水稻維生素B1 合成相關(guān)基因OsTHIC 的功能研究

張超 王子瑞 孫亞麗 毛馨晨 唐家琪 于恒秀

（江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點實驗室 植物功能基因組學(xué)教育部重點實驗室 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

維生素B1又名硫胺素，是人體必需的微量元素之一。維生素B1有助于促進(jìn)人體神經(jīng)健康、改善情緒、增強(qiáng)心臟和減少胃灼熱［1-2］。同時，維生素 B1也是一種抗氧化劑［3］。當(dāng)維生素B1攝入量不足時，往往會出現(xiàn)微量營養(yǎng)素缺乏癥。若嚴(yán)重缺乏維生素B1，則會干擾中樞神經(jīng)和循環(huán)系統(tǒng)，并導(dǎo)致“腳氣病”［4-6］。

維生素B1在植物的生長發(fā)育、非生物和生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用［7］。維生素B1缺乏會導(dǎo)致植物新陳代謝速率減慢，呼吸作用減弱，光合作用下降，蔗糖和氨基酸殘基的累積量增高［8］。在玉米維生素B1合成缺陷的突變體中，新生葉的數(shù)量和花序的形成都會受到影響［9］。維生素B1能夠觸發(fā)植物的防御系統(tǒng)［10］。當(dāng)病原體侵染植物時補(bǔ)施維生素B1，植物會大量且迅速地積累致病相關(guān)蛋白（pathogenesis related protein,PR）的mRNA，使植物抵抗病原體的能力增強(qiáng)［11］。此外，維生素B1處理會增加擬南芥對丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性、水稻對紋枯病及白葉枯病的抗性以及黃瓜對白粉病的抗性［12］。當(dāng)植物遭受非生物脅迫（例如滲透壓、鹽和氧化應(yīng)激脅迫）以及暴露于冷、熱和強(qiáng)光條件下時，維生素 B1含量會增加，且維生素B1生物合成途徑關(guān)鍵酶的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平也會增加［13-15］。對向日葵根部外源施加維生素B1發(fā)現(xiàn)，其葉綠素含量、相對含水量、可溶性糖和維生素 B1含量均升高，K+含量升高，Na+、Ca2+和 Cl-含量降低，葉片水勢降低［16］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)植物對非生物脅迫所誘導(dǎo)損傷的耐受度與維生素 B1的含量呈正相關(guān)性［17］。

在植物體內(nèi)，維生素 B1主要以硫胺素（thiamin）、硫胺素單磷酸（thiamin monophosphate,TMP）及硫胺素焦磷酸（thiamin pyrophosphate,TPP）三種形式存在。硫胺素焦磷酸作為主要活性物質(zhì)在細(xì)胞代謝途徑中起到輔酶的作用。植物中維生素B1的生物合成途徑在擬南芥中已有較深入研究［7,18］。維生素B1主要由嘧啶環(huán)（4-氨基-5-羥甲基嘧啶）和噻唑環(huán)（4-甲基-5-β-羥乙基噻唑）兩部分組成。嘧啶部分的生物合成是通過嘧啶合成酶（HMP-P synthase,THIC）催化底物5-氨基咪唑核糖核苷酸（5-aminoimidazole ribonucleotide,AIR）合成4-氨基-2-甲基-5-羥甲基嘧啶單磷酸（4-amino-2-methyl-5-hydroxymethylpyrimidine monophosphate,HMP-P）。HMP-P 在硫胺素磷酸合成酶（thiamine phosphate synthase,TH1）的催化下形成4-氨基-2-甲基-5-羥甲基嘧啶焦磷酸（4-amino-2-methyl-5-hydroxymethylpyrimidine diphosphate,HMP-PP）。噻唑部分的生物合成是通過噻唑合成酶（HEP-T synthase,THI1）催化底物甘氨酸（Glycine,Gly）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）和硫化物基團(tuán)形成腺苷二磷酸-5-（β-乙基）-4-甲基噻唑-2-羧酸（adenylated thiazole,ADT）。ADT 隨后形成4-氨基-2-甲基-5-羥甲基嘧啶磷酸（4-amino-2-methyl-5-hydroxymethylpyrimidine phosphate,HET-P）。硫胺素從頭合成的兩個前體HET-P 和HMP-PP 在硫胺素磷酸合成酶（thiamine phosphate synthase,TH1）的催化下連接在一起形成TMP。TMP 在原核生物中可以直接轉(zhuǎn)化為TPP［19］，但在擬南芥中，TMP 首先被TMP 磷酸酶（TMP phosphatase,TH2）脫磷酸為硫胺素［18,20］。然后硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)溶膠，被細(xì)胞質(zhì)中的兩種硫胺素焦磷酸激酶（thiamine pyrophosphokinase,TPK1 和TPK2）焦磷酸化成TPP［21-22］。

擬南芥THIC 基因編碼一種鐵硫簇蛋白，該基因突變導(dǎo)致擬南芥黃化并在子葉期之前死亡。擬南芥thic 突變體維生素B1含量僅為野生型的30%，外施維生素B1可以恢復(fù)thic 的突變表型［23-24］。水稻作為最重要的糧食作物之一，其維生素B1合成途徑尚未完全解析；水稻THIC 基因在水稻生長發(fā)育過程中的作用以及其是否調(diào)控維生素B1合成仍不清楚。本研究從一個水稻葉色突變體克隆了OsTHIC 基因，并對其功能進(jìn)行解析，為明確水稻維生素B1生物合成途徑及生物強(qiáng)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 wll1 來自本實驗室EMS 誘變突變體庫，背景為粳稻品種日本晴。日本晴作為對照組。水稻材料種植于揚(yáng)州大學(xué)水稻試驗田和光照培養(yǎng)箱。試驗田播種時間為每年5 月中旬。光照培養(yǎng)箱光周期設(shè)定為14 h 光照/10 h 黑暗，培養(yǎng)溫度設(shè)定為28℃，相對濕度設(shè)定為70%。外源施加維生素B1，以100 μmol/L 的維生素B1溶液噴施水稻苗，每2 d 噴施一次，持續(xù)噴施20 d，自然光溫培養(yǎng)。

1.1.2 菌株及載體 本研究所用菌株主要有根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105（用于侵染水稻愈傷組織），大腸桿菌菌株DH5α（用于載體的克隆）；所用載體包括亞細(xì)胞定位載體 pJIT163-GFP，為本實驗室保存；CRISPR/Cas9 載體pYLCRISPR/Cas9-MH（用于基因編輯）。

1.1.3 主要試劑 常規(guī)分子克隆限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶，10×Ligation buffer 購自TaKaRa 公司（用于基因編輯載體及亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建）；高保真DNA 聚合酶KOD-plus 采購于TOYOBO，普通DNA 聚合酶購自北京天根生化（用于基因型鑒定及亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建所涉及的PCR 反應(yīng)）；總RNA提取試劑TRIzol、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScript III）以及熒光定量試劑盒SYBR Green 均為 Invitogen公司產(chǎn)品（用于基因相對表達(dá)量測定）；引物序列合成和DNA 測序由上海天霖和浙江尚亞公司完成；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒為易思得公司產(chǎn)品；維生素B1含量檢測試劑盒購于上海酶聯(lián)生物；植株代謝組檢測由上海拜譜公司完成。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量測定 測定方法主要參照已有文獻(xiàn)報道，并做小幅改動［25］。取野生型和突變體葉片組織并去除葉片中脈，分別稱取 0.1 g，剪成 1 mm左右大小，放置于15 mL 離心管中，加入10 mL 丙酮、乙醇等比混合溶液，在30-40℃的黑暗環(huán)境下，避免光照，浸泡12 h 左右，直到組織徹底脫色為止。用丙酮和乙醇等比例的混合液作對照，利用分光光度計檢測樣品在663 nm、645 nm、470 nm 波長處的吸光值，3 次生物學(xué)重復(fù)。光合色素的濃度通過下列公式進(jìn)行計算：

Chla（mg/g）=（12.72A663-2.69A645）×V/（1000 W）

Chlb（mg/g）=（22.90A645-4.68A663）×V/（1000 W）

Car（mg/g）=（1000A470×V/W-3.27 Chla-104 Chlb）/198

其中Chla、Chlb、和Car 分別代表葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素，A663、A645、A470分別為相應(yīng)波長的吸光值，V 為提取液體積（mL），W 為所取葉片鮮重（g）。

1.2.2 Mutmap+從 M3 某分離群體中隨機(jī)選取野生型和突變體各18 株，送諾禾致源生物信息有限公司進(jìn)行混池重測序，利用測序數(shù)據(jù)分別計算野生型池和突變體池中所有突變位點的突變指數(shù)［26］。

1.2.3 CRISPR/Cas9 選擇基因編輯的靶序列并合成寡核苷酸序列。通過PCR 方法將靶序列與U6a 啟動子及gRNA 連接。采用邊酶切邊連接的方法，將所得DNA 片段與pYLCRISPR/Cas9-MH 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α 感受態(tài)。菌液PCR 陽性克隆送公司進(jìn)行測序。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷組織，經(jīng)篩選、分化、生根等步驟獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)潮霉素抗性基因檢測及目的基因的基因型檢測，獲得敲除突變體。

1.2.4 維生素B1含量測定 采用上海酶聯(lián)生物公司試劑盒測定水稻葉片維生素B1含量。其原理為維生素B1在堿性條件下還原鐵氰化鉀生成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍(lán)，在704 nm 有特征吸收峰。按操作說明對樣品進(jìn)行研磨、提取及測定。利用吸光值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算維生素B1含量。每組樣品6 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 RT-qPCR 比較野生型與wll1 相關(guān)基因表達(dá)量時，取對應(yīng)材料幼苗提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實時定量PCR 儀及各基因特異性引物對基因進(jìn)行實時定量。在比較外施維生素B1對基因表達(dá)量影響時，對野生型植株進(jìn)行了外源維生素B1噴施處理，并在處理4 h 后取樣進(jìn)行RT-qPCR 分析。未噴施處理的野生型作為對照。所有RT-qPCR 均以Ubiquitin作為內(nèi)參。RT-qPCR 所用引物見表1。

表1 RT-qPCR 所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in RT-qPCR

1.2.6 非靶向代謝組分析 取四葉期水稻幼苗的心葉，液氮速凍。冷凍寄送至上海拜譜生物科技有限公司進(jìn)行代謝組檢測及數(shù)據(jù)分析。取每個樣品40 mg，加入鋼珠，再加300 μL 預(yù)冷的甲醇-水溶液（體積分?jǐn)?shù)4∶1），于組織破碎儀中勻漿破碎。加入700 μL 預(yù)冷的甲醇-水溶液（體積分?jǐn)?shù)4∶1），冰浴中超聲20 min，-20℃靜置1 h，4℃ 16 000×g 離心20 min，取上清，上清在高速真空濃縮離心機(jī)揮干。質(zhì)譜檢測時加50 μL 甲醇-水溶液（體積分?jǐn)?shù)1∶1）復(fù)溶，20 000×g 4℃離心15 min，取上清進(jìn)樣測定。采用超高效液相色譜系統(tǒng) SHIMADZU-LC30（UHPLC），使用 ACQUITY UPLCR HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）（Waters,Milford,MA,USA）色譜柱進(jìn)行樣品分離，再用QE Plus 質(zhì)譜儀（Thermo Scientific）進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過對質(zhì)控樣本（quality control,QC）和檢測樣本進(jìn)行預(yù)處理即包括缺失值過濾、模擬（missing value recoding）、數(shù)據(jù)歸一化（normalization）、QC 驗證和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。以正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型。以單變量統(tǒng)計分析篩選出的差異代謝物。差異代謝物的篩選主要參考VIP、FC 和P-value 三個參數(shù)，VIP（variable importance in the projection）是指第一主成分的變量投影重要度，VIP 值表示代謝物對分組的貢獻(xiàn)；FC 表示倍數(shù)變化，即每一代謝物在對照組所有生物中重復(fù)定量值的平均值之比；P-value 是通過t 檢驗計算得到，表示差異顯著性水平。以VIP score ＞ 1.0，F(xiàn)C ＞1.5 或FC＜1/1.5，且P-value＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異代謝物［27］。

2 結(jié)果

2.1 突變體表型鑒定

wll1 在四葉期之前與野生型相比無明顯差異（圖1-A）。從第四葉開始，wll1 出現(xiàn)心葉基部白化表型（圖1-B）。隨著幼苗生長，白化表型向葉片頂部擴(kuò)展，并蔓延到其他葉片，最終幼苗在萌發(fā)后 4 周左右死亡。在植株四葉期測定野生型和wll1 第三、四片葉的光合色素含量。結(jié)果表明，野生型與wll1 第三片葉光合色素含量無顯著差異（圖1-C）。在第四葉片中，wll1 的葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量與野生型相比都顯著下降（圖1-D）。這表明wll1 中光合色素的代謝過程存在異常。

圖1 wll1 表型及光合色素測定Fig.1 Phenotypic characterization and photosynthesis pigment measurement of wll1

2.2 通過Mutmap+分離候選突變位點

雜合突變體材料自交后，其后代群體中可以分為差異明顯的正常綠葉表型植株和心葉白化表型植株2 種類型，經(jīng)卡方（χ2）檢驗，這兩種表型植株的分離比（正常葉∶心葉白化）符合孟德爾經(jīng)典遺傳分離比 3∶1（127∶46，χ2=0.156,P＞0.05），這說明心葉白化表型受單個隱性基因控制。

我們采用Mutmap+技術(shù)分離候選突變位點。高通量測序在表型池及非表型池共得到23 538 個SNP（single nucleotide polymorphisms）及3 695 個Indel（insertion/deletion），并計算得到所有突變位點的突變指數(shù)。突變指數(shù)是指某突變位點測到的突變次數(shù)占該位點測到的總次數(shù)的比值?；谶z傳學(xué)原理，我們設(shè)定了如下突變位點篩選參數(shù)：（1）表型池混池單株表型準(zhǔn)確，因此引起突變表型的位點在混池單株中全部發(fā)生突變，突變指數(shù)應(yīng)為1。（2）非表型池為野生型單株（引起突變表型的位點均未發(fā)生突變，突變指數(shù)為0）及雜合突變單株（引起突變表型的位點在同源染色體中的一條染色體發(fā)生突變，理論突變指數(shù)為0.5）的混合，因此突變指數(shù)小于0.5。以該參數(shù)篩選過后，得到15 個SNP 位點，均位于水稻第3 號染色體24.8-27.5 Mb 的物理區(qū)間內(nèi)（表2）。

表2 候選突變位點Table 2 Candidate mutation sites in wll1

15 個突變位點中，4 個位點位于基因外顯子區(qū)，4 個位點位于基因內(nèi)含子區(qū)，1 個位點位于啟動子區(qū)，6 個位點位于基因間區(qū)。突變位于外顯子區(qū)的4 個基因中，LOC_Os03g46590 編碼轉(zhuǎn)座子蛋白，在各水稻組織中均不表達(dá)。LOC_Os03g47610 編碼硫胺素合成蛋白THIC。LOC_Os03g47740 編碼同源結(jié)構(gòu)域蛋白，在水稻抗病響應(yīng)中起正調(diào)控作用。LOC_Os03g48140 編碼肌球蛋白。有文獻(xiàn)報道，擬南芥中LOC_Os03g47610 的同源基因THIC 突變導(dǎo)致褪綠表型及生長停滯，因此將該基因作為候選基因，并命名為OsTHIC。為了驗證Mutmap+定位結(jié)果，隨機(jī)選取分離家系的20 株單株進(jìn)行一代測序驗證。突變表型單株在OsTHIC 的突變位點處均為純合突變，非突變表型單株為野生型序列及雜合突變。

OsTHIC 包含7 個外顯子，有較長的3'非編碼區(qū)（untranslated region,UTR）（圖2-A）。開放閱讀框為1 920 bp，編碼蛋白含639 個氨基酸。wll1 中的突變導(dǎo)致OsTHIC 第355 位的谷氨酸替換為賴氨酸。蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，OsTHIC 在植物和細(xì)菌中存在同源蛋白，在真菌和動物中無同源蛋白。前人報道動物不能從頭合成維生素B1，且真菌維生素B1中嘧啶環(huán)的合成采用不同的生化途徑，這與蛋白比對結(jié)果相一致。多重序列比對表明OsTHIC 的同源蛋白均包含一個ThiC_Rad_SAM 結(jié)構(gòu)域。wll1 中突變的Glu355位于該結(jié)構(gòu)域，并且在不同物種中是保守的。

2.3 OsTHIC基因功能驗證

為了進(jìn)一步驗證OsTHIC 功能，利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在野生型中敲除該基因。選取的靶序列位于OsTHIC 第二個外顯子（圖2-A）。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)基因型鑒定，得到了敲除突變體OsTHICCr。OsTHIC-Cr 發(fā)生單堿基的插入，導(dǎo)致蛋白翻譯移碼（圖2-B）。OsTHIC-Cr 幼苗在4 葉期出現(xiàn)心葉白化表型。白化部位逐漸擴(kuò)大到整個幼苗并最終導(dǎo)致幼苗死亡（圖2-C）。OsTHIC-Cr 表型與wll1 一致，表明wll1 的突變表型的確是由OsTHIC 突變所致。

2.4 OsTHIC表達(dá)模式及OsTHIC亞細(xì)胞定位模式分析

為了分析 OsTHIC 基因的組織表達(dá)模式，提取野生型日本晴萌發(fā)后7 d 的幼苗和萌發(fā)后50 d 的根、莖、葉、穗，以及不同發(fā)育時期種子中的 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA，對其進(jìn)行RT-qPCR 分析。結(jié)果顯示，OsTHIC 基因在水稻幼苗、根、莖、葉、穗和種子中都有表達(dá)，葉片中的表達(dá)量最高。OsTHIC表達(dá)量隨著種子的發(fā)育進(jìn)程而降低（圖3-A）。

圖3 OsTHIC 表達(dá)模式及OsTHIC 亞細(xì)胞定位模式Fig.3 Expression pattern of OsTHIC and subcellular localization of OsTHIC

為了確定 OsTHIC 的亞細(xì)胞定位模式，將OsTHIC 的編碼區(qū)構(gòu)建到pJIT163-GFP 載體上，使OsTHIC 的編碼區(qū)與GFP 報告基因融合表達(dá)。以pJIT163-GFP 空載轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體作為陰性對照，將載體轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，OsTHIC-GFP 與葉綠體自發(fā)熒光共定位，說明OsTHIC 蛋白定位于葉綠體中（圖3-B）。

2.5 OsTHIC突變導(dǎo)致維生素B1含量降低

OsTHIC 注釋為硫胺素生物合成蛋白，在四葉期檢測了野生型、wll1 及OsTHIC-Cr 第四片葉的維生素B1含量。結(jié)果顯示，與野生型相比，wll1 及OsTHIC-Cr 中的維生素B1含量與野生型相比顯著降低（圖4-A）。從三葉期開始對野生型和wll1 植株進(jìn)行了外源維生素B1（100 μmol/L）噴施處理。結(jié)果顯示，wll1 在外源維生素B1噴施處理后不再表現(xiàn)白化致死表型，植株可以正常生長發(fā)育（圖4-B）。這表明wll1 的突變表型是由維生素B1缺乏導(dǎo)致的。

圖4 OsTHIC 突變體維生素B1 含量及外施維生素B1 表型Fig.4 Vitamin B1 content and phenotype after exogenous vitamin B1 treatment of OsTHIC mutant

2.6 OsTHIC突變及外施維生素B1均影響維生素B1合成相關(guān)基因表達(dá)

為了探究OsTHIC 突變對水稻維生素B1合成途徑的影響，利用RT-qPCR 比較野生型與wll1中維生素B1合成相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，OsTHIC、OsTHI1、OsTH1、OsPALE1、OsTPK1 及OsTPK3 在wll1 中的表達(dá)量與野生型相比存在顯著差異。OsTPK2 的表達(dá)量在野生型與wll1 中無顯著差異（圖5-A）。利用RT-qPCR 探究外施維生素B1對維生素B1合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，外施維生素B1顯著降低OsTHIC、OsTHI1、OsTH1、OsPALE1、OsTPK1、OsTPK2 及OsTPK3 的表達(dá)量（圖5-B）。這表明OsTHIC 突變及外施維生素B1均影響維生素B1合成相關(guān)基因表達(dá)。

圖5 OsTHIC 突變及外施維生素B1 對維生素B1 合成相關(guān)基因表達(dá)量影響Fig.5 Influences on expressions of vitamin B1 biosynthesis genes by mutation of OsTHIC and exogenous vitamin B1 treatment

2.7 OsTHIC突變影響水稻代謝過程

維生素B1以輔酶的形式參與多個重要的細(xì)胞代謝過程。為了探究wll1 中維生素B1含量降低對水稻代謝過程的影響，采用LC-MS 對野生型及wll1進(jìn)行非靶向代謝組檢測。主成分分析（principal component analysis,PCA）表明，野生型與wll1 樣本顯著分離，且生物學(xué)重復(fù)間相互聚類，表明野生型與wll1 間代謝過程差異較大（圖6-A）。比較野生型與wll1 代謝組數(shù)據(jù)，共篩選出415 種有差異的代謝物，其中上調(diào)的代謝物有206 種，下調(diào)的代謝物有209 種（圖6-B）。

圖6 野生型與wll1 非靶向代謝組分析Fig.6 Analysis of untargeted metabolomics of wild type and wll1

將得到的差異代謝物進(jìn)行 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）注釋，并對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析。結(jié)果表明野生型與wll1的差異代謝物主要富集在以下過程：氨基酸的生物合成，氨?；?tRNA 的生物合成，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，輔因子的生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，D-氨基酸代謝等過程（圖6-C）。表明維生素B1可能是通過影響這些代謝途徑來參與水稻生長發(fā)育調(diào)控。

3 討論

與植物和微生物不同，人類和其他動物不能從頭合成維生素B1，必須從飲食中獲取。水稻是我國最重要的糧食作物之一，而稻米的出精過程（去除種皮和胚）會丟失多至90%的維生素B1［28］。這使得稻米僅能提供人體所需維生素B1的10%［29］。長期以稻米為單一主食，容易導(dǎo)致人體維生素B1缺乏，造成“隱形饑餓”［30-31］。因此，解析水稻維生素B1的生物合成途徑，并在此基礎(chǔ)上對水稻維生素B1含量進(jìn)行生物強(qiáng)化具有重要意義。本研究從一個水稻白化致死突變體wll1 克隆到維生素B1合成相關(guān)基因OsTHIC，并對基因功能開展研究。

wll1 從四葉期表現(xiàn)心片白化，隨后白化部位逐漸擴(kuò)大并導(dǎo)致幼苗死亡。該表型與擬南芥thic 突變體表型相似類［23-24］。擬南芥thic 突變體表現(xiàn)黃化表型，并在子葉期之前死亡。擬南芥thic 突變體中維生素B1含量僅為野生型的30%。持續(xù)外源施加維生素B1可以使擬南芥thic 突變體存活。與擬南芥相類似，wll1 中維生素B1含量與野生型相比顯著降低，外源補(bǔ)施維生素B1可挽救wll1 的致死表型，使之進(jìn)行正常的生長發(fā)育。這表明，水稻OsTHIC 與擬南芥THIC 基因均參與維生素B1的代謝過程，具有保守的生物學(xué)功能。與擬南芥thic 萌發(fā)即白化不同，wll1 與OsTHIC 的敲除突變體（OsTHIC-Cr）均在四葉期出現(xiàn)心葉白化表型。推測wll1 種子中儲存的維生素B1可供給幼苗的早期發(fā)育。種子儲存的維生素B1隨幼苗發(fā)育逐漸消耗，而又沒有新合成的維生素B1，在四葉期表現(xiàn)出了發(fā)育缺陷表型。

有研究表明，水稻維生素B1合成途徑中OsTH1基因的功能缺失同樣導(dǎo)致幼苗在四葉期出現(xiàn)心葉白化表型，與OsTHIC 的突變表型類似［32］。維生素B1多以輔酶的形式參與代謝調(diào)控。三羧酸循環(huán)中，維生素B1作為丙酮酸脫氫酶和酮戊二酸脫氫酶的輔酶參與能量代謝過程。在磷酸戊糖途徑和卡爾文循環(huán)中作為轉(zhuǎn)酮酶的輔酶［8］。因此，影響維生素B1代謝的基因發(fā)生突變，會對細(xì)胞代謝物含量產(chǎn)生影響。非靶向代謝組測序表明，wll1 與野生型相比，差異表達(dá)的代謝物主要富集在氨基酸的生物合成、氨?；?tRNA 的生物合成及ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等過程。擬南芥中研究表明，THIC 突變導(dǎo)致部分氨基酸含量升高，包括丙氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸及色氨酸等。此外，三羧酸循環(huán)中的蘋果酸含量在thic中含量升高，而延胡索酸的含量顯著降低［23］。水稻中OsTH1 突變導(dǎo)致氨基酸和核苷酸含量升高，糖類與脂肪酸的含量降低。研究者認(rèn)為脂肪酸生物合成的缺陷影響了葉綠體膜結(jié)構(gòu)的形成與維持，造成OsTH1 突變后產(chǎn)生葉片褪綠表型［32］。

擬南芥中研究表明，THIC 基因的表達(dá)受“核糖開關(guān)”（riboswitches）的調(diào)控［33］?！昂颂情_關(guān)”是最初在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種RNA 元件，其通過與小分子代謝物結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控［34-35］?；蛐蛄斜葘Πl(fā)現(xiàn)，擬南芥THIC 基因的3'-UTR 含有“核糖開關(guān)”序列，且可與TPP 進(jìn)行結(jié)合［36］。晶體結(jié)構(gòu)分析表明，擬南芥THIC 基因的“核糖開關(guān)”通過兩個平行螺旋間的保守殘基識別TPP［37］。外源施加維生素B1可降低擬南芥THIC基因的表達(dá)水平［23］。水稻中OsTHIC 基因的3'-UTR區(qū)同樣具有“核糖開關(guān)”序列，表明OsTHIC 的表達(dá)可能同樣受到“核糖開關(guān)”的調(diào)控［36］。外源施加維生素B1可降低OsTHIC 基因的表達(dá)量，而wll1中OsTHIC 基因的表達(dá)量顯著高于野生型，這表明，OsTHIC 的表達(dá)受到維生素B1含量的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。水稻基因注釋信息顯示，OsTHIC 基因在3'-UTR 至少含有7 種可變剪接，表明可能存在更為復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控方式（rice genome annotation project）。對OsTHIC 的“核糖開關(guān)”序列進(jìn)行編輯和修飾，解除維生素B1對OsTHIC 表達(dá)量的抑制作用，可作為OsTHIC 表達(dá)量及水稻維生素B1含量調(diào)控的手段。驗證提高OsTHIC 及維生素B1合成通路的其他基因的表達(dá)量能否增加稻米中的維生素B1含量是下一步工作的的重點。

4 結(jié)論

OsTHIC 通過調(diào)控維生素B1含量，參與氨基酸合成等代謝過程，在水稻生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。