利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建Pmepa1 基因敲除的TCMK1 小鼠腎小管上皮細(xì)胞系

張宏民 龍?chǎng)?勞筱清 陳雯妍 商雪梅 王洪連 王麗 粟宏偉沈宏萍 沈宏春，

（1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000）

數(shù)據(jù)表示，慢性腎病已影響全球近10%的人，是低、中等收入國(guó)家發(fā)病率和死亡率的主要原因之一［1］。腎纖維化是所有慢性腎臟疾病及終末期腎病的共同病理特征［2］，主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積累，導(dǎo)致正常腎小管和間質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞［3-4］。隨著腎纖維化的進(jìn)行性發(fā)展，慢性腎病患者的腎功能逐漸惡化最終導(dǎo)致腎衰竭［5］。因此，研究腎纖維化的機(jī)制對(duì)尋找積極有效的治療策略以改善或延緩腎纖維化的進(jìn)展尤為重要［6］。

前列腺跨膜蛋白雄激素誘導(dǎo)1（prostate transmembrane protein androgen induced 1，Pmepa1）又稱TMEPA1、STAG1、ERG1.2 或N4wbp4，是一種I 型跨膜蛋白，可與HECT 型E3 泛素連接酶相互作用［7］。研究表明，Pmepa1 參與p53 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，并與多種實(shí)體腫瘤（包括腎癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和宮頸癌）的發(fā)生有關(guān)［8-9］。Pmepa1 作為多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)器，有助于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)［10］。最近發(fā)現(xiàn)Pmepa1 通過(guò)負(fù)反饋回路抑制雄激素和TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)［11］，并且Pmepa1 在TGF-βI 型受體信號(hào)傳導(dǎo)的控制中發(fā)揮作用［12］。

CRISPR/Cas9 是一種RNA 引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶，通過(guò)核苷酸堿基配對(duì)特異性切割DNA 序列的基因編輯技術(shù)［13］。由于其高效、易用和準(zhǔn)確性，CRISPR/Cas9 在基因編輯研究中被廣泛應(yīng)用，并在人類疾病治療方面表現(xiàn)出巨大潛力［14］。CRISPR/Cas9 技術(shù)于2013 年首次用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞（人和小鼠細(xì)胞），此后被廣泛應(yīng)用于生物研究、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等各種研究領(lǐng)域［15-16］。

本研究將基于CRISPR/Cas9 技術(shù)將Pmepa1 敲除載體轉(zhuǎn)染至TCMK1 小鼠腎小管上皮細(xì)胞，聯(lián)用流式細(xì)胞分選技術(shù)和PCR 擴(kuò)增片段測(cè)序，篩選建立Pmepa1 敲除TCMK1 細(xì)胞系，并在敲除Pmepa1 的TCMK1 細(xì)胞中驗(yàn)證TGF-β1 刺激下細(xì)胞纖維化的改變，為研究Pmepa1 在腎纖維化的功能提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠源腎小管上皮細(xì)胞系TCMK1 細(xì)胞源于西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室；pX333骨架質(zhì)粒購(gòu)于Addgene 公司；用于sgRNA 克隆及Real-Time PCR 引物的寡脫氧核苷酸鏈由上海生工生物有限公司合成；質(zhì)粒提取試劑盒；膠回收試劑盒和細(xì)胞基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自于北京天根生物有限公司；Bbs I 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、PNK 磷酸化酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、胎牛血清（Gibco）購(gòu)自于Thermo Scientific 公司；Real-Time PCR 所用SYBR 預(yù)混擴(kuò)增試劑購(gòu)自于天津諾唯贊生物有限公司；RNA 提取試劑Trizol 購(gòu)自于生工生物工程（上海）；DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自于上海培源生物科技有限公司；Pmepa1 抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、GAPDH 抗體（Thermo Fisher Scientific，MA5-15738），SMAD2 抗體、SMAD3 抗體、P-SMAD2 抗體、P-SMAD3 抗體（Cell Signaling TECHNOLOGY）。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 設(shè)計(jì)與寡核苷酸鏈的合成 根據(jù)CRISPR/Cas9 工作原理，在CRISPR 在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站輸入鼠源Pmepa1 編碼基因序列（https://zlab.bio/guide-design-resources），搜尋符合“G（N）19NGG”模式的sgRNA 靶點(diǎn)序列（其中NGG 為PAM 序列），并保證所選sgRNA 序列符合以下要求：1）所選靶點(diǎn)位于外顯子區(qū)段；2）靶點(diǎn)所選外顯子為所有已發(fā)現(xiàn)Pmepa1 選擇性間接體所共有。最終選擇靶點(diǎn)位于第2 號(hào)外顯子，序列為：5'-GCCGACACAGCCAGGCCAGGAGG-3'（最后3 個(gè)堿基為PAM 序列）。為了將sgRNA 序列克隆至pX333 載體Bbs I 酶切位點(diǎn)，在sgRNA 序列兩端添加黏性末端，并合成以下寡脫氧核苷酸序列：sgRNA-F:5'-CACCGCCGACACAGCCAGGCCAGG-3'；sgRNA-R:5'-AAACCCTGGCCTG GCTGTGTCGGC-3'。

1.2.2 pX333-Pmepa1 質(zhì)粒的 構(gòu)建將sgRNA-F 和sgRNA-R 單鏈寡脫氧核苷酸在T4 連接酶緩沖液中按照5℃/min 的速率從95℃梯度退火至25℃，從而形成雙鏈寡聚脫氧核苷酸，再加入PNK 磷酸化酶于37℃孵育30 min 進(jìn)行雙鏈寡脫氧核苷酸5'末端磷酸化修飾。然后通過(guò)T4 DNA 連接酶將雙鏈寡聚脫氧核苷酸克隆至Bbs I 內(nèi)切酶線性化的pX333 載體，重組載體轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)菌中，于含有氨芐青霉素抗性瓊脂固體培養(yǎng)基中篩選。第2 天，挑取瓊脂平板中數(shù)個(gè)單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)、質(zhì)粒提取和測(cè)序，對(duì)于測(cè)序正確的質(zhì)粒（pX333-Pmepa1）進(jìn)行大量擴(kuò)增，制備質(zhì)粒用于下游細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3 TCMK1 細(xì)胞培養(yǎng)與pX333-Pmepa1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 TCMK1 細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2和100%濕度。待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至90%匯合度時(shí)消化接種至6 孔板，接種量1×106個(gè)/孔，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合度時(shí)，采用陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺（PEI）轉(zhuǎn)染500 ng pX333-Pmepa1，轉(zhuǎn)染后6 h 更換新鮮培養(yǎng)基，并在48 h 后于熒光顯微鏡下觀察載體熒光蛋白標(biāo)簽mCherry 的表達(dá)，以判斷轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.4 流式分選、單克隆細(xì)胞擴(kuò)增和測(cè)序鑒定Pmepa1 敲除細(xì)胞 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞采用流式分選技術(shù)篩選出轉(zhuǎn)染成功的TCMK1 細(xì)胞，按照0.5 個(gè)細(xì)胞/孔的接種比例接種于96 孔板進(jìn)行5-10 d 培養(yǎng)，每5 d 更換新鮮培養(yǎng)基。將96 孔板中成功生長(zhǎng)的單克隆細(xì)胞消化，并分別接種于24 孔板，待24 孔板的細(xì)胞長(zhǎng)滿，繼續(xù)消化并分別接種于6 孔板，待6孔板細(xì)胞長(zhǎng)滿，將其消化下來(lái)，一半細(xì)胞凍存，一半細(xì)胞采用基因組提取試劑盒提取DNA，采用PCR擴(kuò)增Pmepa1 敲除位點(diǎn)附近基因組片段，PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）進(jìn)行測(cè)序分析。若Pmepa1靶點(diǎn)出現(xiàn)序列突變，且兩個(gè)等位基因均出現(xiàn)移碼突變（缺失或插入堿基數(shù)非3 的倍數(shù)）時(shí)，即判定為潛在的表達(dá)缺失突變。PCR 鑒定引物為：F,5'-GTTCGTGCAAATCGTGGTCA-3';R,5'-TCATACCTG ACACTTCCTGC-3'。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)Pmepa1 敲除細(xì)胞Pmepa1 蛋白的表達(dá) 正常TCMK1 細(xì)胞和上述Pmepa1 突變TCMK1 細(xì)胞分別種于6 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗，加入100 μL RIPA 裂解液，靜置5 min，充分裂解，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，超聲后冰上靜置30 min，離心取上清，測(cè)定蛋白濃度。向10%的聚丙烯酰胺凝膠中加入各組蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。印跡膜采用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后，采用含兔抗Pmepa1 抗體（1∶1 000 稀釋于2.5% BSA 中）4℃孵育過(guò)夜。第2 天，除去一抗，TBST 溶液清洗3 次，每次5 min，加入稀釋后的HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，采用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光底物曝光并上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 PCR、Western blot 檢測(cè)Pmepa1 敲除后TGF-β1誘導(dǎo)的R-Smad 活化和纖維化表型 將Pmepa1 敲除細(xì)胞和正常的TCMK1 細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度至90%，更換0.5%胎牛血清培養(yǎng)基，饑餓6 h，加入5 ng/mL TGF-β1 刺激 24 h，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR 檢測(cè) Collagen I 和 Fibronectin 的表達(dá)。擴(kuò)增引物為 Collagen I: F,5'-ATCCAACGAGATCGAGCTCA-3';R,5'-AAGGGAGCCACATCGATGAT-3'，F(xiàn)ibronectin: F,5'-ATGTGGA CCCCTCCTGATAGT -3';R,5'-GCCCAGTGATTTCAGCAAAGG -3'。內(nèi)參引物為GAPDH: F,5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG -3';R,5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG -3'。將Pmepa1 敲除細(xì)胞和正常的TCMK1 細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度至90%，更換含0.5% 胎牛血清的培養(yǎng)基饑餓6 h，然后加入5 ng/mL TGF-β1 刺激30 min，提取細(xì)胞蛋白。如上采用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 的表 達(dá)，采用GAPDH 為內(nèi)參。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0 或GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD），兩組間比較采用Student’s t-test 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way，ANOVA），以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建靶向Pmepa1基因CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒

根據(jù)spCas9 G（N19）NGG 的序列識(shí)別原則，sgRNA 序列選擇在小鼠Pmepa1 基因組第2 個(gè)外顯子上（圖1-A），序列為5'-GCCGACACAGCCAGGCCAGG -3'，鄰近PAM 序列為5'-AGG -3'，該序列經(jīng)過(guò)NCBI BLAST 軟件比對(duì)分析，確證在小鼠基因組范圍內(nèi)不存在其他非靶向性位點(diǎn)。構(gòu)建好的載體（pX333-Pmepa1）經(jīng)測(cè)序顯示，sgRNA 成功克隆到pX333 載體gRNA 骨架序列5'端，U6 啟動(dòng)子完整驅(qū)動(dòng)gRNA 序列的表達(dá)以及CAG 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的spCas9 蛋白和mCherry 熒光示蹤蛋白同時(shí)表達(dá)，表明sgRNA 序列克隆成功（圖1-B）。

圖1 Pmepa1 sgRNA 靶向位置和質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果Fig.1 Pmepa1 sgRNA targeting location and plasmid construction results

2.2 Pmepa1敲除TCMK1細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定

將構(gòu)建好的pX333-Pmepa1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入TCMK1細(xì)胞48 h 后，如圖1-B 所示，可以觀察到轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞出現(xiàn)mCherry 熒光蛋白表達(dá)（圖1-C），流式細(xì)胞術(shù)顯示轉(zhuǎn)染效率約為17%（圖1-D）。進(jìn)一步，采用流式分選技術(shù)分析出轉(zhuǎn)染成功（mCherry 陽(yáng)性）的TCMK1 細(xì)胞，按照0.5 細(xì)胞/孔的比例稀釋接種于96 孔板中進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，最終獲得19 個(gè)細(xì)胞克隆。對(duì)這些細(xì)胞克隆基因組Pmepa1 位點(diǎn)Cas9 靶向位點(diǎn)序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最終16 個(gè)細(xì)胞克隆PCR 擴(kuò)增成功（圖2-A）。經(jīng)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，16 個(gè)細(xì)胞克隆中2 個(gè)克隆的Pmepa1 基因Cas9 靶向位點(diǎn)出現(xiàn)序列突變。且兩個(gè)突變克隆中序列突變?cè)赑mepa1 兩個(gè)等位基因位點(diǎn)上序列一致，均為純合突變。其中clone 4 插入突變1 個(gè)堿基，clone 16 缺失突變74 個(gè)堿基（圖2-B）。由于兩個(gè)突變細(xì)胞克隆缺失/插入堿基數(shù)不是3 的倍數(shù)，預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)開放式閱讀框移位，引起后續(xù)多肽序列的紊亂和/或蛋白翻譯提前終止，從而導(dǎo)致Pmepa1 蛋白序列和功能的缺失。進(jìn)一步，Western blot 分析發(fā)現(xiàn)，clone 4和16 Pmepa1 蛋白表達(dá)缺失（圖2-C）。這些結(jié)果提示，TCMK1 細(xì)胞克隆clone 4（KO-4）和16（KO-16）Pmepa1 基因敲除成功。

圖2 Pmepa1 基因敲除效果驗(yàn)證Fig.2 Validation of Pmepa1 gene knockout

2.3 Pmepa1敲除后TCMK1細(xì)胞中TGF-β信號(hào)的活化和纖維化

為了研究Pmepa1 敲除是否影響TCMK1 細(xì)胞TGF-β 信號(hào)的活性，我們采用RT-PCR 及Western blot 方法檢測(cè)了纖維化相關(guān)蛋白及Smad2/Smad3通路相關(guān)蛋白。RT-PCR 結(jié)果顯示，雖然TGF-β1均可以刺激正常和敲除（KO-4/16）TCMK1 細(xì)胞Fibronectin 和Collagen I 的表達(dá)，但Pmepa1 敲除細(xì)胞中Fibronectin 和Collagen I 表達(dá)水平顯著高于正常TCMK1 細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3-A）。同時(shí)，Western blot 結(jié)果顯示，TGF-β1 可以刺激TCMK1 細(xì)胞中Smad2/3 的活化（磷酸化），但敲除Pmepa1 細(xì)胞中（KO-4/16）TGF-β1 誘導(dǎo)的Smad2/3 磷酸化水平更高（圖3-B）。因此，PCR 及Western blot 結(jié)果表明，Pmepa1 的敲除促進(jìn)了TCMK1 細(xì)胞中TGF-β信號(hào)活化和纖維化。

圖3 RT-PCR 和Western blot 驗(yàn)證Pmepa1 敲除后TGF-β信號(hào)的活化和纖維化蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 RT-PCR and Western blot validation of TGF-β signaling activation and fibrotic protein expression after Pmepa1 knockdown

3 討論

CRISPR/Cas9 技術(shù)利用sgRNA 對(duì)基因組靶位點(diǎn)序列的識(shí)別引導(dǎo)Cas9 核酸酶進(jìn)行特異性DNA 剪切實(shí)現(xiàn)基因敲除［17］。本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)敲除TCMK1 細(xì)胞Pmepa1 基因，相比其他傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、周期快、高切割率、高精度的特點(diǎn)［18］。實(shí)驗(yàn)表明CRISPR/Cas9 技術(shù)在小鼠上建立基因敲除模型最快6-8 周，而且成功率較高［19］。陳漢宗等［20］成功利用CRISPR/Cas9 技術(shù)穩(wěn)定構(gòu)建了anxa6 基因敲除的Caco-2 細(xì)胞株。劉鐵柱等［21］建立了SNX11基因穩(wěn)定敲除的A549 細(xì)胞系。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于基因的篩選、動(dòng)物基因的敲入等實(shí)驗(yàn)以及各遺傳疾病的治療中［22］。

Pmepa1 又稱TMEPA1，在TMEPA1 家族分子中發(fā)現(xiàn)，C18ORF1 與TMEPA1 一樣具有兩個(gè)PY基序和一個(gè)Smad 相互作用基序（SIM）結(jié)構(gòu)域，C18ORF1 可以阻斷TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)，但不能阻斷骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)［23］。C18ORF1 通過(guò)SIM與Smad2/3 結(jié)合，并與Smad2/3 的受體激活，以減弱Smad2/3 向TGF-I 型受體的募集，其對(duì)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的抑制功能與TMEPAI 方式相似［24］。但C18ORF1 與TMEPAI 相反的是，TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)沒(méi)有誘導(dǎo)C18ORF1，而當(dāng)細(xì)胞受到高水平的TGF-β刺激時(shí)，TMEPAI 可能會(huì)幫助C18ORF1 以協(xié)調(diào)的方式 抑制TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)［25］。Pmepa1 表達(dá) 在細(xì)胞膜和亞細(xì)胞細(xì)胞器中，其表達(dá)可以被雄激素、TGF-β、EGF 和Wnt 等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路誘導(dǎo)［26］。Pmepa1 基因首次發(fā)現(xiàn)于前列腺癌癥中，在前列腺癌癥中具有雙重作用。Pmepa1 可以促進(jìn)雄激素受體陽(yáng)性前列腺癌細(xì)胞增生，并且通過(guò)抑制Smad3/4 來(lái)減少雄激素受體陰性前列腺癌細(xì)胞的增生［27］。此外，Pmepa1 可以促進(jìn)其他癌癥的發(fā)展，如肺癌、卵巢癌、胃癌等［28］。實(shí)驗(yàn)證明，Pmepa1 在卵巢癌癥中的抗癌作用可以促進(jìn)凋亡［29］。這些差異可能由組織的特異性引起的。Pmepa1 的不同作用可以通過(guò)Pmepa1和TGF-β 的關(guān)系來(lái)解釋。Pmepa1 是由TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)的，是TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)的直接靶基因。但同時(shí)，它抑制典型的Smad 信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)證明Pmepa1 通過(guò)抑制Smad2 和Smad3 的磷酸化以對(duì)抗TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)［30］。TGF-β1 是組織修復(fù)、炎癥和纖維化的主要調(diào)節(jié)因子，也有大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明腎纖維化與TGF-β 有關(guān)［31］?？紤]到Pmepa1 和TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)系，我們?yōu)榇蓑?yàn)證了Pmepa1 在TGF-β 信號(hào)活化的TCMK1 細(xì)胞中是否發(fā)揮抗纖維化的作用。

本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)聯(lián)合流式細(xì)胞分選，成功建立了2 株P(guān)mepa1 基因敲除TCMK1 細(xì)胞系，敲除細(xì)胞經(jīng)過(guò)Western blot 驗(yàn)證了Pmepa1 蛋白表達(dá)的缺失，單細(xì)胞克隆篩選成功率約10%。為明確Pmepa1 基因的敲除與TCMK1 細(xì)胞中TGF-β 信號(hào)的活化和纖維化的關(guān)系，通過(guò)RT-PCR及Western blot 兩種方法檢測(cè)了纖維化相關(guān)蛋白及Smad2/Smad3 通路相關(guān)蛋白，結(jié)果表明Pmepa1 的敲除促進(jìn)了TCMK1 細(xì)胞中TGF-β 信號(hào)活化和纖維化。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建了Pmepa1 敲除的TCMK1 細(xì)胞系，并且針對(duì)兩株敲除細(xì)胞系通過(guò)RT-PCR 及Western blot 兩種方法驗(yàn)證 了Pmepa1 敲除后TCMK1 細(xì)胞中TGF-β 信號(hào)的活化和纖維化，結(jié)果顯示Pmepa1 的敲除促進(jìn)了TCMK1 細(xì)胞中TGF-β 信號(hào)活化和纖維化。不僅為Pmepa1 蛋白在TCMK1 小鼠腎小管上皮細(xì)胞中的作用以及在腎纖維化中提供細(xì)胞模型，也為后續(xù)進(jìn)一步研究腎臟組織中Pmepa1 基因與腎臟疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。