我國作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研究進展

楊文莉 朱梨梨 陳健 陳燕欣 姚涓 姜大剛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

作物在生長發(fā)育過程中容易受到病菌感染，導(dǎo)致其生長狀況、產(chǎn)量和品質(zhì)受到影響。為控制病菌傳播速度，減少病菌對農(nóng)作物的侵害，及時準(zhǔn)確地檢測出染病的植株極為重要。傳統(tǒng)的病菌檢測方法主要通過觀察染病植株和菌群的表征進行診斷，存在檢測滯后、成本高、靈敏度低等問題，影響對作物病害的控制。近年來，分子檢測技術(shù)在作物病菌檢測工作上的應(yīng)用和發(fā)展，極大地縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度，對病害的感染情況能夠更及時的掌握。國內(nèi)相關(guān)監(jiān)管部門陸續(xù)出臺了分子檢測標(biāo)準(zhǔn)與方法，以規(guī)范和促進作物病菌檢測工作的進行。在作物病菌的分子檢測工作中，標(biāo)準(zhǔn)品可為檢測結(jié)果提供可靠的參考值，提高檢測結(jié)果的可靠性和精準(zhǔn)性。

根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則第2 部分：常用術(shù)語及定義》（標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T 15000.2—2019）及中國合格評定國家認可委員會（CNAS）《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認可準(zhǔn)則》（標(biāo)準(zhǔn)號：CNAS-CL04）指出，標(biāo)準(zhǔn)品是指適用于計量或檢測中，已被確定其符合測量過程的、具有高度均勻性和穩(wěn)定性的材料［1］。標(biāo)準(zhǔn)品主要用于測量系統(tǒng)的校準(zhǔn)、測量程序的評估和質(zhì)量控制等幾個方面［2-3］。在全球范圍內(nèi)，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology,NIST）、澳大利亞國家檢測研究所（National Measurement Institute,Australia,NMIA）、中國計量科學(xué)研究院（National Institute of Metrology,China,NIMC）等多所專業(yè)機構(gòu)已經(jīng)開展標(biāo)準(zhǔn)品的研制［4］。經(jīng)過多年發(fā)展，許多標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)被成功研制并投入使用。但作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品方面的相關(guān)研制依然較少，不利于我國開展對作物病害的檢測防治工作。本文通過對作物病菌檢測方法、檢測標(biāo)準(zhǔn)及作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品研究進展進行梳理總結(jié)，以期為我國作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研制提供參考。

1 作物病菌及其檢測方法

作物病菌主要可以分為細菌、真菌和病毒3種［5］。作物感染病菌后，會出現(xiàn)變色、壞死、萎蔫、腐爛和畸形等癥狀。真菌感染存在易復(fù)發(fā)、傳播性強等問題，需要對受感染的作物進行及時的追蹤檢測和治療。病毒感染具有隱秘性強、傳播性強、表征不明顯等特點，通常無法及時發(fā)現(xiàn)并給予相對應(yīng)的措施。據(jù)不完全統(tǒng)計，在全世界范圍內(nèi)，由于作物感染病菌導(dǎo)致的直接或者間接的經(jīng)濟損失高達400 億美元/年［6］。也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在全球氣候變暖的環(huán)境影響下，土壤中作物潛在病原體的相對豐度會增加，使作物更容易感染病菌［7-8］?；谧魑锊【鷮r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的危害，在《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第351 號》中，有15 種病菌被列入了《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單》和《應(yīng)施檢疫的植物及植物產(chǎn)品名單》，其中細菌7 種，真菌6 種，病毒3 種（表1）。例如，瓜類果斑病菌（bacterial fruit blotch,BFB）是一種嚴(yán)重的細菌性病害，該病菌可以侵染西瓜、甜瓜、南瓜、葫蘆等葫蘆科植物，使果實形成暗褐色病斑，后逐漸發(fā)展形成黑褐色壞死斑，最終導(dǎo)致腐爛，影響葫蘆科植物產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)量，造成巨大的經(jīng)濟損失，已成為影響我國葫蘆科植物農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的主要病害之一［9］。玉米褪綠斑駁病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV）侵染玉米后會導(dǎo)致作物壞死，玉米產(chǎn)量下降，是我國禁止入境的檢疫性有害生物之一［10］。對于病菌引起的作物病害，在生產(chǎn)上可以通過作物輪作、使用抗性品種等方法降低作物病菌感染［11］，但無法在病害出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)作物的感病情況。因此對作物感染病菌早期進行及時準(zhǔn)確的檢測，可以為作物病害防治工作提供參考，減少經(jīng)濟損失。

目前，常用的作物病菌檢測方法主要包括形態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、生化鑒定以及分子檢測等。其中，傳統(tǒng)的方法是根據(jù)作物的生理狀態(tài)如枯萎、潰爛等癥狀進行初步的判斷，再通過分離病菌，觀察病菌的形態(tài)做出診斷［12-13］。雖然這些方法應(yīng)用廣泛，但需要診斷者具備一定的專業(yè)知識，具有比較大的主觀性和不確定性；而且對于難以在體外培養(yǎng)的致病微生物（如病毒），鑒定難度大。為此，需要一種高效的方法，對感病的植株進行及時準(zhǔn)確的檢測。分子檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確性好、檢測速度快等優(yōu)點，在作物病菌檢測中應(yīng)用越來越廣泛。李興紅等［14］通過酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immune sorbent assays,ELISA）的方法對辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）進行檢測，譙天敏等［15］通過巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測桉樹焦枯病。近年來實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）、數(shù)字PCR（digital PCR,dPCR）等分子檢測技術(shù)，也被運用到作物病菌檢測工作中［16］。高艷玲等［17］建立了苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）的RT-PCR 和RT-qPCR 檢測體系，可用于檢測馬鈴薯組織中及薊馬和蚜蟲體內(nèi)的苜?；ㄈ~病毒；李輝等［18］建立了多年明孢盤菌（N.perennans）導(dǎo)致的蘋果牛眼果腐病微滴式數(shù)字PCR 檢測體系，實現(xiàn)對該病原菌的高效、高精度檢疫鑒定。dPCR 作為一種新的核酸定量技術(shù)，其不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)進行絕對定量，具有靈敏度高、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)勢。將dPCR 應(yīng)用于作物病菌檢測工作，可以使結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，具有廣泛的應(yīng)用前景［19-20］?！陡涕冱S龍病菌數(shù)字PCR 檢測》（標(biāo)準(zhǔn)號：DB 44/T 2220-2019）的出臺，將dPCR 技術(shù)應(yīng)用到實際檢測工作中，在提高柑橘黃龍病菌檢測工作效率和結(jié)果準(zhǔn)確性的同時，也為dPCR 技術(shù)應(yīng)用到其他的病菌檢測中提供了參考。

為了使檢測過程更加規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，經(jīng)查詢?nèi)珖鴺?biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺（https://std.samr.gov.cn），我國已制定并發(fā)布超過230 項作物病菌檢測標(biāo)準(zhǔn)（表2），以規(guī)范和加快在生產(chǎn)上的應(yīng)用。在這些標(biāo)準(zhǔn)中，國家標(biāo)準(zhǔn)共71 項，占比30%；行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)占比最多，共133 項，占比55%；地方標(biāo)準(zhǔn)有32 項，占比13%；另有5 項國家標(biāo)準(zhǔn)計劃，目前處于起草階段（圖1）。柑橘黃龍病是一種由柑橘黃龍病菌侵染柑橘屬、金柑屬等蕓香科植物，導(dǎo)致染病作物葉片變黃和柑橘產(chǎn)量下降的疾病，該病已成為影響柑橘產(chǎn)業(yè)最嚴(yán)重的病害。目前已經(jīng)制定和發(fā)布了《柑桔黃龍病菌實時熒光PCR 檢測方法》（標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T 28062-2011）、《柑橘黃龍病菌數(shù)字PCR 檢測》（標(biāo)準(zhǔn)號：DB44/T 2220-2019）等相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)，促進了柑橘黃龍病檢測與防治工作的開展［21］。水稻細菌性條斑?。╮ice bacterial leaf streak,BLS）是對水稻危害最嚴(yán)重的細菌性病害之一，對水稻條斑病菌進行及時的檢測，可以控制病菌在水稻間的傳播速度，減少經(jīng)濟損失［22］。目前《水稻細菌性條斑病菌的檢疫鑒定方法》（標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T 28099-2011）標(biāo)準(zhǔn)的出臺，對病菌信息、鑒定方法、鑒定標(biāo)準(zhǔn)等方面做出了詳細的介紹，使鑒定方法更加規(guī)范化，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。這些檢測標(biāo)準(zhǔn)的出臺對作物病菌檢測工作的規(guī)范化、檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化和可靠性有重要意義。

2 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

在作物病菌檢測工作中，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對照，提供參考依據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)菌株是一種可溯源的且生物學(xué)特性穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，在檢測中起到對照菌株、培養(yǎng)基性能檢驗、試劑的標(biāo)準(zhǔn)性和設(shè)備性能檢測的作用［23］。我們查詢了標(biāo)準(zhǔn)品信息網(wǎng)（http://www.gbw.org.cn）、國家標(biāo)準(zhǔn)樣品網(wǎng)（http://www.crmch.com）及標(biāo)物中心網(wǎng)（http://www.gjbwzx.cn），有52 種作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品研制成功并投入使用（表3）；其中，真菌標(biāo)準(zhǔn)品研制數(shù)量最多，共有46 種，占比88%；細菌和病毒的標(biāo)準(zhǔn)品研制較少，各只有3 種，分別占比6%。例如，水稻細菌性谷枯病是由伯克霍爾德氏菌（Burkholderia glumae）屬引起水稻苗腐、鞘腐以及谷粒腐爛的細菌性病害，該病菌標(biāo)準(zhǔn)品的成功研制，有助于水稻細菌性谷枯病菌檢測工作開展［24］。羅金燕等［25］通過將田間分離出來的病原菌與水稻細菌性谷枯病菌標(biāo)準(zhǔn)品進行生理特性、菌落特性等25 項比較，以確定該田間病菌為水稻細菌性谷枯病菌。小麥赤霉病是由多種鐮刀屬真菌侵染小麥，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量減少的病害，小麥赤霉菌標(biāo)準(zhǔn)品的成功研制有助于該病的檢測工作開展［26］。武愛波等［27］利用標(biāo)準(zhǔn)菌株，建立了用于檢測赤霉菌及其毒素的PCR 檢測方法。趙麗紅等［28］利用標(biāo)準(zhǔn)菌株Vd076 建立了鑒定棉花黃萎病抗性品種的qPCR 方法。標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用為作物病菌的檢測工作提供了陽性標(biāo)準(zhǔn)品，保證檢測結(jié)果的可靠性和溯源性，增加了檢測結(jié)果的公信力。

表3 部分作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品信息Table 3 Information of selected crop pathogen standards

與標(biāo)準(zhǔn)品相比，有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（certified reference material,CRM）在檢測工作中能作為量值溯源的依據(jù)，可以對檢測結(jié)果進行準(zhǔn)確定量，使結(jié)果更加精確。為此，我們通過國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺（National Sharing Platform for Reference Materials,China）查詢相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制情況，但未查詢到作物病菌類有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以分為基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)這四種［29］。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是現(xiàn)有的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中較為常見的一種，其優(yōu)勢在于研制成本低，是解決病菌檢測中量值溯源問題的主要方法之一［30］?；蚪MDNA 分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的運用范圍和質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)類似，僅能用于核酸水平上的檢測，其優(yōu)點在于研制難度較低，可以長期保存，在進行實時熒光定量PCR 時使用起來比較簡便，但其對待測樣品DNA 的質(zhì)量要求相對要求較高，會受檢測樣品DNA 質(zhì)量的影響。基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也是所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中較多的一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在其制備過程中，候選物的純度與基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確性直接相關(guān)，因此候選物的選擇十分重要［31］。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與上述幾種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不同，由于其生物學(xué)特性易受環(huán)境因素的影響，其制備與標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)難度較大，我國暫未有病菌蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的報道［32］。

在制備流程上，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品的研制流程大體一致，主要包括候選物的制備、均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗等，但標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備要求更高［29-30］。在制備病菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時，可以根據(jù)候選物的特性以及檢測工作的需求，選擇適當(dāng)?shù)念愋?。作物病菌?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，有利于滿足作物病菌檢測中準(zhǔn)確量值的需要，從而及時對感染病菌的作物進行防治。

3 作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品面臨的問題與展望

我國是世界上人口數(shù)量最多的國家之一，糧食需求量大，為滿足人民日益增長的農(nóng)產(chǎn)品需求，保證農(nóng)產(chǎn)品綠色、安全生產(chǎn)極為重要。作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品可以在盡早發(fā)現(xiàn)作物病菌感染，促使建立更好更快的防治方法方面發(fā)揮積極作用，為生產(chǎn)更安全更優(yōu)質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品保駕護航。

在作物病菌檢測工作中，標(biāo)準(zhǔn)品可以作為對照樣品，為結(jié)果提供依據(jù)，保證結(jié)果的可信度，但仍存在以下問題：首先，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品品種和數(shù)量較少，無法完全滿足作物病菌檢測中的需求。為此，國家應(yīng)統(tǒng)籌規(guī)劃加大相關(guān)項目的啟動、落實和發(fā)展，使更多學(xué)者投身到病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研制中，為作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品的研制提供更多機遇［33］。其次，在檢測工作中，標(biāo)準(zhǔn)品的使用無法做到對作物感病情況準(zhǔn)確量值。而在分子檢測工作中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尤其是有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以作為定值參照，對檢測結(jié)果準(zhǔn)確定量［34］。但由于我國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)整體的發(fā)展時間短，作物病菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制在我國鮮有報道，為此，還需加大力度研制作物病菌的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。同時，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制與應(yīng)用過程中，也面臨著原材料來源不一與質(zhì)量不穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方式不同導(dǎo)致測量誤差、定值方法復(fù)雜且成本較高等問題。針對這個問題，可通過建立聯(lián)合實驗室共同制備，或建立實驗室網(wǎng)絡(luò)，共享研究方法和成果加以解決［21］。總體來說，從國家層面對標(biāo)準(zhǔn)品的規(guī)范管理和體系的不斷完善，我國作物病菌標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作將迎來更快的發(fā)展。