)治療。保守治療包括臭氧療法（ozone therapy，OT）、高壓氧治療（hyperbaric oxygen，HBO）、局部低劑量激光治療（low-intensity laser therapy，LILT）等[4-6]，不同方法的治療效果尚不明確。特立帕肽（teriparatide），即重組人甲狀旁 腺激素1-34（recombinant human parathyroid hormone 1-34,rhPTH 1-34）是一種合成的多肽激素，為人甲狀旁腺素的1-34 氨基酸片段，其生物學(xué)特性與內(nèi)源性甲狀旁腺素完全相同，是一種甲狀旁腺激素的同化劑。特立帕肽刺激骨形成和骨吸收，可減少絕經(jīng)后婦女骨折的發(fā)生率，主要用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松及性腺功能減退性骨質(zhì)疏松、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[7]。鑒于MRONJ 主要是由抗骨吸收、抗血管生成藥物引起，特立帕肽促進(jìn)骨代謝的作用可能對(duì)MRONJ 具有潛在的治療價(jià)值，并引起了學(xué)者們的重視[8-9]。本實(shí)驗(yàn)旨在建立穩(wěn)定的MRONJ 動(dòng)物模型，探究特立帕肽對(duì)MRONJ 的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇10 月齡雌性SD 大鼠，體質(zhì)量400～450 g，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于可控環(huán)境中，保持恒定適宜的溫度、光照和濕度，所有動(dòng)物接受相同的飲食條件。所有動(dòng)物接受MRONJ 建模操作，將建模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為2 組，比較特立帕肽的治療效果。本研究通過(guò)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)：WCHSIRB-D-2017-197）。

1.2 MRONJ 動(dòng)物模型的建立

經(jīng)大鼠尾靜脈注射唑來(lái)膦酸溶液（80 μg/kg），每周1 次，持續(xù) 7 周，第8 周拔除右上頜第一、第二磨牙。拔牙方法參照李慶帆等[10]研究中的拔牙方法。經(jīng)10%水合氯醛（3.3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠放置為仰臥位，放置自制開(kāi)口器，局部消毒，用2%利多卡因麻醉后，使用探針拔除大鼠右上頜第一、第二磨牙（圖1）。拔牙術(shù)后8 周，觀察大鼠頜骨壞死情況，建模成功的動(dòng)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[11-14]。

圖1 拔除大鼠右上頜第一、第二磨牙Figure 1 The first and second molars of the right maxillary of rats were extracted

1.3 特立帕肽對(duì)MRONJ 的治療作用

將MRONJ 建模成功的大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各6 只。對(duì)照組動(dòng)物接受皮下生理鹽水注射，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物接受皮下特立帕肽溶液注射（60 μg/kg，每周3 次），每周拍照觀察大鼠骨壞死區(qū)域的愈合情況，4 周后將所有大鼠行安樂(lè)死處理，收集標(biāo)本，采用大體觀察、組織學(xué)檢測(cè)、micro-CT 檢測(cè)評(píng)價(jià)2 組動(dòng)物的骨愈合情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MRONJ 模型的建立

拔牙術(shù)后第2 周觀察大鼠拔牙創(chuàng)愈合情況，部分大鼠右上頜拔牙創(chuàng)未閉合，見(jiàn)骨面暴露，MRONJ 模型建立成功率約為67%（圖2）。

圖2 建立MRONJ 動(dòng)物模型的結(jié)果Figure 2 Results of the establishment of MRONJ

2.2 大體觀察結(jié)果

治療4 周的過(guò)程中，對(duì)照組所有動(dòng)物的骨創(chuàng)面均未愈合，且有逐漸擴(kuò)大及骨壞死加重的趨勢(shì)（圖3）。特立帕肽治療的動(dòng)物中，部分動(dòng)物骨創(chuàng)面逐漸縮小，最終完全愈合，治愈率約為66.7%（6 只動(dòng)物中4 只痊愈）（圖4）。

圖3 對(duì)照組（生理鹽水治療）動(dòng)物頜骨壞死隨時(shí)間的變化情況Figure 3 Changes in osteonecrosis of the jaws over time in the control group (saline treatment)

圖4 實(shí)驗(yàn)組（特立帕肽治療）動(dòng)物頜骨壞死隨時(shí)間的變化情況Figure 4 Changes in osteonecrosis of the jaw over time in the experimental group (teriparatide treatment)

2.3 組織學(xué)檢測(cè)和micro-CT 結(jié)果

治療4 周后，對(duì)照組拔牙創(chuàng)均未愈合，組織切片結(jié)果示拔牙創(chuàng)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)紊亂，未形成正常骨組織排列；而實(shí)驗(yàn)組中，部分痊愈動(dòng)物的組織切片結(jié)果示拔牙創(chuàng)完全愈合，形成正常骨組織排列（圖5）。micro-CT 的結(jié)果與組織學(xué)類(lèi)似，對(duì)照組micro-CT 影像見(jiàn)拔牙窩空虛，骨創(chuàng)未愈；而實(shí)驗(yàn)組中，部分痊愈動(dòng)物的micro-CT 影像見(jiàn)拔牙窩愈合，充滿正常的骨組織（圖6）。

圖5 頜骨壞死區(qū)域的蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色圖片（×100）Figure 5 Hematoxylin and eosin（HE）staining of osteonecrotic area of the jaw（×100）

圖6 頜骨壞死區(qū)域的micro-CT 圖片F(xiàn)igure 6 Micro-CT images showing the osteonecrotic area of the jaw

3 討論

MRONJ 的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括正在使用或曾經(jīng)使用過(guò)抗骨吸收或抗血管生成藥物治療、頜面部死骨暴露或能探查到死骨的竇道存在8 周以上、排除口腔頜面部放射治療病史及腫瘤轉(zhuǎn)移性病變[2]。為了加強(qiáng)對(duì)MRONJ 的準(zhǔn)確診斷及病情分析，需結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)改變，其中CT 檢查是針對(duì)MRONJ 的影像學(xué)檢查中最有用的檢查方式之一，其影像學(xué)檢查主要表現(xiàn)為持續(xù)存在的拔牙窩及拔牙窩周?chē)墓菈乃繹15]。

為進(jìn)行MRONJ 相關(guān)研究，學(xué)者們[12-14]通過(guò)不同方法建立了MRONJ 的動(dòng)物模型，成功率各不相同。關(guān)于MRONJ 在上、下頜骨的發(fā)生率是否有差異仍有爭(zhēng)議[13-15]。通過(guò)拔除上頜磨牙或下頜磨牙來(lái)建立MRONJ 動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中，因用藥劑量、用藥持續(xù)時(shí)間、操作方法不同，也無(wú)法進(jìn)行MRONJ 發(fā)生率的比較[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期文獻(xiàn)[12-14]，采用10 月齡雌性SD 大鼠作為研究對(duì)象，經(jīng)尾靜脈注射唑來(lái)膦酸后，拔除大鼠上頜磨牙來(lái)建立MRONJ 模型，建模成功率約為67%。

BPs 會(huì)造成骨內(nèi)的毛細(xì)血管網(wǎng)喪失，導(dǎo)致頜骨局部缺血和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，從而干擾傷口愈合過(guò)程，甚至造成頜骨壞死。通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立MRONJ 動(dòng)物模型，尚不能達(dá)到100%的成功率，這可能跟大鼠的個(gè)體差異有關(guān)，尤其與大鼠頜骨血液供應(yīng)及創(chuàng)傷愈合能力密切相關(guān)。目前，我們?nèi)圆磺宄Ｊ〉木唧w原因是什么。

BPs 被廣泛用于治療以鈣和骨代謝紊亂為特征的骨病[17-18]。隨著其應(yīng)用增加，由其導(dǎo)致MRONJ 的報(bào)道逐漸增加。已有研究[19]表明，BPs 對(duì)骨骼礦物質(zhì)有高親和性，且骨骼中藥物半衰期非常長(zhǎng)，骨中BPs 的長(zhǎng)期滯留和骨改建的長(zhǎng)期抑制可導(dǎo)致創(chuàng)傷長(zhǎng)期不愈合[20-21]。停藥在臨床上難以很快奏效，且停藥對(duì)腫瘤患者有何影響，暫不明確，故因BPs 治療引起的MRONJ 已引起廣泛重視。特立帕肽可通過(guò)刺激骨母細(xì)胞增殖、骨基質(zhì)蛋白合成和破骨細(xì)胞生成來(lái)誘導(dǎo)骨轉(zhuǎn)換和增加骨量[22]。同時(shí)，特立帕肽還可消除BPs 對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用[23]，故特立帕肽被認(rèn)為對(duì)治療MRONJ 有效。但也有研究[24]表明，特立帕肽可誘導(dǎo)大鼠骨肉瘤的發(fā)生，且其發(fā)生呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性。雖然還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特立帕肽治療與人類(lèi)骨肉瘤之間存在因果關(guān)系的證據(jù)，但特立帕肽顯然不適合用來(lái)治療腫瘤患者因使用BPs 而產(chǎn)生的MRONJ[25]。但現(xiàn)實(shí)的情況是，使用BPs 治療的腫瘤相關(guān)患者，其MRONJ 的發(fā)生率遠(yuǎn)高于使用BPs 治療的骨質(zhì)疏松癥患者[26]。故特立帕肽對(duì)MRONJ 的治療適應(yīng)證嚴(yán)重受限，針對(duì)腫瘤患者使用BPs 后發(fā)生的MRONJ，仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，特立帕肽對(duì)MRONJ 具有顯著的治療作用，這可能與特立帕肽促進(jìn)骨代謝、逆轉(zhuǎn)BPs抑制骨代謝的作用機(jī)制有關(guān)。