SARS-CoV-2 Omicron 變異株多重微滴式數(shù)字 PCR 定量方法的建立及應(yīng)用

鄭巧 林華 徐浩 安微 薛昌華 張婧 韓國全

（1.成都海關(guān)技術(shù)中心，成都 610000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，雅安 625014；3.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，深圳 518045）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 號(hào)（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新冠疫情對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成巨大威脅，截至2023 年5 月6 日，全球共計(jì)報(bào)告了7.6 億例確診病例，超過600 萬人因此喪失生命。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）基于當(dāng)前疫情流行趨勢和人群免疫情況下調(diào)新冠疫情全球風(fēng)險(xiǎn)級別，宣告新冠疫情不再構(gòu)成“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”，但根據(jù)病毒的發(fā)展趨勢來看，短時(shí)間內(nèi)不能徹底消失，仍然存在毒株變異和感染傳播的風(fēng)險(xiǎn)。SARS-CoV-2 是冠狀病毒科的一種單鏈 RNA 包膜病毒，直徑約60-140 nm，基因組全長約30 kb［1-2］。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要包括開放讀碼框架（open reading frame，ORF）1a 和 ORF1b 基因，結(jié)構(gòu)蛋白主要通過核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、包膜蛋白（envelope protein，E）、膜蛋白（membrane protein，M）和刺突蛋白（spike protein，S）維持病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，促進(jìn)病毒遺傳物質(zhì)侵入宿主細(xì)胞干擾正常生命等活動(dòng)［3］。SARS-CoV-2 可以跨越物種屏障感染人類和動(dòng)物（果子貍、單峰駱駝、穿山甲、蝙蝠）等，Chan 等［4-5］對 SARS-CoV-2 的鑒定和特征進(jìn)行分析，研究表明，SARS-CoV-2 在全基因組水平上與蝙蝠冠狀病毒有96%的相同性，被認(rèn)為是攜帶新冠病毒的天然宿主。SARS-CoV-2 具有靈活的基因重組和快速適應(yīng)突變能力，已不斷進(jìn)化演變出新的關(guān)注變異株（包括 Alpha、Beta、Gamma、Delta和 Omicron）［6-10］，因此在 SARS-CoV-2 的核酸檢測中，對病原毒株類型的鑒定具有更高要求。

Omicron 變異株成為全球流行優(yōu)勢毒株［11］，據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心發(fā)布《全國新型冠狀病毒感染疫情情況》顯示，2022 年9 月26 日-2023年4 月13 日全國報(bào)送的40 122 例本土病例 SARSCoV-2 基因組有效序列均為 Omicron 變異株。該變異株攜帶大量突變，僅在 S 蛋白末端的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）上就存在15 個(gè)突變位點(diǎn)，RBD 與人體細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受體發(fā)生特異性相互作用，病毒能夠逃避免疫保護(hù)屏障，使Omicron 變異株更具傳播性和感染能力［12-13］，Omicron 變異株感染人數(shù)多但較早期致病力明顯下降，感染癥狀已逐漸演化為一種常見的呼吸道傳染病。目前，市面上 SARS-CoV-2 核酸檢測試劑引物和探針靶標(biāo)大多針對于 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因設(shè)計(jì)，不能滿足 Omicron 變異株檢測需求。根據(jù)SARS-CoV-2 各變異株之間 S 基因的序列差異，開發(fā)可以快速高效鑒定 Omicron 突變株的檢測方法，在全球范圍內(nèi)對這一新變異株的監(jiān)測至關(guān)重要。

微滴式數(shù)字 PCR 技術(shù)在熒光定量 PCR 技術(shù)（quantitative real-time PCR，qPCR）的基礎(chǔ)上將核酸的定量檢測由相對定量提高到絕對定量［14］，是分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域最為重大創(chuàng)新之一。在 ddPCR中，通過微滴化處理將待檢模板和反應(yīng)混合物稀釋分散成2 萬多個(gè)油包水的細(xì)小微滴，每個(gè)微滴只含有1 個(gè)或0 個(gè)待檢核酸分子，微反應(yīng)體系擴(kuò)增完成后，系統(tǒng)采集并分析單個(gè)微滴的熒光信號(hào)，結(jié)合泊松分布定律計(jì)算稀釋至單分子水平的核酸分子量［15］，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線就可推算出目標(biāo)分子的原始拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜背景下對微量核酸樣本的絕對定量檢測［16］。楊朔鵬［17］建立的三重 ddPCR 方法用于檢測生物與環(huán)境樣本中 SARS-CoV-2，與RT-qPCR相比，該方法用于檢測低病毒載量的樣本有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，有效降低了假陰性檢出率。Zhou等［18］開發(fā)的一種 RT-ddPCR 檢測方法，用于同時(shí)檢測 SARS-CoV-2 和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV），測試結(jié)果顯示靈敏度分別比 RT-PCR 高4 倍和10 倍，該測試還表現(xiàn)出良好的特異性、可重復(fù)性和再現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)。

本研究通過對新冠病毒原型株及其他變異株的基因序列比對分析，設(shè)計(jì)專門針對于 Omicron 變異株 S 基因的特異性引物探針，采用定量分析檢測方法——ddPCR 技術(shù)，建立SARS-CoV-2 Omicron 變異株四重微滴式數(shù)字 PCR 檢測方法，實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)定量檢測 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因的同時(shí)，還能對 Omicron 變異株進(jìn)行鑒別的雙重功能，以期為微量 RNA 病毒檢測以及病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供重要技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 RNA 核酸提取純化試劑盒（磁珠法）（Vazyme，中國）；蛋白酶 K（Vazyme，中國）；2× dPCR Probe Master Mix Pius（Sniper，中國）；5×One Step RT-PCR Probe Super Mix（Sniper，中國）；Enzyme Mix（Sniper，中國）；新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）（上海之江，中國）；EcoR I 酶（New England Biolabs，美國）；TB Green?Premix Ex TaqTMII（TaKaRa Dalian，日本）。

1.1.2 儀器與設(shè)備 DQ24 數(shù)字 PCR 一體機(jī)（Sniper，中國）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；諾唯贊全自動(dòng)核酸提取儀（Vazyme，中國）；NanoDrop ONEC 超微量核酸蛋白儀（Thermo Scientific，美國）；移液器（Eppendor，德國）；漩渦振蕩混勻儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；高速冷凍離心機(jī) XR3（Thermo Fisher Scientific，美國）；生物安全柜（Thermo Scientific，美國）；超低溫冰箱（海爾，中國）；高壓滅菌鍋（致微，中國）；全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)（Ultra-Violet Products，美國）。

1.1.3 樣本來源 臨床鼻咽拭子核酸樣本由口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，新型冠狀病毒變異株標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Beta 株 GBW09318、Gamma 株GBW09317、Delta 株 GBW09316、Omicron 株 NIMRM5235）購買于中國計(jì)量科學(xué)研究院，豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、甲型流感病毒、諾如病毒、輪狀病毒、腺病毒陽性質(zhì)?；蛞呙缬沙啥己ｊP(guān)技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 在 NCBI 和 GISAID 數(shù)據(jù)庫（https://www.gisaid.org/）中下載新型冠狀病毒原型株及變異株基因組參考序列，通過 DNAMAN 軟件進(jìn)行基因序列比對，篩選高度保守的目的片段，利用 primer 6.0和 oligo 7 軟件對選取的病毒片段進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，引物探針放入 NCBI 中 Primer-Blast 驗(yàn)證特異性，選擇最佳引物探針交予生工生物工程（上海）有限公司合成，序列詳細(xì)信息見表1。

表1 引物與探針序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA 提取 非滅活型臨床鼻咽拭子樣品先置于56℃水浴鍋內(nèi)滅活30 min，含胍鹽類滅活型樣品可直接進(jìn)行核酸提取，在生物安全柜內(nèi)將樣品管渦旋振蕩20 s，靜置≥30 s 后，吸取200 μL 樣品于裂解板中進(jìn)行病毒裂解分離，提取詳細(xì)步驟按照核酸提取純化試劑盒說明書進(jìn)行，最終，將100 μL TE 緩沖液洗脫的核酸產(chǎn)物置于-20℃保存。

1.2.2 陽性質(zhì)粒制備與稀釋 委托生工生物工程（上海）有限公司合成1.1.4 所述的4 對引物目的片段序列，目的基因擴(kuò)增后將片段回收純化，插入 PUC57載體與目的片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，隨后PCR 擴(kuò)增并驗(yàn)證測序結(jié)果。將制備成功的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用超微量核酸蛋白儀測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)公式質(zhì)粒拷貝數(shù)=（M×6.02×1023×10-9）/（n×660），其中M 為質(zhì)粒DNA 濃度，n 為重組質(zhì)粒長度=T 載體長度+目的片段長度，計(jì)算得到陽性質(zhì)粒拷貝數(shù)，并將陽性質(zhì)粒10 倍稀釋為101-1011，稀釋后的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品置于-80℃冰箱凍存。

1.2.3 單重ddPCR 的擴(kuò)增 為驗(yàn)證 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株 S基因的引物探針是否能對目的基因進(jìn)行有效擴(kuò)增，分別以 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 S 基因陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為檢測模板進(jìn)行單重 ddPCR 擴(kuò)增，RNase Free ddH2O 為陰性對照，按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系和設(shè)定擴(kuò)增程序。反應(yīng)體系為: 5×One Step RT-PCR Probe Super Mix（cy5.5）3.5 μL，Enzyme Mix 1 μL，EcoR I 酶1 μL，引物探針濃度均為10 μmol/L 的上下游引物各1 μL，探針0.5 μL，模板 3 μL，ddH2O 補(bǔ)足22 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 25℃ 5 min；50℃ 25 min；95℃酶激活5 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。

1.2.4 多重ddPCR 的建立與優(yōu)化 在單重 ddPCR 的基礎(chǔ)上建立多重 ddPCR 方法，對4 種目標(biāo)基因引物探針的配比濃度和使用量進(jìn)行選擇，引物探針濃度均為20 μmol/L 的上下游引物選取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL，探針選取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL，選用稀釋為同一濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別作為多重 ddPCR 反應(yīng)擴(kuò)增模板，同時(shí)設(shè)置陰性對照和無模板對照，每次實(shí)驗(yàn)控制單一變量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，結(jié)合陰陽性微滴間熒光差值和檢測拷貝數(shù)篩選最佳引物探針組合，確保擴(kuò)增后的一維散點(diǎn)圖陰陽性能明顯區(qū)分且中間彌散微滴數(shù)較少，最終確定多重 ddPCR 反應(yīng)體系。

1.2.5 多重ddPCR 特異性 為確定 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株S 基因引物探針特異性是否良好，將豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、甲型流感病毒、諾如病毒、腺病毒、輪狀病毒、新型冠狀病毒變異株（Beta株、Gamma 株、Delta 株）作為擴(kuò)增模板，同一濃度的新冠質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，RNase Free ddH2O為陰性對照，采用1.2.4 節(jié)中確定好的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，對建立的四重 ddPCR 方法進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.6 多重ddPCR 靈敏度及穩(wěn)定性 將制備的4 種陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合后，進(jìn)行連續(xù)10 倍梯度稀釋，以10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11不同梯度稀釋樣本進(jìn)行多重 ddPCR 擴(kuò)增，直至檢測到陽性微滴數(shù)的最低拷貝數(shù)即為該方法的檢測下限，并對每個(gè)濃度重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)以確定該方法的穩(wěn)定性。

1.2.7 臨床鼻咽拭子樣本的檢測 口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供鼻咽拭子樣本 20 份，按照核酸提取純化試劑盒（磁珠法）提取病毒RNA，隨后用本研究建立的多重 ddPCR 方法和新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）對臨床鼻咽拭子樣本的進(jìn)行檢測，分別得到數(shù)字 PCR 定量拷貝數(shù)結(jié)果和熒光定量 PCR 結(jié)果，比較分析陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增與鑒定結(jié)果

以陽性質(zhì)粒為擴(kuò)增模板，4 對引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，用2%瓊脂糖凝膠對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，凝膠圖像分析系統(tǒng)顯示見圖1。結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶清晰明亮，無拖帶彌散等情況，所得擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小相符。測序結(jié)果在 NCBI 上比對，與SARS-CoV-2 同源性達(dá)到98%以上，證實(shí)設(shè)計(jì)引物對目的片段有效擴(kuò)增。

圖1 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因、S 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of SARS-CoV-2 ORF1ab,N,E,and S gene amplification products

2.2 單重ddPCR擴(kuò)增結(jié)果

在單重 ddPCR 擴(kuò)增中，SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株 S 基因顯現(xiàn)良好的擴(kuò)增效果，各目的基因陰陽性微滴區(qū)分明顯，陰性對照未出現(xiàn)陽性微滴信號(hào)，在58℃退火溫度下，4 對引物均能與模板有效結(jié)合，適合構(gòu)建多重 ddPCR 檢測體系，擴(kuò)增信息見圖2。

圖2 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因、S 基因單重ddPCR 檢測一維圖Fig.2 One-dimensional map of SARS-CoV-2 ORF1ab gene,N gene,E gene and S gene by single ddPCR

2.3 多重ddPCR的建立與優(yōu)化

通過優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，4 組引物探針之間干擾程度較低，擴(kuò)增的陰陽性微滴能有效分開且中間彌散微滴數(shù)較少，可構(gòu)建四重 ddPCR 方法對新冠病毒進(jìn)行定量分析。最終確定的多重 ddPCR反應(yīng)體系為：5×One Step RT-PCR Probe Super Mix（cy5.5）3.5 μL，Enzyme Mix 1 μL，EcoR I 酶 1 μL，20 μmol/L 的ORF1ab 基因上下游引物各0.4 μL，探針0.6 μL，N 基因上下游引物各0.5 μL，探針0.6 μL，E 基因上下游引物各0.5 μL，探針0.7 μL，S 基因上下游引物各0.6 μL，探針0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足22 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 25℃ 5 min；50℃ 25 min；95℃酶激活5 min；95℃ 15 s，58℃ 30 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。已成功建立的 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron 變異株 S 基因四重微滴式定量ddPCR 檢測方法可用于后續(xù)臨床樣品的檢測。

2.4 多重ddPCR特異性驗(yàn)證

通過多重 ddPCR 反應(yīng)擴(kuò)增，4 種目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均有效檢出陽性微滴數(shù)。同時(shí)，選擇豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、甲型流感病毒、諾如病毒、腺病毒、輪狀病毒、新型冠狀病毒變異株（Beta 株、Gamma 株、Delta 株）作為特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證均未發(fā)生非特異性擴(kuò)增，表明4 組引物探針特異性良好，未與其他感染癥狀與新冠病毒類似的病原體發(fā)生交叉反應(yīng)，四重 ddPCR 特異性擴(kuò)增圖見圖3。

圖3 四重ddPCR 特異性檢測一維圖Fig.3 One-dimensional map of specificity detected by quadruple ddPCR

2.5 多重ddPCR靈敏度與穩(wěn)定性

將4 種陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合后，進(jìn)行連續(xù)10 倍梯度稀釋，選取6 個(gè)梯度樣本并重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，以確定反應(yīng)體系的靈敏度和穩(wěn)定性。四重 ddPCR 靈敏度與重復(fù)性檢測結(jié)果如表2。由表2 可知，四重微滴式數(shù)字 PCR 檢測SARS-CoV-2 的絕對定量檢測下限分別為ORF1ab 基因0.59 copies/μL，RSD 為20.89%；N 基因0.68 copies/μL，RSD 為25.07%；E基 因1.44 copies/μL，RSD 為12.08%；S 基 因1.03 copies/μL，RSD 為20.20%。四重微滴數(shù)字 PCR 靈敏度檢測一維圖見圖4。

圖4 四重 ddPCR 靈敏度檢測一維圖Fig.4 One-dimensional map of sensitivity detected by quadruple ddPCR

以體系中10-6-10-105 個(gè)連續(xù)稀釋的陽性質(zhì)粒DNA 模板稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，與之對應(yīng) ddPCR 檢測拷貝數(shù)結(jié)果的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制線性關(guān)系擬合曲線。如圖5 所示，SARS-CoV-2 ORF1ab 基因 R2為0.999，N 基因 R2為0.999，S 基因 R2為0.988，ORF1ab 基因 R2為0.997，結(jié)果呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)建立的多重 ddPCR 方法適用于對微量新冠病毒的拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量檢測。

2.6 臨床鼻咽拭子樣本的檢測結(jié)果

使用核酸提取純化試劑盒（磁珠法）提取20 份樣本的病毒核酸（每份樣本200 μL），四重微滴式數(shù)字 PCR 方法檢測結(jié)果見表3，新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒（熒光定量 PCR 法）檢測結(jié)果見表4，試劑盒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)只需滿足在同一份標(biāo)本中 SARS-CoV-2 的 ORF1ab 基因?yàn)殛栃?，N 基因及E 基因任一靶標(biāo)為陽性即為該樣本 SARS-CoV-2陽性。檢測結(jié)果顯示，在20 份臨床樣本中，ddPCR方法檢出陽性樣本16 個(gè)，陽性率達(dá)80%（16/20），經(jīng)熒光定量 PCR 方法進(jìn)行復(fù)檢驗(yàn)證結(jié)果一致，表明該多重 ddPCR 方法能夠在臨床中應(yīng)用。

表3 20 份樣本多重微滴數(shù)字 PCR 拷貝數(shù)檢測結(jié)果Table 3 Copy number detection results for 20 samples by quadruple ddPCR

表4 20 份樣本熒光定量 PCR 檢測結(jié)果Table 4 Results of 20 samples via fluorescence quantitative PCR

3 討論

自2021 年11 月9 日 Omicron 變異株于南非首次檢出后［19］，短時(shí)間內(nèi)成為主要優(yōu)勢毒株并在全世界范圍內(nèi)高度傳播。Omicron 變異株 S 基因存在大量突變位點(diǎn)，這些突變位點(diǎn)增加了受體結(jié)合域和 ACE2的結(jié)合親和力，從而增強(qiáng)了病毒適應(yīng)性和感染性［20］。此外，某些突變和重組對病毒生物學(xué)特性造成影響，有研究表明，Omicron 攜帶的突變位點(diǎn)有助于逃避多種單克隆抗體的中和作用，對自然和疫苗誘導(dǎo)的免疫效果產(chǎn)生影響，免疫保護(hù)作用下降導(dǎo)致突破性感染和再次感染［21］，在當(dāng)前 SARS-CoV-2 還未完全消失的情況下，需密切重點(diǎn)監(jiān)測和防范 Omicron 變異株。

國內(nèi)外開展了大量關(guān)于 SARS-CoV-2 檢測方法的研究，其中實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 被認(rèn)為是診斷新冠病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Chu 等［22］針對 SARS-CoV-2 ORF1ab 基因和 N 基因建立了一種一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR 對感染患者呼吸道樣本進(jìn)行檢測。Corman 等［23］建立了 SARS-CoV-2 三重 qPCR 檢測方法，其中 E基因顯現(xiàn)較高靈敏度測試結(jié)果（5.2 copies/reaction），但該方法在臨床樣本中的陽性檢出率僅為28.2%。此外，膠體金免疫層析基于抗原抗體特異性結(jié)合和顯色原理使檢測結(jié)果可視化，15 min 內(nèi)可通過診斷試紙條顯色判斷陰陽性，但已有研究表明該方法敏感性低于 qPCR 檢測結(jié)果［24］。SARS-CoV-2 存在潛伏期，患者感染初期常因病毒載量過低出現(xiàn)“假陰性”問題，而本研究建立的多重 ddPCR 方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線便可實(shí)現(xiàn)對患者樣本病毒拷貝數(shù)的精確定量，反應(yīng)體系在精密注射泵的作用下勻速從微型注射器流出，單個(gè)液滴體積穩(wěn)定控制在0.8 nL，不受反應(yīng)液成分、溫度、氣壓等因素影響，通過多通道熒光成像檢測分析，一次性完成液滴掃描拍照，無信號(hào)降解，更具高效、便捷、穩(wěn)定等特點(diǎn)，第一時(shí)間準(zhǔn)確診斷，對患者得到及時(shí)救治至關(guān)重要。

ddPCR 作為新興的檢測技術(shù)，仍存在一些固有局限與不足。待測反應(yīng)體系配置好之后需開蓋放入ddPCR 儀器中，微液滴在開放式空間內(nèi)吸取和轉(zhuǎn)移，非專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作不當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致樣本揮發(fā)和溢出，造成氣溶膠污染，為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)檢測環(huán)境應(yīng)確保較好的負(fù)壓條件，儀器運(yùn)行結(jié)束后及時(shí)處理廢棄耗材，保持區(qū)域清潔減少污染。ddPCR檢測結(jié)果區(qū)間有效動(dòng)態(tài)范圍小，表現(xiàn)出低于 qPCR的飽和極限，過低的上樣量將降低 ddPCR 的靈敏度，過高的上樣量將導(dǎo)致單液滴內(nèi)樣本拷貝數(shù)過多，超過檢測上限。Cremonesi 等［25］研究指出 DNA 樣本必須在反應(yīng)混合物中稀釋到 ＜20 000 拷貝值，才可量化參考樣本中密集分布的陽性微滴。因此，可先使用標(biāo)準(zhǔn)樣品在 qPCR 系統(tǒng)中摸索出合適模板 DNA 濃度，確保 ddPCR 定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于本實(shí)驗(yàn)建立的多重 ddPCR 方法還可從 SARS-CoV-2 Omicron 變異株新的進(jìn)化分支細(xì)化研究，及時(shí)監(jiān)測并精確定量Omicron 亞變體，以應(yīng)對未來 SARS-CoV-2 未知變種。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)新冠病毒原型株及變異株基因組參考序列，設(shè)計(jì)特異性引物探針，通過優(yōu)化多重ddPCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，最終建立了SARSCoV-2 ORF1ab 基因、N 基因、E 基因以及 Omicron變異株 S 基因四重微滴數(shù)式數(shù)字 PCR 定量檢測方法，其中 ORF1ab 基因的絕對定量檢測下限為0.59 copies/μL，N 基因的絕對定量檢測下限為0.68 copies/μL，E 基因的絕對定量檢測下限為1.44 copies/μL，S 基因的絕對定量檢測下限為1.03 copies/μL。該檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，用于臨床樣本中能夠?qū)ξ⒘啃鹿诓《緶?zhǔn)確快速檢出，有利于維護(hù)公共衛(wèi)生安全。

致謝

特別感謝四川國際旅行衛(wèi)生保健中心（口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）對本實(shí)驗(yàn)的支持和幫助。