葡萄CYP707A 基因家族的鑒定及對果實(shí)成熟的功能驗(yàn)證

龔麗麗 余花 楊杰 陳天池 趙雙瀅 吳月燕

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 200120；2.浙江萬里學(xué)院，寧波 315100）

葡萄（Vitis vinifera L.）是一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的非呼吸躍變型水果。水果的成熟期是其營養(yǎng)品質(zhì)和適口性的關(guān)鍵影響因素［1］。中國南方葡萄成熟期往往伴隨著高溫、臺風(fēng)和強(qiáng)降水等不利環(huán)境的影響。如何有效的避開不利生長季節(jié)對于葡萄生長和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

脫落酸（ABA）是一類在非呼吸躍變型果實(shí)起著重要作用的植物激素［2］。研究表明ABA 的積累可以通過激活上游NCED 酶或抑制下游ABA 8'-羥基化酶活性來調(diào)控植物生長［3］。有3 種不同的ABA 羥化途徑可以導(dǎo)致ABA 失活，通過氧化環(huán)結(jié)構(gòu)不同的甲基（C-7'、C-8'和C-9'）影響內(nèi)源ABA 的積累［4］。但ABA 8'-羥化酶編碼基因CYP707A，通常被認(rèn)為是主要的ABA 分解代謝途徑。ABA 經(jīng)CYP707A可被分解為相酸（PA），最終代謝產(chǎn)物為二氫相酸（DPA）［5］。研究表明，ABA 分解代謝的產(chǎn)物PA 在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的特定組織中可以激活A(yù)BA 受體PYL，在ABH2-1 突變體與過表達(dá)AtCYP707A3 雜交植株中，由于PA 降解途徑被阻斷和過量分解ABA，造成高PA 和低ABA 內(nèi)源環(huán)境，這種植株并沒有表現(xiàn)出一些ABA 生物合成突變體所觀察到的生長遲緩，意味著8'-羥基化的途徑不僅是ABA 一個(gè)失活反應(yīng)，同時(shí)在某些方面如低ABA 條件下具有補(bǔ)償作用［6-7］。另一項(xiàng)研究表明，ABA 9'-羥基化也被CYP707As 催化，這是ABA 8'-羥基化的一個(gè)副反應(yīng)［8］。研究表明CYP707As 是獨(dú)腳金內(nèi)酯信號通路的效應(yīng)物［9］。CYP707As不僅調(diào)控ABA穩(wěn)態(tài)，還參與信號通路過程。

近年來，ABA 8'-羥基化反應(yīng)的關(guān)鍵酶已從許多植物中分離出來，并被證明在植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用。從擬南芥中分離到4 個(gè)CYP707A 基因，其中AtCYP707A2 在種子萌發(fā)中起著至關(guān)重要的作用［10］。蘋果（Malus domestica Borkh）中鑒定出的MdCYP707A2.3 對蘋果樹延遲開花和解除休眠起到關(guān)鍵作用［11］。然而，關(guān)于CYP707A 在非呼吸躍變型水果中的作用卻知之甚少。在草莓（Fragaria ananassa Dchesne）中鑒定出4 個(gè)FaCYP707A 基因，這些基因可能在草莓果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮組織特異性作用，F(xiàn)aCYP707A3 可以讓植株適應(yīng)鹽脅迫［12］。櫻桃（Prunus avium L.）CYP707A1 和PacCYP707A3在水分脅迫和ABA 處理下受到正調(diào)控［13］。這些結(jié)果表明，CYP707A 基因家族在植物代謝中發(fā)揮著不同的作用，可以在各種脅迫下通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控內(nèi)源性ABA 水平，使植物更好地適應(yīng)環(huán)境。

闡明果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)理對提升果實(shí)品質(zhì)和提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要的指導(dǎo)意義，近年來，ABA合成和信號傳遞在葡萄果實(shí)成熟中的調(diào)控機(jī)制已被廣泛關(guān)注［14］，但ABA 分解代謝酶在葡萄果實(shí)成熟中鮮有報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)方法鑒定VvCYP707A 基因家族成員，并分析其家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和順式作用元件；通過qPCR 對VvCYP707As 的時(shí)空表達(dá)和組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析，并結(jié)合瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證，揭示VvCYP707As 的功能特征。旨在通過對VvCYP707As 的鑒定和功能分析，進(jìn)一步了解葡萄果實(shí)成熟的調(diào)控機(jī)制，以期為生物育種提供有效的理論依據(jù)，從而促進(jìn)地區(qū)葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料葡萄品種‘鄞紅’和‘甬早紅’采摘自中國浙江寧波鎮(zhèn)海（121°32'E，29°59'N）。ABA脅迫以果園內(nèi)初始生長狀況一致的五年生‘鄞紅’葡萄植株9 株為材料。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)以‘鄞紅’轉(zhuǎn)色期果實(shí)為材料。

1.2 方法

1.2.1 VvCYP707A 家族鑒定 為了從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫（http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-55/gff3/vitis_vinifera/）中鑒定 出VvCYP707A 基 因，使用NCBI 中的蘋果和擬南芥等物種的36 個(gè)CYP707A 蛋白作為查詢序列，利用Blastp，篩選出相似度超過50%的序列，刪除序列過短的蛋白。使用circos 繪制基因共線性圖。

1.2.2 VvCYP707A 蛋白分析 利用ExPASy software（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測VvCYP707 蛋白的等電點(diǎn)和分子量。利用葡萄數(shù)據(jù)庫中的定位信息，使用TBtools 對VvCYP707A 基因在葡萄染色體上的位置進(jìn)行可視化。使用在線網(wǎng)站ProtComp（ProtComp -Predict the sub-cellular localization for Plant proteins（softberry.com））對5 個(gè)CYP707A 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

1.2.3 VvCYP707 家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用默認(rèn)參數(shù)的ClustalW 對27 個(gè)CYP707A 蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對。采用MEGA 7.0 軟件，根據(jù)鄰接法構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1 000。使用MEME（MEME-MEME Suite（meme-suite.org））分析motif 結(jié)構(gòu)，使用GSDS（Gene Structure Display Server 2.0（gao-lab.org））分析基因結(jié)構(gòu)。

1.2.4 VvCYP707A 基因啟動子順式元件的鑒定 提取AtCYP07A 和VvCYP707A 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.5 kb 序列，通過PlantCARE 網(wǎng)站（PlantCARE,a database of plant promoters and their cis-acting regulatory elements（ugent.be））分析順式元件。

1.2.5 VvCYP707A 基因表達(dá)模式分析 ‘鄞紅’為葡萄中熟品種，自開花到果實(shí)成熟約為90 d，‘甬早紅’由‘鄞紅’輻射突變而來，轉(zhuǎn)色時(shí)間較‘鄞紅’短，上色快，自開花到果實(shí)成熟約為75 d，為葡萄早熟品種［15］。分別采摘‘甬早紅’和‘鄞紅’不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)、‘鄞紅’葉片和‘鄞紅’莖。其中，‘甬早紅’自開花后每隔15 d 采取樣品一次，‘鄞紅’自開花后每隔15 d 采取樣品一次，第5 次采樣與第4 次間隔30 d。共5 個(gè)時(shí)期，S1-S2 為幼果期，S3-S5 分別為膨大期、轉(zhuǎn)色期和成熟期。每個(gè)發(fā)育階段至少收集3 個(gè)樣本，果實(shí)一部分用來測定果實(shí)的理化性質(zhì)，另一部分放入液氮中速凍，用于 RNA提取。

1.2.6 ABA 脅迫處理 選取果園內(nèi)初始生長狀況一致的五年生‘鄞紅’葡萄植株9 株為材料，以施加清水組別為對照組，在轉(zhuǎn)色期的‘鄞紅’果實(shí)表面施加500 mg/L的外源ABA進(jìn)行激素處理，在5 min，2、4、6、8 h 五個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)采集3 串果實(shí)樣本。所有樣品用液氮冷凍，并在80℃保存，用于RNA 提取。

1.2.7 VvCYP707A 過表達(dá)載體的構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá) 采用雙酶切技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)載體，首先擴(kuò)增Vitvi07g01751 基因的全長編碼序列，并將其插入到35S-3xFLAG-1300 載體中構(gòu)建過表達(dá)載體35S:VvCYP707A，相關(guān)引物序列見表1，分別將攜帶空載體和目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并注射到葡萄轉(zhuǎn)色期果實(shí)中，注射后的果實(shí)在正常條件下暗培養(yǎng)48 h 后，測定果實(shí)基因表達(dá)量和糖含量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.8 果實(shí)品質(zhì)理化指標(biāo)測定 隨機(jī)挑選不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)各20 顆，電子天平（賽恩施，蘇州）測定果實(shí)重量，計(jì)算平均單果質(zhì)量。指針式水果硬度計(jì)（艾德堡，中國）測定果實(shí)硬度，10 次重復(fù)并記錄。蒽酮硫酸比色法測定可溶性糖含量［16］，3 次重復(fù)。

1.2.9 RNA 提取與RT-qPCR 檢測 采用南京諾唯贊公司的RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用上海近岸公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA 第一條鏈，上海近岸公司的SYBR qPCR Super Mix Plus 在Bio-Rad CFX96（Bio-Rad，美國）儀器上測定VvCYP707As的Ct 值，并以葡萄Actin 基因?yàn)閮?nèi)參基因［17］，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對基因表達(dá)量［18］。其中，表達(dá)模式分析以S1 為對照組；外源ABA 處理下以施加清水的組別為對照組。RT-qPCR 所用引物見表2。

表2 RT-qPCR 所用引物Table 2 Primers for RT-qPCR

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用SPSS、Origin、GraphPad 和TBtools 等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 葡萄VvCYP707A基因家族的鑒定及其蛋白分析

葡萄CYP707A 家族含有5 個(gè)成員，分別位于第2、3、6、7 和18 號染色體上（圖1-C）；蛋白分析如表3 所示，它們編碼氨基酸序列一致性達(dá)70.60%，且氨基酸長度和分子量相近（447-488 aa，50 689.3-55 496.0 kD），為堿性蛋白（pI＞9）；亞細(xì)胞定位預(yù)測位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；均含有血紅素鐵配位半胱氨酸殘基（PFGNGVHSCPG；圖1-A），說明葡萄CYP707A 家族高度保守。此外，共線性分析發(fā)現(xiàn)，Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792 發(fā) 生了片段復(fù)制（圖1-B）。

圖1 葡萄CYP707A 基因家族氨基酸比對（A）、共線性分析（B）與染色體定位（C）Fig.1 Amino acid alignment（A）,collinearity analysis（B）and chromosome localization（C）of grape CYP707A gene family

表3 葡萄CYP707A 蛋白相關(guān)信息Table 3 Information of CYP707A proteins in grape

2.2 葡萄VvCYP707A家族系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和保守motif分析

從8 個(gè)物種中篩選出24 條同源性較高的CYP707A 序列，通過MEGA X 建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。24 條蛋白可分為4 組，其中Vitvi02g01269 屬于 第1 組，Vitvi06g00498 屬于第2 組，其他3 個(gè)蛋白均屬于第4 組。每組都含有單子葉和雙子葉的CYP707A 蛋白，這表明該基因家族的起源先于單子葉和雙子葉植物的分化。

圖2 CYP707A 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis of CYP707A protein

為了更好地分析葡萄CYP707A 蛋白的進(jìn)化關(guān) 系，進(jìn)一步 分析了4 個(gè)AtCYP707As 和5 個(gè)VvCYP707As 的系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)和保守基序（圖3）。將結(jié)果分為3 個(gè)分支，分別命名為Clade I、Clade II 和Clade III（圖3-A）。Clade III 包含了3 個(gè)片段復(fù)制的VvCYP707A 蛋白（Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792）。系統(tǒng)發(fā)育分析也顯示Vitvi06g00498 與AtCYP707A2 蛋白具有較高的同源性。從葡萄和擬南芥CYP707As 的基因結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，AtCYP707A 和VvCYP707A 基因的外顯子數(shù)量保守，在6-9 個(gè)之間（圖3-B）。Clade I 和Clade II 具有相同的基因結(jié)構(gòu)，均含有兩個(gè)UTR 區(qū)域。Clade III 成員有0-2 個(gè)UTR 區(qū)域。各種內(nèi)含子和外顯子的多樣性表明，VvCYP707As 中可能的替代剪接，對發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要。

圖3 擬南芥和葡萄CYP707As 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（A）、基因結(jié)構(gòu)（B）及保守基序分析（C）Fig.3 Phylogenetic relationships (A),gene structure (B)and conserved motif analyses (C) of CYP707As from Arabidopsis and V.vinifera

為了進(jìn)一步分析CYP707A 蛋白結(jié)構(gòu)多樣性，利用MEME 分析motif（圖3-C）。有些motif 特異性存在于某些演化之中。例如，motif 9 只出現(xiàn)在Clade II中，motif 10 出現(xiàn)在Clade I 中?？傊?，進(jìn)化樹中進(jìn)化關(guān)系密切的CYP707A 蛋白的基因結(jié)構(gòu)基本相似，motif 保守，說明兩個(gè)不同物種中每個(gè)亞家族的進(jìn)化相對保守。

2.3 葡萄中VvCYP707A基因啟動子的順式元件鑒定

利用PlantCARE 在AtCYP707A 和VvCYP707A 基因上游1.5 kb 啟動子區(qū)域鑒定了潛在的順式元件。已鑒定的順式調(diào)控元件可分為3 個(gè)功能群，即生長發(fā)育相關(guān)、應(yīng)激和激素元件。結(jié)果（圖4）顯示，在所有的VvCYP707As 基因啟動子中都發(fā)現(xiàn)了與應(yīng)激和激素反應(yīng)相關(guān)的順式元件；與應(yīng)激相關(guān)的元件主要集中于MYB 和MYC；與激素相關(guān)的元件主要集中于參與ABA 反應(yīng)的ABRE、MeJA 反應(yīng)的CGTCAmotif 和乙烯反應(yīng)的ERE。葡萄的CYP707A 啟動子比擬南芥CYP707A 啟動子擁有更多的與生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，這可能與VvCYP707A 長期進(jìn)化形成特有功能相關(guān)。其中，Vitvi06g00498 基因啟動子中與激素反應(yīng)相關(guān)的順式元件數(shù)量最多，ABRE元件數(shù)量擁有8 個(gè)，可能該基因?qū)BA 反應(yīng)較為敏感；Vitvi03g00508 基因啟動子中與激素反應(yīng)相關(guān)的順式元件數(shù)量較少，只有一個(gè)ERE 順式元件。

圖4 擬南芥和葡萄CYP707As 基因啟動子順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements of AtCYP707As and VvCYP707As gene promotors in Arabidopsis and V.vinifera

2.4 葡萄VvCYP707A在不同葡萄品種果實(shí)中的表達(dá)模式

采取‘鄞紅’和‘甬早紅’兩個(gè)品種5 個(gè)時(shí)期的果實(shí)，測定其理化性質(zhì)（圖5-A-D），從中可以觀察到‘甬早紅’的單果重、硬度和可溶性糖發(fā)育模式與‘鄞紅’基本一致，‘甬早紅’果實(shí)單重和可溶性糖含量都低于‘鄞紅’；硬度在轉(zhuǎn)色期時(shí)差異顯著。

圖5 兩種葡萄果實(shí)發(fā)育的生理參數(shù)及VvCYP707As 基因相對表達(dá)量Fig.5 Physiological parameters and VvCYP707As related expression related to fruit development in two kinds of V.vinifera

5 個(gè)VvCYP707As 基因在兩個(gè)品種的果實(shí)的相對表達(dá)量如圖5-E 所示。除Vitvi18g00792 在兩個(gè)品種表達(dá)量無明顯差異外，其余的4 個(gè)VvCYP707As 基因在‘甬早紅’表達(dá)量均高于 ‘鄞紅’；Vitvi02g01269、Vitvi06g00498 和Vitvi18g00792 在兩個(gè)品種中各自具有相似的表達(dá)趨勢，即表達(dá)量與時(shí)期緊密相關(guān)。Vitvi07g01751 在‘甬早紅’和‘鄞紅’中表達(dá)量差異極為顯著，在S3 時(shí)期表達(dá)量差異甚至高達(dá)77.93倍。推測Vitvi07g01751 的高表達(dá)是導(dǎo)致 ‘甬早紅’成熟期提前的關(guān)鍵基因，同時(shí)導(dǎo)致其可溶性糖含量下降和硬度增加。

2.5 葡萄VvCYP707As在‘鄞紅’不同組織與不同時(shí)期的表達(dá)模式

VvCYP707As 在‘鄞紅’葡萄發(fā)育時(shí)的組織特異性如圖6 所示，以各個(gè)組織的S1 期為對照組。在果肉中（圖6-A），表達(dá)模式可以分為兩類，Vitvi07g01751和Vitvi18g00792具有相似的表達(dá)模式，幾乎在果實(shí)發(fā)育整個(gè)時(shí)期都發(fā)揮作用，在S5 時(shí)期表達(dá)下降；同樣身為片段復(fù)制的Vitvi02g01269 卻屬于第二類，隨著果實(shí)發(fā)育而增加，在S4 轉(zhuǎn)色期表達(dá)下調(diào)。在果皮中（圖6-B），VvCYP707As 基因在幼果期與膨大期均較高表達(dá)，在S4 轉(zhuǎn)色期同樣的表達(dá)下調(diào)。在轉(zhuǎn)色期不同組織中（圖6-C），Vitvi02g01269和Vitvi07g01751 在莖和葉中表達(dá)顯著大于果肉和果皮組織，其余VvCYP707As 在4 個(gè)組織中無顯著差異。VvCYP707As 主要在莖和葉組織中高表達(dá)。

圖6 VvCYP707As 在‘鄞紅’不同組織不同時(shí)期表達(dá)模式Fig.6 VvCYP707As expression patterns in different tissues and different periods in ‘Yin Hong’

2.6 葡萄VvCYP707As在外源ABA處理下的表達(dá)特性

為探究VvCYP707As 是否受外源ABA 誘導(dǎo)影響，采用外源ABA 噴施葡萄果實(shí)表面。VvCYP707As對外源ABA 在果皮和果肉中表現(xiàn)出不同的反應(yīng)模式，與施加清水的對照組相比，ABA 處理后5 min內(nèi)，葡萄果皮中Vitvi18g00792 表達(dá)量上升，其余VvCYP707As 基因表達(dá)量下降，說明ABA 處理顯著抑制了果皮中 VvCYP707As 的表達(dá)，隨后趨于穩(wěn)定（圖7-A）。然而，在ABA 處理的漿果肉中（圖7-B），VvCYP707As 會受到ABA 的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在處理后2-4 h 后波動較大，尤其是Vitvi02g01269和Vitvi03g00508，在ABA 處理后2 h 分別被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)28.36 倍和45.46 倍，但在4 h 時(shí)顯著下降；而Vitvi07g01751 在2 h 和4 h 持續(xù)高表達(dá)；Vitvi18g00792反應(yīng)敏感，在ABA處理1 h后達(dá)到峰值，2-4 h 表達(dá)下降，與對照組漿果肉表達(dá)量無顯著差異。

圖7 葡萄果皮（A）和果肉（B）VvCYP707As 基因在ABA 處理下相對表達(dá)量Fig.7 Relative expressions of VvCYP707As gene in grape pericarp（A）and grape flesh（B）under ABA treatment

2.7 葡萄VvCYP707As基因瞬時(shí)表達(dá)分析

Vitvi07g01751 基因表達(dá)量在‘鄞紅’和‘甬早紅’葡萄果實(shí)中差異顯著，推測其在葡萄成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。將構(gòu)建好的攜帶Vitvi07g01751 基因的重組質(zhì)粒注射到轉(zhuǎn)色期的‘鄞紅’果實(shí)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，48 h 后測定基因表達(dá)量和HPLC 法測定葡萄糖和果糖。結(jié)果（圖8-A）顯示，對Vitvi07g01751 基因瞬時(shí)表達(dá)量進(jìn)行RT-qPCR 分析，Vitvi07g01751 基因在35S:VvCYP707A 果實(shí)中表達(dá)量最高，并且與其他3 組具有顯著差異。過表達(dá)Vitvi07g01751 的果糖與對照組和空載35S 無顯著差異；35S:VvCYP707A葡萄糖顯著小于對照和35S 組，與2 d 前對照無顯著差異，影響了葡萄糖的積累；對葡萄6 個(gè)PYL 基因進(jìn)行RT-qPCR 檢測（圖8-B）。對照組、35S 和35S:VvCYP707A 組的VvPYL3/5/6 都與2 d 前對照組具有顯著差異，推測是葡萄自然發(fā)育影響了基因的表達(dá)量；35S 和35S:VvCYP707A 組的VvPYL1 較對照組有顯著差異可能是注射創(chuàng)口影響；VvPYL2 在4 個(gè)組別中無顯著差異；VvPYL4 在過表達(dá)Vitvi07g01751表達(dá)量變化極其顯著，說明Vitvi07g01751 的變化能影響VvPYL4 的表達(dá)。

圖8 瞬時(shí)表達(dá)相關(guān)基因RT-qPCR 檢測與理化測定Fig.8 Transient expression related genes were detected by RT-qPCR and determination of fruit sugar

3 討論

CYP707A 基因參與調(diào)控植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長發(fā)育等過程［14,19］。在大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)CYP707A 會造成植株生長緩慢［20］，而桃CYP707A轉(zhuǎn)入擬南芥中，在低溫環(huán)境下卻促進(jìn)植株生長［21］。目前，葡萄CYP707A 的相關(guān)研究較少，本研究通過多物種CYP707A 蛋白結(jié)構(gòu)域分析比對共鑒定出5 個(gè)葡萄CYP707A 家族成員。研究基因結(jié)構(gòu)和保守motif 的差異，是分析基因家族進(jìn)化關(guān)系的重要參考。CYP 家族是一個(gè)保守的大家族［22］，在本研究中，對VvCYP707A 多序列比對分析顯示，5 個(gè)CYP707A 基因都含有保守的P450 半胱氨酸血紅素鐵配位體，這是8'羥化酶催化活性的必須結(jié)構(gòu)［10］。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，CYP707A 蛋白在不同物種間具有高度的序列保守性，并且Vitvi18g00792 與CsCYP707A4 蛋白親緣關(guān)系較近，Vitvi03g00508 和Vitvi06g00498 與MdCYP707A 蛋白親緣關(guān)系較近，意味著葡萄的VvCYP707A 蛋白與蘋果和柑橘的親緣關(guān)系更近。通過對VvCYP707A 的基因結(jié)構(gòu)分析，除Vitvi03g00508 和Vitvi07g01751 外，都含有2 個(gè)UTR區(qū)，且蛋白motif 保守。VvCYP707A 基因啟動子序列含有大量應(yīng)激及激素相關(guān)的順式作用元件，且相較于AtCYP707A 有著更多的與生長發(fā)育相關(guān)的作用元件，可能這與VvCYP707A 參與果實(shí)成熟功能有關(guān)。

ABA8'羥化酶是催化ABA 降解的關(guān)鍵酶，參與了調(diào)節(jié)ABA 穩(wěn)態(tài)的過程?；蛑貜?fù)是基因家族產(chǎn)生和擴(kuò)張的主要原因，基因復(fù)制影響了植物物種間的基因功能的多樣性［23］，在本研究中，Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792 三 個(gè)發(fā)生片段復(fù)制的CYP707A 基因均在葡萄不同組織中表達(dá)，但表達(dá)模式存在差異，具有組織特異性和時(shí)空特異性，表明了VvCYP707A 在葡萄不同組織中參與了ABA 積累的調(diào)控。在葡萄果實(shí)中，大部分的VvCYP707As 隨著果實(shí)發(fā)育呈現(xiàn)表達(dá)下降的趨勢，僅有Vitvi07g01751 在‘甬早紅’果實(shí)膨大期表達(dá)顯著上升，推測該基因的特異性高表達(dá)可能是影響葡萄成熟期提前的關(guān)鍵因素之一，獼猴桃（Actinidia chinensis）CYP707A3 也有類似的發(fā)現(xiàn)［24］。此外，研究表明施加外源ABA 會促進(jìn)葡萄著色［25］，而內(nèi)源ABA 含量隨著葡萄果實(shí)發(fā)育而不斷積累至轉(zhuǎn)色期達(dá)到峰值［26］。本實(shí)驗(yàn)中，葡萄果皮中的CYP707As 在轉(zhuǎn)色期S4 下調(diào)表達(dá)，推測內(nèi)源ABA 不斷積累從而促進(jìn)了果實(shí)著色。

ABA 作為一種植物化學(xué)信號分子，已有報(bào)道表明植物受到外源ABA 處理后，與ABA 合成和分解的基因受其誘導(dǎo)調(diào)節(jié)［27］。其中，研究證實(shí)擬南芥和桃子CYP707A 基因家族可以被ABA 誘導(dǎo)［28-29］。本研究中，葡萄CYP707A 啟動子區(qū)域都含有ABA 響應(yīng)元件，且ABA 處理下，5 個(gè)VvCYP707A 都能進(jìn)行響應(yīng)，驗(yàn)證了順式作用元件預(yù)測的可靠性，并且反應(yīng)迅速的VvCYP707A 都含有ERE 順式作用元件，可能是由于施加外源ABA 后果實(shí)通過上調(diào)乙烯合成相關(guān)基因?qū)е路磻?yīng)敏感［30］。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究VvCYP707As 基因在果實(shí)成熟中的功能和闡明其機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)色期是葡萄成熟并積累糖的關(guān)鍵時(shí)期［31］，在S4 時(shí)期，幾乎所有的VvCYP707As 都下調(diào)了表達(dá)，然而‘甬早紅’的可溶性糖含量在該時(shí)期并未增加太多且與‘鄞紅’的可溶性糖差異極為顯著，可能是由于‘甬早紅’的VvCYP707As 普遍表達(dá)量高所導(dǎo)致的。研究表明，CYP707A 會影響ABA 受體PYL 的表達(dá)［7］，將兩個(gè)品種中表達(dá)差異顯著的Vitvi07g01751 瞬時(shí)過表達(dá)后，葡萄的糖度積累減慢，同時(shí)也極大程度影響了VvPYL4 的表達(dá)。推測‘甬早紅’的早熟是由于在S3 時(shí)期Vitvi07g01751 的高表達(dá)，造成了PYL 的上升，當(dāng)VvCYP707As 下調(diào)表達(dá)時(shí)，ABA 得到積累，受體的增加導(dǎo)致植株能更好地對ABA 做出變化，從而造成葡萄早熟的現(xiàn)象。然而時(shí)間有限，本文尚未對Vitvi07g01751 的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)化做出研究。

4 結(jié)論

CYP707A 基因家族成員相對保守，但在進(jìn)化中可能發(fā)生了功能分化。通過對比‘鄞紅’和‘甬早紅’的CYP707As 在果實(shí)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，Vitvi07g01751 在兩個(gè)品種中差異表達(dá)，將其瞬時(shí)表達(dá)后能極大程度影響VvPYL4 的表達(dá)，并減少糖的積累；在成熟過程中發(fā)揮著重大作用并影響葡萄果實(shí)品質(zhì)，這對后續(xù)葡萄的成熟基因挖掘和性狀改良具有一定的意義。