MDCK 細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)在流感疫苗研究與生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)展

靳莉武 張震宇 靳冬武 馬花 馬玉梅 喬自林 王家敏

（1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心 細(xì)胞基質(zhì)疫苗關(guān)鍵技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化教育部工程研究中心，蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，蘭州 730010；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；4.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730030；5.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州 730030）

流感，全稱為流行性感冒，是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，它通過(guò)空氣飛沫傳播，具有易變性和強(qiáng)傳染性，大多數(shù)人易感染。流感的發(fā)病率通常較高，歷史上已多次爆發(fā)全球性流行［1］。流感疫苗的接種被認(rèn)為是一種重要的公共衛(wèi)生措施，能夠顯著降低流感疾病對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的影響，它是預(yù)防流感、減少流感相關(guān)重癥和死亡的有效手段，可以減少疫情的傳播和流行范圍，從而降低社會(huì)的疾病負(fù)擔(dān)和醫(yī)療資源的壓力［2］。

自1945 年以來(lái)，基于雞胚培養(yǎng)的傳統(tǒng)流感疫苗一直發(fā)揮著重要的作用，該技術(shù)成熟，生產(chǎn)規(guī)模較大，是目前價(jià)格最為便宜的流感疫苗［3-4］。但是由于其疫苗工藝難以實(shí)現(xiàn)全面自動(dòng)化（圖1），且易受禽流感及其他家禽疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)影響而導(dǎo)致雞胚供應(yīng)不足，限制了疫苗的產(chǎn)量，存在極大的問題［5］；另外有研究結(jié)果表明，用于疫苗生產(chǎn)的雞胚適應(yīng)流感病毒株本身與世界衛(wèi)生組織推薦的原型株在抗原位點(diǎn)B［H156Q，G186V］和D［S219Y］上有3 個(gè)氨基酸突變，這些突變也可能導(dǎo)致疫苗的抗原性、免疫原性和效力發(fā)生顯著改變。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)流行病學(xué)和疫苗設(shè)計(jì)具有重要意義，提醒人們?cè)谝呙缟a(chǎn)過(guò)程中需要更加關(guān)注病毒株的適應(yīng)性突變，以提高疫苗的效果［6］。1995 年，WHO 建議使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)代替雞胚培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)流感疫苗，如MDCK 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞［7-8］、PER.C6 細(xì)胞［9］、EB66 細(xì)胞［10］等。其中MDCK 細(xì)胞的受體與人類細(xì)胞表面的受體更相似，與流感病毒的結(jié)合更為緊密。因此，人流感病毒在MDCK 細(xì)胞中不需要適應(yīng)細(xì)胞受體的變化，從而減少了突變的可能性，這也意味著在MDCK 細(xì)胞中培養(yǎng)的病毒更接近于原始病毒株，從而提高了疫苗的有效性［11］；而且相比其他細(xì)胞系，MDCK 細(xì)胞具有較好的細(xì)胞生長(zhǎng)特性和易于操作的優(yōu)勢(shì)，能夠產(chǎn)生更高的病毒滴度，是經(jīng)證實(shí)適用于生產(chǎn)流感病毒的細(xì)胞之一［12-13］。MDCK 細(xì)胞主要以貼壁形式培養(yǎng)，但這種方式存在細(xì)胞損傷、細(xì)胞密度低和病毒產(chǎn)量不穩(wěn)定等問題（圖2）。無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)解決了這些問題，使得MDCK 細(xì)胞能夠在懸浮狀態(tài)下進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)并提高病毒產(chǎn)量。

圖1 雞胚流感疫苗工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of chicken embryo influenza vaccine

圖2 細(xì)胞流感疫苗工藝流程圖Fig.2 Process flow diagram of cellular influenza vaccine

因此，建立能夠滿足流感病毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)的MDCK 全懸浮細(xì)胞系，成為制備安全、有效、質(zhì)量可控的流感疫苗的關(guān)鍵。

1 MDCK 細(xì)胞

MDCK 細(xì)胞英文全稱為Madin-Darby Canine Kidney Cells，為犬腎細(xì)胞，呈上皮樣，貼壁培養(yǎng)型連續(xù)傳代細(xì)胞。1958 年，由來(lái)自美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校海軍研究實(shí)驗(yàn)室的SH Madin 和NB Darby 建立，取材于健康Cocker Spaniel 犬的腎臟，原代培養(yǎng)時(shí)呈成纖維樣，經(jīng)過(guò)不斷的傳代純化，上皮樣細(xì)胞逐漸成優(yōu)勢(shì)群體［14］。1964 年，在培養(yǎng)至49 代時(shí)提交給美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），并被編號(hào)為Certified Cell Line 34（CCL-34）［15］。Gaush、Leighton 等對(duì)MDCK 細(xì)胞進(jìn)行了生長(zhǎng)特性、免疫學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)特性等一系列研究，表明該細(xì)胞形態(tài)一般較為規(guī)則，細(xì)胞較大，呈扁平狀，梭形或多邊形，其中央有扁圓形的細(xì)胞核，在平板上培養(yǎng)時(shí)會(huì)合成緊密連接蛋白形成單細(xì)胞層，具有接觸抑制的特性［16-18］。

研究表明，MDCK 細(xì)胞系在多種病毒的增殖和純化中得到了廣泛的應(yīng)用，包括呼腸孤病毒（reovirus）、犬細(xì)小病毒（adenovirus）、腺病毒（canine parvovirus，CPV）、貓粒細(xì)胞缺少癥病毒（feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV）及禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）等［19-21］，尤其是對(duì)于流感病毒感染表現(xiàn)出高效的感染性和快速的增殖能力［22］，被公認(rèn)為是最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一［23］。20 世紀(jì)90 年代中期被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦為第一批用于替代雞胚生產(chǎn)季節(jié)性流感疫苗的傳代細(xì)胞系之一［24］。

MDCK 細(xì)胞在傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法中存在多個(gè)問題，包括生長(zhǎng)速度緩慢、高度分化、易感染性低和穩(wěn)定性差等，此外它需要附著在培養(yǎng)基中的載體表面上生長(zhǎng)，容易受到基質(zhì)表面積的限制，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)［25］。另外，貼壁培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞需要添加動(dòng)物血清來(lái)提供細(xì)胞貼壁、增殖和維持生長(zhǎng)所需的生物因子和營(yíng)養(yǎng)成分。然而，動(dòng)物血清存在潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，可能攜帶外源微生物和病原體因子，同時(shí)也增加了工藝成本［26］。鑒于上述問題，尋找新的培養(yǎng)方法以改善MDCK 細(xì)胞的生長(zhǎng)和穩(wěn)定性，并替代動(dòng)物血清，是解決現(xiàn)有問題的重要方向（圖2）。這將為更有效、安全和經(jīng)濟(jì)的大規(guī)模生產(chǎn)流感疫苗提供可能性。

2 MDCK 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)馴化技術(shù)

在實(shí)際生產(chǎn)中，懸浮培養(yǎng)不受生長(zhǎng)表面基質(zhì)和面積的限制，無(wú)需貼壁和消化，易于擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模，降低了成本，可利用生物反應(yīng)器大規(guī)模、高效率生產(chǎn)生物制品，具有生產(chǎn)效率高、操作簡(jiǎn)單、質(zhì)量與生物安全易控制等優(yōu)點(diǎn)［12,27］。

在懸浮馴化過(guò)程中，研究人員采用先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)手段，通過(guò)逐步降低細(xì)胞對(duì)基質(zhì)附著的依賴性，逐漸讓MDCK 細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)和繁殖。這有助于減少細(xì)胞的機(jī)械損傷和減少細(xì)胞間的接觸，降低死亡率，并提高細(xì)胞的生理活性和生命周期。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，可以提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，以促進(jìn)MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)。此外，在懸浮馴化和篩選過(guò)程中，研究人員還需要仔細(xì)評(píng)估細(xì)胞株的穩(wěn)定性、遺傳特性和表達(dá)產(chǎn)物的一致性。只有經(jīng)過(guò)詳細(xì)的篩選和驗(yàn)證，才能選擇最合適的細(xì)胞株用于進(jìn)一步的研究和生產(chǎn)應(yīng)用。2002 年，Novartis 公司采用 ATCC的MDCK CCL-34 細(xì)胞株進(jìn)行馴化篩選，經(jīng)過(guò)數(shù)月得到了第一株懸浮細(xì)胞MDCK 33016-PF，可在無(wú)血清無(wú)蛋白條件下懸浮生長(zhǎng)［12］。另外，目前已馴化為全懸浮培養(yǎng)的MDCK 細(xì)胞株還有MDCK-SFM2、siat7eexpressing MDCK［28］、MDCKSUS2［29］等。

目前，針對(duì)MDCK 懸浮細(xì)胞的馴化方法主要包括以下幾種途徑：（1）在將MDCK 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為懸浮細(xì)胞之前，首先使其適應(yīng)于某種已知成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)直接法和間接法來(lái)實(shí)現(xiàn)。直接法是完全替換培養(yǎng)基的方法。具體而言，直接法馴化MDCK 細(xì)胞的方法是將傳統(tǒng)的血清含量較高的培養(yǎng)基逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)血清培養(yǎng)基。這一過(guò)程可以分步進(jìn)行，逐漸減少血清的配比，同時(shí)增加無(wú)血清培養(yǎng)基的配比（圖3）。通過(guò)這種方法，可以逐漸使MDCK 細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清條件下的培養(yǎng)。間接法馴化MDCK 細(xì)胞的方法是在馴化過(guò)程中，引入特定的生物因子和小分子化合物，以促進(jìn)細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件。這些生物因子和化合物可以模擬血清中存在的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞信號(hào)通路，并幫助MDCK 細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清環(huán)境。這些馴化方法的目的是降低或消除MDCK 細(xì)胞對(duì)血清的依賴性，并使其適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)條件。通過(guò)這種方式，可以滿足生物安全性要求，減少外源致病因子的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并降低生產(chǎn)成本?？傊?，MDCK 懸浮細(xì)胞的馴化方法主要包括直接法和間接法，在無(wú)血清培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以逐步減少對(duì)血清的依賴性，為進(jìn)一步的研究和生產(chǎn)提供更適用的細(xì)胞株。

圖3 MDCK 細(xì)胞直接法馴化流程Fig.3 Process of direct domestication of MDCK cells

（2）基因改造。有文獻(xiàn)表明，人類的Siat7e 全長(zhǎng)基因的表達(dá)與細(xì)胞的貼壁依賴性相關(guān)，Siat7e 基因編碼人的唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GalNAc V，該蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)從GM1b（單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂）合成GD1α（二唾液酸甘苷），相對(duì)于貼壁依賴性HeLa 細(xì)胞，非貼壁依賴性的HeLa 細(xì)胞表現(xiàn)出了較高水平的Siat7e 基因表達(dá)，而當(dāng)使用SiRNA 技術(shù)抑制Siat7e 基因的表達(dá)后，觀察到這些細(xì)胞的貼壁性能得到了明顯的增強(qiáng)［30］。這意味著Siat7e 基因在細(xì)胞貼壁過(guò)程中可能存在一定的抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了Siat7e在細(xì)胞黏附和貼壁性能中的重要作用，并為深入研究細(xì)胞黏附機(jī)制提供了新的線索。Chu 等［28］通過(guò)基因工程方法改變MDCK 細(xì)胞的貼壁依賴性，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Siat7e 的MDCK 細(xì)胞系，使其能夠懸浮培養(yǎng)；他們將人類的Siat7e 全長(zhǎng)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)QIAprep Spin Miniprep kit（Qiagen）純化提取轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒ST6GalNac V，使用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 Regent 轉(zhuǎn)染MDCK 細(xì)胞，表達(dá)Siat7e 的MDCK 細(xì)胞系改變?yōu)榉琴N壁依賴性。并且在后續(xù)用B/ Victoria/ 504/ 2000 型流感病毒感染改良細(xì)胞后的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明，細(xì)胞源性病毒與雞胚源性病毒具有相似的抗原性，其核苷酸序列完全相同。從表達(dá)Siat7e 的細(xì)胞中產(chǎn)生的血球凝集素（以每106個(gè)細(xì)胞的血球凝集單位表達(dá)）比親代MDCK 細(xì)胞產(chǎn)生的血球凝集素的特異性產(chǎn)量高約20 倍。

3 無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)與應(yīng)用

培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵因素之一，它是細(xì)胞體外生長(zhǎng)的環(huán)境基礎(chǔ)。據(jù)培養(yǎng)基成分的差異，可將其分為有血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基［31］。

傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)通常使用含有動(dòng)物血清的培養(yǎng)基，通過(guò)血清向細(xì)胞提供貼壁因子、生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。然而，血清作為添加劑存在以下缺點(diǎn)：首先，其成分復(fù)雜且不確定，批次之間存在差異，這增加了疫苗等細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)和質(zhì)量控制難度；其次，血清容易引起細(xì)菌、真菌、內(nèi)外源性病毒以及支原體等微生物的污染風(fēng)險(xiǎn)，增加了疫苗生產(chǎn)的安全問題；第三，血清本身價(jià)格較高且供應(yīng)量有限，同時(shí)也增加了生物制品的下游純化難度。因此，開發(fā)無(wú)血清培養(yǎng)基勢(shì)在必行，旨在解決上述問題。

無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷史可以追溯到20 世紀(jì)50 年代。起初，使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基來(lái)維持細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖是常見的做法，但血清成分的不確定性和批次之間的差異使科學(xué)家們開始尋求替代方案。在20世紀(jì)60 年代，人們意識(shí)到細(xì)胞可以在人工合成的培養(yǎng)基中存活，并開始嘗試去除血清成分。然而，初期的無(wú)血清培養(yǎng)基并非完全成功，因?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)和分化受到了限制。隨著時(shí)間的推移，科學(xué)家們不斷改進(jìn)培養(yǎng)基的配方和優(yōu)化條件。他們?cè)囼?yàn)不同的組分和添加物，以提供細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子。此外，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞因子的添加也起到了重要的作用，幫助細(xì)胞附著和生長(zhǎng)。在20 世紀(jì)80年代和90 年代，隨著細(xì)胞生物學(xué)和生物技術(shù)的進(jìn)步，無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)取得了重大突破?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)應(yīng)用特定的生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路激活劑，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)和增殖。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，無(wú)血清培養(yǎng)基的配方也不斷更新和改進(jìn)。1979 年，Taub 等［32］在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了胰島素、前列腺素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白和三碘甲狀腺激素作為血清替代品，使MDCK 細(xì)胞在其中生長(zhǎng)一個(gè)月，生長(zhǎng)速度與細(xì)胞在添加血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的速度相當(dāng)。

現(xiàn)在，人們已經(jīng)成功地開發(fā)了許多特定于不同細(xì)胞類型和應(yīng)用的無(wú)血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展歷程是通過(guò)不斷的實(shí)驗(yàn)和探索，研究人員逐漸揭示了細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的復(fù)雜機(jī)制，并找到了能夠代替血清的替代品［33］。這不僅改變了細(xì)胞培養(yǎng)的方式，也推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步。隨著技術(shù)的不斷演進(jìn)，無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展仍在繼續(xù)，并為許多生命科學(xué)領(lǐng)域的研究提供了更好的工具和平臺(tái)。在2003 年召開的“改進(jìn)體外培養(yǎng)方法,減少胎牛血清使用”的會(huì)議中，專注于改善體外培養(yǎng)方法并減少對(duì)胎牛血清的依賴。與會(huì)者一致呼吁全球減少血清的使用，并積極推動(dòng)無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。這一會(huì)議的召開為無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)的逐漸興起提供了契機(jī)［34］?，F(xiàn)已有許多公司已逐步研發(fā)出了適用于MDCK 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，例如Ultra-MDCK 培養(yǎng)基、MDSS2N 培養(yǎng)基、Invitrogen 公司的EpiSerf 培養(yǎng)基及Sigma-Aldrich 公司的 MDCK-LP、MDCK-LPM 培養(yǎng)基等［19,35-37］。

4 MDCK 細(xì)胞懸浮馴化技術(shù)的應(yīng)用

近年來(lái)，MDCK 細(xì)胞懸浮馴化技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注和研究。通過(guò)馴化MDCK 細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、快速?gòu)?fù)制和高效表達(dá)特定蛋白質(zhì)等目標(biāo)。這為病毒研究、藥物開發(fā)、基因工程等方面提供了重要工具和平臺(tái)。

4.1 流感疫苗制備

MDCK 細(xì)胞懸浮馴化技術(shù)可應(yīng)用于流感疫苗的制備。傳統(tǒng)的流感疫苗制備通常使用雞胚進(jìn)行病毒繁殖和疫苗生產(chǎn)，但病毒利用雞胚進(jìn)行繁殖存在繁雜的操作、變異和污染等問題。而MDCK 懸浮細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)工藝可以避免這些問題，具有生產(chǎn)效率高、病毒感染效率高、適應(yīng)多種流感病毒株、穩(wěn)定性高、安全性高等優(yōu)勢(shì)，可替代傳統(tǒng)病毒培養(yǎng)方法，提高疫苗的生產(chǎn)效率。

目前以MDCK 細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)并已獲準(zhǔn)上市的疫苗如表1 所示。其中，Novartis 公司使用懸浮細(xì)胞MDCK 33016-PF 生產(chǎn)，商名為Optaflu?/Flucelvax?。臨床數(shù)據(jù)顯示，與傳統(tǒng)的雞胚流感疫苗相比，Optaflu?/Flucelvax?在免疫原性、安全性和有效性等方面表現(xiàn)出更好的性能。這一疫苗的上市為流感疫苗的生產(chǎn)提供了一種更先進(jìn)和可靠的方法［12］。韓國(guó)SK Chemicals 公司生產(chǎn)的SKYCellflu 三價(jià)和四價(jià)亞單位疫苗由MDCK-Sky3851 細(xì)胞生產(chǎn)，在韓國(guó)獲得6 個(gè)月及以上的許可，在馬來(lái)西亞和泰國(guó)獲得3 年及以上的許可［38］。

表1 國(guó)際上已獲批上市的MDCK 細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗Table1 Internationally approved MDCK cells matrix influenza vaccine

此外，其他研究者也對(duì)于MDCK 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒做了相關(guān)的研究。2009 年，黃錠［43］成功開發(fā)了適合MDCK 單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基MDCK-SLP、MDCK-SHP，通過(guò)使用硅化方瓶-搖床體系與調(diào)整培養(yǎng)基配方相結(jié)合的方法，成功馴化得到適合單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的ssf-MDCK 細(xì)胞，并對(duì)MDCK 無(wú)血清懸浮培養(yǎng)體系生產(chǎn)流感病毒的過(guò)程條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，在優(yōu)化條件下比較含血清培養(yǎng)基與無(wú)血清培養(yǎng)基的產(chǎn)毒情況；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)血清培養(yǎng)基MDCK-SLP 和MDCK-SHP 中病毒的產(chǎn)量均高于含血清培養(yǎng)基中的病毒產(chǎn)量，二者的最大病毒TCID50滴度值為10（9.37±0.83）TCID50/mL、10（2.85±0.81）TCID50/mL。

在2013 年，張良艷等［44］進(jìn)行了一項(xiàng)研究，采用直接法和間接法對(duì)MDCK 細(xì)胞進(jìn)行馴化，使其適應(yīng)于已知成分的無(wú)血清培養(yǎng)液SFM4MEGAvir，再通過(guò)細(xì)胞旋動(dòng)培養(yǎng)器Cellspin 進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，成功地獲得了MDCKS 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。該細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)充足的條件下生長(zhǎng)良好，并可以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，滿足流感病毒培養(yǎng)的需求。在接種H5N1 疫苗株VN 株后，MDCKS 細(xì)胞能夠產(chǎn)生較高滴度的流感病毒。2021 年，Bissinger 等［45］用MDCK 懸浮細(xì)胞以單細(xì)胞懸浮方式生長(zhǎng)，接種H1N1 流感病毒，測(cè)定各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞活力及代謝產(chǎn)物，及接毒后的TCID50滴度。結(jié)果表明，TCID50滴度在接毒后18-27 h 內(nèi)能夠達(dá)到最大值（2.7±0.5）×109TCID50/mL。趙彩紅等［46］通過(guò)直接適應(yīng)的馴化方式獲得了一株懸浮細(xì)胞命名為MDCK-XF03，并且實(shí)現(xiàn)了從5 L 生物反應(yīng)器到75 L生物反應(yīng)器的擴(kuò)大培養(yǎng)。2022 年，李樂凱等［47］在經(jīng)無(wú)血清懸浮馴化得到的MDCK 細(xì)胞上分別接種4 種型別流感病毒，結(jié)果表明，H1N1 的血凝滴度7 log2（HAU/25 μL），HA 含量達(dá)到20 μg/mL；H3N2的血凝滴度達(dá)11 log2（HAU/25 μL），HA 含量達(dá)到40 μg/mL；BV 的血凝滴度達(dá)9 log2（HAU/25 μL），HA含量達(dá)30 μg/mL；BY 的血凝滴度達(dá)9 log2（HAU/25 μL），HA 含量達(dá)40 μg/mL；4 種型別的流感病毒培養(yǎng)效果均可達(dá)到預(yù)期。另外中國(guó)生物上海生物制品研究所的四價(jià)流感病毒裂解疫苗（MDCK 細(xì)胞）于2023 年1 月獲得了國(guó)家藥品監(jiān)督管理局簽發(fā)的《藥物臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)通知書》［48］。該疫苗是國(guó)內(nèi)首個(gè)基于無(wú)血清全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的流感疫苗，獲得了進(jìn)入臨床試驗(yàn)的批準(zhǔn)。這意味著它可以進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗(yàn)，并為未來(lái)的流感防控提供新的和潛在的可行選擇。

4.2 細(xì)胞工程和基因表達(dá)

MDCK 細(xì)胞懸浮馴化技術(shù)在基因工程領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。通過(guò)基因編輯和轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以在MDCK 細(xì)胞中引入特定基因或刪除目標(biāo)基因，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)或沉默，提供了一種靈活和可控的工具，用于研究細(xì)胞信號(hào)通路、蛋白質(zhì)功能以及疾病模型的建立［49-50］。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)轉(zhuǎn)染MDCK 細(xì)胞的特定基因，可以構(gòu)建與疾病相關(guān)的細(xì)胞模型，用于研究疾病的發(fā)病機(jī)制和新藥的篩選。通過(guò)引入與特定疾病相關(guān)的突變基因或表達(dá)特定蛋白質(zhì)，可以模擬疾病的發(fā)生過(guò)程并研究其相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)。這為疾病研究領(lǐng)域提供了一種可控的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，有助于更好地理解疾病的發(fā)生機(jī)制以及尋找新的治療方法。同時(shí)，MDCK 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)使得基因工程研究更具可行性。相比于傳統(tǒng)的MDCK 細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方式，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)能夠提供更大的細(xì)胞產(chǎn)量和更方便的操作。這對(duì)于大規(guī)模表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)或進(jìn)行高通量篩選實(shí)驗(yàn)十分重要。通過(guò)MDCK 細(xì)胞的懸浮馴化技術(shù)，科學(xué)家們可以更好地利用該細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行基因工程實(shí)驗(yàn)，加速藥物研發(fā)和疾病機(jī)制研究的進(jìn)程。MDCK 細(xì)胞懸浮馴化技術(shù)在基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用為研究人員提供了一種靈活、可控的工具，用于探究細(xì)胞信號(hào)通路、蛋白質(zhì)功能以及疾病模型的建立。

5 MDCK 懸浮細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的安全性研究

MDCK 懸浮細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的安全性研究已經(jīng)被廣泛關(guān)注，研究人員對(duì)MDCK 懸浮細(xì)胞進(jìn)行了多方面的安全性研究。一方面，通過(guò)培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞的穩(wěn)定性和一致性來(lái)評(píng)估其安全性。這包括細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)特性和表型特點(diǎn)的監(jiān)測(cè)等。另一方面，研究人員對(duì)使用MDCK 懸浮細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗進(jìn)行了安全性評(píng)估。他們通過(guò)對(duì)疫苗制劑的物質(zhì)成分、病毒含量和活性進(jìn)行檢測(cè)，以保證疫苗的純度和有效性。此外，還會(huì)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估疫苗的免疫原性和安全性［51］。

5.1 成瘤性與致瘤性

用MDCK 細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)中病毒復(fù)制的基質(zhì)具有許多顯著的優(yōu)勢(shì)，但有實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞在免疫缺陷小鼠皮下或肌肉接種后可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生［52］。出于對(duì)安全性的慎重考慮，制約了其在國(guó)內(nèi)用于人用疫苗的生產(chǎn)。有效評(píng)估MDCK 細(xì)胞的致癌能力，避免細(xì)胞的致癌基因可能會(huì)對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在威脅，確保該細(xì)胞系安全用于流感疫苗生產(chǎn)是目前研究的重點(diǎn)［39,53］。近年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)于MDCK細(xì)胞的成瘤機(jī)制進(jìn)行了深入研究發(fā)現(xiàn)，了一些與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的信號(hào)通路和因子，如MDCK 細(xì)胞中的Ras/MAPK 和PI3K/Akt 信號(hào)通路被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［39］。這兩個(gè)信號(hào)通路的異常激活可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制、細(xì)胞增殖增加以及侵襲和轉(zhuǎn)移能力的提高。因此，研究人員對(duì)于這些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和干預(yù)具有極大的興趣，希望通過(guò)抑制這些通路的活性來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。深入了解這些信號(hào)通路的作用機(jī)制將有助于我們更好地理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)。另外，研究發(fā)現(xiàn)，MDCK 細(xì)胞在體內(nèi)具有一定的轉(zhuǎn)移能力，可以通過(guò)侵入周圍組織和血管來(lái)形成轉(zhuǎn)移瘤。研究人員正在探索MDCK 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，以及與轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子和信號(hào)通路［54-55］。這些研究可以幫助我們更好地理解腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程，并為轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療提供新的思路。通過(guò)比較不同類型的MDCK 細(xì)胞株和不同分化狀態(tài)下的MDCK 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，了一些與腫瘤相關(guān)的分子特征。如表觀遺傳修飾、腫瘤抑制基因和腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)水平可能與其成瘤性和致瘤性有關(guān)［52,56-57］。利用MDCK 細(xì)胞構(gòu)建的腫瘤模型也被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選和治療研究中。這些模型可以評(píng)估候選藥物的抗腫瘤活性，并幫助研究人員更好地了解腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性和耐藥機(jī)制。

5.2 宿主細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性

MDCK 懸浮細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性是評(píng)估其在疫苗生產(chǎn)中安全性的關(guān)鍵因素之一。研究表明，MDCK細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中能夠維持相對(duì)穩(wěn)定的染色體結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)模式。通過(guò)使用分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)方法，可以檢測(cè)細(xì)胞中的染色體改變和突變頻率，以評(píng)估MDCK 細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)中的遺傳穩(wěn)定性。此外，通過(guò)利用新的高通量測(cè)序技術(shù)以及基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法，可對(duì)MDCK 細(xì)胞的基因組進(jìn)行全面的解析［58-59］。這些研究揭示了MDCK 細(xì)胞中存在的染色體易位、突變和拷貝數(shù)變異等染色體改變，并確定了其中一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和穩(wěn)定性具有重要影響的關(guān)鍵基因。此外，通過(guò)結(jié)合CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，還成功地對(duì)MDCK 細(xì)胞中的關(guān)鍵基因進(jìn)行了精確的編輯和改造，以進(jìn)一步提高其遺傳穩(wěn)定性［60］。

5.3 疫苗產(chǎn)品的安全性評(píng)估

MDCK 懸浮細(xì)胞疫苗產(chǎn)品的安全性是在多個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估的，以確保其在疫苗接種中的安全性［61］。這包括對(duì)疫苗產(chǎn)品中的雜質(zhì)、殘留物和可能的毒性成分以及重復(fù)給藥、生殖毒性、免疫原性和保護(hù)作用等方面進(jìn)行分析和檢測(cè)［62］。研究人員通過(guò)對(duì)疫苗產(chǎn)品的成分、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行詳細(xì)的分析，以確保疫苗在臨床應(yīng)用中的安全性。此外，還需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，評(píng)估疫苗在動(dòng)物和人體中的免疫原性和安全性［63-65］。

通過(guò)這些安全性評(píng)估，可以有效地確保MDCK懸浮細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗在應(yīng)用中的安全性和可靠性，為疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)提供重要的保證。然而，仍需要進(jìn)一步的研究和監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)的制定，以應(yīng)對(duì)不斷出現(xiàn)的新病毒和疫苗需求的挑戰(zhàn)。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，流感疫苗對(duì)公共健康具有重要影響。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生產(chǎn)安全高效的疫苗以更快的速度和更低的成本成為迫切需求。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行疫苗生產(chǎn)已成為生物制藥行業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

傳統(tǒng)的MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)方式多采用含血清的貼壁培養(yǎng)方法，但血清的成分復(fù)雜，成本高且存在批次差異大、污染風(fēng)險(xiǎn)高和下游純化困難等問題，使生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。此外，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)受到基質(zhì)表面積限制，消化工藝復(fù)雜且生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和流感疫苗的生產(chǎn)。相比之下，MDCK 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)突破了細(xì)胞生長(zhǎng)受到表面積限制的制約。懸浮細(xì)胞能夠在反應(yīng)器中快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)環(huán)境更為均一，細(xì)胞密度更高，這有利于大規(guī)模病毒繁殖，提高病毒產(chǎn)量。結(jié)合無(wú)血清培養(yǎng)基，在反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)，便于檢測(cè)和控制細(xì)胞生長(zhǎng)的參數(shù)，并降低企業(yè)生產(chǎn)成本，方便下游純化，滿足疫苗大規(guī)模生產(chǎn)的需求。

然而，由于MDCK 細(xì)胞在免疫缺陷小鼠中可能引發(fā)腫瘤發(fā)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在國(guó)內(nèi)用于人類疫苗生產(chǎn)。因此，評(píng)估MDCK 懸浮細(xì)胞的安全性成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。通過(guò)深入研究MDCK 細(xì)胞的致癌機(jī)制、轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制和與腫瘤相關(guān)的分子特征，以全面評(píng)估其安全性，并探索新方法以降低潛在的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)。因此，MDCK 細(xì)胞懸浮馴化及無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)的研究具有廣闊的應(yīng)用前景，但必須在保證安全性的前提下進(jìn)行進(jìn)一步研究和探索，以確保其在疫苗生產(chǎn)中的可靠性和可行性。