基于流式細(xì)胞儀鑒定番石榴倍性方法的建立及應(yīng)用

邵雪花 李桂蘭 肖維強(qiáng) 賴多 莊慶禮 秦健

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，荊州 434000）

番石榴（Psidium guajava Linn.）別名芭樂、雞矢果等，系桃金娘科（Myrtaceae）番石榴屬（Psidium），原產(chǎn)于南美洲，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)［1］。番石榴果實(shí)芳香、甘甜，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值［2］。另外，長期以來民間用其葉做茶，對(duì)腹瀉、糖尿病、口腔潰瘍等均有一定的治療效果［3-5］。經(jīng)藥理研究證實(shí)，番石榴富含酚類、黃酮類、萜類、多糖等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、護(hù)肝、抗菌、抗糖尿病、抗炎和抗癌活性［1,6-8］。正因?yàn)榉竦氖秤煤退幱脙r(jià)值高，2019 年全球番石榴產(chǎn)量就已達(dá)5 585 萬t［9］。目前，我國福建、廣東、廣西等地均有大量栽培［10］，其總產(chǎn)量僅次于印度，排名世界第二［2］。然而，當(dāng)前我國番石榴主栽品種單一，品種資源匱乏，不利于我國的番石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此，選育出更多的番石榴新品種刻不容緩。

對(duì)于植物的育性研究和新品種選育工作而言，其染色體的倍性鑒定尤為重要［11］。流式細(xì)胞術(shù)是一種利用流式細(xì)胞儀快速多次參數(shù)分析流體中單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)［12］。近年來，流式細(xì)胞術(shù)因其操作技術(shù)簡單、用時(shí)短、效率高、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，被普遍用于檢測(cè)植物的基因組大小和染色體倍性，如馬鈴薯［13］、大豆［14］、菊芋［15］和棉花［16］等。目前，有關(guān)番石榴倍性的研究尚未見報(bào)道，嚴(yán)重限制了番石榴的倍性育種和雜交育種工作。本研究通過比較離心處理、樣本部位和保存方式等對(duì)番石榴倍性鑒定效果的影響，建立基于流式細(xì)胞術(shù)的番石榴倍性鑒定方法，并用該方法對(duì)33 種番石榴種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，旨為后續(xù)番石榴倍性鑒定以及推動(dòng)番石榴育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 33 份番石榴種質(zhì)資源的嫩葉、花瓣、芽均采自于廣東省農(nóng)科院果樹研究所優(yōu)稀水果研究室番石榴資源圃。

1.1.2 試劑及儀器設(shè)備 mGb 解離液購自南京博巧生物科技有限公司、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液購自北京索萊寶科技有限公司、BD FACSVerse 流式細(xì)胞儀購自上海土森視覺科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)方法的建立

1.2.1.1 樣本部位的選擇 分別取番石榴嫩葉、芽、花瓣，按照以下方法進(jìn)行處理，比較不同組織提取細(xì)胞核的含量。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

處理方法：取0.50-1.00 cm2待測(cè)樣本，置于培養(yǎng)皿中，加入1 mL 預(yù)冷的mGb 解離液，使待測(cè)樣品完全浸沒在解離液中。使用刀片垂直快速切碎樣品，此過程盡量將待測(cè)樣品浸沒于解離液中，靜置1 min 以獲取完整的細(xì)胞核。吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的混合溶液，用400 目濾膜將懸濁液過濾至流式管內(nèi)，再加入30 μL 預(yù)冷的PI 染料，混勻后4℃避光染色10 min。最后使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，以二倍體番石榴品種‘珍珠’細(xì)胞組織的DNA 含量作為參照，每次檢測(cè)收集約100 000 個(gè)細(xì)胞，以CV 值（DNA 含量峰值的變異系數(shù)）的大小作為評(píng)價(jià)流式測(cè)定結(jié)果的參數(shù)。用FlowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.1.2 離心方案的優(yōu)化 分別取0.50-1.00 cm2待測(cè)樣本，加入1 mL 預(yù)冷的mGb 解離液，快速切碎后用400 目濾膜將懸濁液過濾至1.50 mL 離心管中。4℃離心后去上清，保留200 μL 沉淀，分別加入預(yù)冷后的100 μL 解離液和30 μL PI 染料，混勻后4℃避光染色10 min，上機(jī)檢測(cè)。共設(shè)置4 個(gè)處理，分別 為：1 000 r/min 離 心5 min（L1），1 000 r/min 離心10 min（L2），2 000 r/min 離 心5 min（L3）和2 000 r/min 離心10 min（L4），以未離心組作為對(duì)照（CK）組。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.2.1.3 樣本保存方式的比較 按照1.2.1 的處理方法，選取新鮮樣本作為對(duì)照（CK）組，冷藏（4℃）和冷凍（-20℃、-40℃、-80℃）4 種保存方式（均保存7 d）的花瓣，比較不同溫度處理后花瓣的細(xì)胞核含量。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.2.2 番石榴種質(zhì)資源倍性鑒定 取33 份番石榴種質(zhì)資源的新鮮花瓣，采用建立的流式細(xì)胞術(shù)方法對(duì)其倍性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用FlowJo 軟件分析細(xì)胞流式數(shù)據(jù)。以CV 值（DNA 含量峰值的變異系數(shù)）的大小作為評(píng)價(jià)結(jié)果好壞的參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樣本檢測(cè)組織的確定

本文分別取番石榴的嫩葉、芽和花瓣進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（圖1）表明，花瓣作為檢測(cè)部位時(shí)收集到的細(xì)胞核數(shù)目最多，CV 值為1.96%，峰形效果最佳，噪音峰小且主峰明顯；嫩葉作為檢測(cè)部位時(shí)峰形效果次之，有噪音峰，碎片增多，CV 值為2.32%；芽作為檢測(cè)部位時(shí)可檢測(cè)到的細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，雜峰較多，噪音峰干擾大，主峰不清晰。綜上表明，番石榴的花瓣更適宜作為倍性檢測(cè)的材料。

圖1 番石榴不同組織流式圖Fig.1 Flow chart of different tissues of guava

2.2 離心方案的確定

以番石榴花瓣為材料，將獲得的細(xì)胞核懸浮液分別設(shè)置不同離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。番石榴花瓣的細(xì)胞核相對(duì)DNA 含量結(jié)果如圖2 所示，CK 組獲得的細(xì)胞核DNA 含量最多且染色均勻，相對(duì)熒光強(qiáng)度集中，噪音峰少，主峰明顯，CV 值為1.97%；而離心后則導(dǎo)致細(xì)胞核DNA 大量損失，收集到的細(xì)胞碎片較多，主峰周圍噪音增多，無法形成明顯的主峰；L1 和L3 組由于離心時(shí)間過短，細(xì)胞碎片沒有得到有效分離，CV 值低于其他處理組；L2 組1 000 r/min離心10 min，熒光強(qiáng)度較為集中，獲得的細(xì)胞數(shù)量較多，CV 值為1.96%，在離心處理組中表現(xiàn)最好；L4 組2 000 r/min 離心10 min 后收集的樣本細(xì)胞數(shù)量較少，峰值降低明顯。因此，在制備細(xì)胞核懸浮液時(shí)，過濾后無需離心，染色后直接上機(jī)測(cè)定效果最佳。

圖2 番石榴不同離心方式的比較Fig.2 Comparison of different centrifugation methods of guava

2.3 樣本保存方式的確定

取不經(jīng)低溫保存的新鮮番石榴花瓣作對(duì)照（CK）組，冷藏（4℃）和冷凍（-20℃、-40℃和-80℃）保存方式對(duì)番石榴花瓣各保存7 d 后進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（圖3）表明，CK 組的檢測(cè)效果最好，收集到的細(xì)胞核DNA 含量最高，CV 值為1.96%，背景碎片少，主峰明顯；冷藏和各級(jí)冷凍處理下，只有-80℃冷凍處理對(duì)樣本的破壞性最小，獲取的細(xì)胞核DNA 含量明顯高于其他組，CV 值為1.88%，主峰明顯，但與對(duì)照組相比有少量偏鋒；冷藏（4℃）處理后，主峰較好，噪音峰少，但細(xì)胞核DNA 含量較低，CV 值升高為2.04%；-20℃和-40℃冷凍處理后造成峰圖噪音峰明顯增多，雜峰較多，收集到的細(xì)胞核DNA含量較低。綜上可見，新鮮番石榴花瓣染色后直接上機(jī)測(cè)定效果最佳。

圖3 番石榴不同保存溫度流式圖Fig.3 Flow diagram of different storage temperatures of P.guajava

2.4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定番石榴倍性的方法

利用建立的流式細(xì)胞術(shù)分析方法，對(duì)33 份試驗(yàn)樣本進(jìn)行處理后上機(jī)檢測(cè)（圖4），其中縱坐標(biāo)軸代表測(cè)定細(xì)胞數(shù)的相對(duì)值，橫坐標(biāo)軸代表熒光的通道值，峰值的位置反應(yīng)的是測(cè)試樣品的倍性，若峰值在50 左右，判定該品種為二倍體，峰值在100 左右，判定該品種為四倍體，峰值在150 左右，則判定該品種為六倍體。

圖4 不同倍性番石榴花瓣的相對(duì)DNA 含量Fig.4 Relative DNA contents of P.guajava petals with different ploidy levels

2.5 番石榴種質(zhì)資源倍性鑒定

在本研究中，以已知的二倍體番石榴品種‘珍珠’做參照，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)33 種番石榴樹種資源進(jìn)行倍性鑒定，結(jié)果如表1 可得，變異系數(shù)CV 值（DNA含量峰值的變異系數(shù)）為1.68%-2.36%。其中，‘草莓’番石榴判斷為六倍體，其余32 份樣品（包括‘帝王’‘水蜜’‘金斗香’‘翡翠’‘紫果’等番石榴種質(zhì)資源）均為二倍體，倍性系數(shù)介于0.42-0.59，倍性估算值為1.68-2.36。

3 討論

倍性分析是研究遺傳進(jìn)化、開展倍性育種和雜交育種工作的基礎(chǔ)［11］。目前，流式細(xì)胞術(shù)因其制樣簡單、靈敏度高和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)已成為鑒定植物倍性的首選方法［17］。然而，對(duì)于不同植物而言，采用不同組織部位、離心漂洗方式、保存溫度等均會(huì)影響倍性鑒定的結(jié)果可靠性［18-19］。

根據(jù)其他植物材料已有的研究報(bào)道，植物材料選取不當(dāng)，會(huì)造成細(xì)胞核顆粒提取不足且雜質(zhì)較多，影響倍性檢測(cè)效果。例如，趙孟良等［15］比較菊芋塊莖、根、老葉和嫩葉的倍性檢測(cè)效果發(fā)現(xiàn)，嫩葉是其倍性鑒定的理想材料；王婭麗等［16］發(fā)現(xiàn)以棉花嫩葉作為檢測(cè)材料的倍性鑒定效果優(yōu)于老葉。本研究發(fā)現(xiàn)，花瓣作為檢測(cè)材料時(shí)熒光信號(hào)集中，受到的干擾最少，峰形效果最好；嫩葉作為測(cè)試材料時(shí)熒光信號(hào)較為集中，有少量干擾但不影響峰形判斷，效果次之；芽作為測(cè)試材料時(shí)熒光信號(hào)比較分散，主峰前后都有干擾增多，峰形效果差；故推薦番石榴花瓣作為其倍性鑒定的首選材料。

離心漂洗常被用于減少細(xì)胞核懸浮液的雜質(zhì)成分對(duì)結(jié)果的干擾，但因植物材料不同導(dǎo)致離心的轉(zhuǎn)速及時(shí)間存在差異。例如，張桂芳等［20］比較不同離心時(shí)間對(duì)鐵皮石斛倍性檢測(cè)效果的影響，認(rèn)為2 000 r/min 離心8 min 效果最佳；楊靜等［21］對(duì)桑樹的研究表明，不離心與離心漂洗1-2 次對(duì)其倍性檢測(cè)效果無差異。本研究中，離心處理后的番石榴細(xì)胞核懸浮液峰圖質(zhì)量差，原因可能是細(xì)胞核DNA 鏈斷裂，導(dǎo)致碎片增加和熒光信號(hào)分散，因此番石榴細(xì)胞核懸浮液直接經(jīng)400 目濾膜過濾后即可染色測(cè)定，無需離心，可顯著縮短樣品的制備時(shí)間，并提高其測(cè)定效率。

在收集野外番石榴資源，利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其染色體倍性時(shí)，從采集到實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的過程中，往往無法實(shí)現(xiàn)樣品即采即測(cè)，因此保存樣本以確保細(xì)胞懸浮液的有效制備對(duì)其倍性鑒定至關(guān)重要［21］。目前，對(duì)于部分無法在數(shù)日內(nèi)檢測(cè)的樣本，低溫保存是植物倍性鑒定樣本保存的最常用方式［21-22］。本研究結(jié)果表明，新鮮番石榴花瓣得到的細(xì)胞核懸浮液最好，其次為-80℃冷凍處理組，該處理對(duì)樣本的破壞性最小，獲取的細(xì)胞核DNA 含量明顯高于冷藏和其他冷凍處理組，且主峰明顯，效果較好。冷藏（4℃）處理后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核DNA 含量降低，而-20℃和-40℃保存，可能是因?yàn)槔鋬鲈斐煞窕ò杲M織中產(chǎn)生過多細(xì)胞碎片，雖不影響倍性鑒定正確性，但雜峰較多，效果不佳。

CV 值是判斷倍性檢測(cè)結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵指標(biāo)。Georgiev 等［23］認(rèn)為，流式細(xì)胞儀檢測(cè)的CV 值在9.00%以內(nèi)，其檢測(cè)結(jié)果就比較可靠。呂順等［17］也認(rèn)為，對(duì)于含有較多酚類物質(zhì)的植物，CV 值＜10.00%可達(dá)到理想結(jié)果。本研究采用優(yōu)化的流式細(xì)胞術(shù)對(duì)33 份番石榴種質(zhì)資源進(jìn)行倍性鑒定，測(cè)定CV 值低于2.36%，表明優(yōu)化的流式細(xì)胞術(shù)可以確保番石榴倍性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究建立了番石榴種質(zhì)資源流式細(xì)胞術(shù)鑒定其倍性的方法，該方法檢測(cè)條件為：選取番石榴新鮮花瓣或-80℃冷凍保存的花瓣，加入1 mL 的mGb裂解液中混合切碎，400 目濾膜過濾后加入30 μL PI 染色1 min 即可上機(jī)檢測(cè)。33 份番石榴種質(zhì)資源倍性整體變異系數(shù)為1.68%-2.36%，二倍體32 份，六倍體1 份。該體系的建立及番石榴種質(zhì)資源倍性的明確對(duì)下一步番石榴倍性育種和雜交育種奠定了基礎(chǔ)。