藍莓原漿抗氧化及緩解視疲勞功能研究

蔡軼男，王樂兵，李德海，2*

（1 東北林業(yè)大學生命科學學院 哈爾濱150040 2 黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室 哈爾濱 150040）

藍莓屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，別名越橘，多年生落葉或者常綠灌木。藍莓果為扁圓形，成熟果實為深藍色[1]。藍莓含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中花青素含量很高，具有極高的營養(yǎng)價值?；ㄇ嗨貙儆诙喾宇愇镔|(zhì)，是一類植物中普遍含有的水溶性色素，通常經(jīng)糖基化修飾后形成花色苷[2]。研究表明，藍莓花青素不僅可以提供鮮艷的色彩，還具有具有顯著的抗氧化[3-5]，改善視力，清除人體自由基、抑制腫瘤細胞增生[6]，神經(jīng)保護[7]，防止細胞衰老，降血糖血脂，預防心血管疾病[8]等功效。

近年來隨著社會中各種智能電子產(chǎn)品的廣泛使用，眼部視力問題越來越凸顯，近視已成為世界范圍內(nèi)關(guān)注的公共健康問題[9]?；ㄇ嗨貙σ暳Φ谋Ｗo作用逐漸得到人們的重視，現(xiàn)有國內(nèi)外研究學者通過體內(nèi)模型（即人體干預和動物實驗）和體外模型（細胞培養(yǎng)）研究有關(guān)花青素對視力的保護作用。有科學家報道藍莓中的成分，如花青素、多酚和紫檀芪可以通過抗氧化作用、抗血管生成和抗衰老作用保護視網(wǎng)膜色素上皮細胞免受光致視網(wǎng)膜損傷[10-11]，藍莓提取物（BAE）可以通過抗氧化和抗炎機制對人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞起到保護作用，可作為開發(fā)糖尿病相關(guān)視網(wǎng)膜病變的藥物的理想成分[12]。還有研究表明花青素能抑制短暫性近視，減少眼睛疲勞或增強青光眼患者的視網(wǎng)膜血流量[1-14]。然而，藍莓花青素能夠起到緩解視疲勞的作用是否與其抗氧化性有密切關(guān)系尚不清楚。

本研究采用小鼠體內(nèi)抗氧化和人體試飲試驗探究藍莓花青素抗氧化性與緩解視疲勞的相關(guān)性。采用低、中、高藍莓原漿劑量對小鼠進行連續(xù)灌胃30 d，測定昆明種（KM）小鼠體內(nèi)蛋白、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性。同時招募具有視疲勞癥狀的志愿者進行藍莓原漿試飲試驗，監(jiān)測其明視持久度、視疲勞癥狀積分等，旨在為進一步開發(fā)藍莓花青素功能性食品提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓原漿，由野生藍莓經(jīng)過打漿制作而成，其原花青素含量為11.6 g/L，野生藍莓由森驕山特產(chǎn)品責任有限公司提供；18～20 g 清潔級健康昆明種（KM）雌性小鼠，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)和使用許可證號：NO.SCXK（遼）2020-0001，飼養(yǎng)溫度20～22 ℃，相對濕度50%～60%，自由飲水、進食。

試飲人群為東北林業(yè)大學在校本科備考學生，每日學習時間超過8 h，經(jīng)測試視疲勞癥狀明顯。

生理鹽水（0.9%），哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司；維生素C（食品級），石藥集團維生藥業(yè)（石家莊）有限公司；總蛋白（Total protein，TP）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器，常州國宇儀器制造有限公司；721 型分光光度計，上海精密儀器公司；TG16B 實驗室離心機，海南凱達科學儀器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；電子天平，沈陽龍騰電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓原漿抗氧化功能研究 選取清潔級昆明種（KM）雌性小鼠50 只，體質(zhì)量在18～20 g，適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為5 組，每組10 只。分別為正常對照組、花青素含量低（100 mg/kg）、中（150 mg/kg）、高（250 mg/kg）劑量組以及陽性對照組，具體灌胃劑量見表1。

表1 動物實驗方法Table 1 Animal test method

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，4 000 r/min 離心3 min，取上清備用；斷頸處死后取肝臟，用0 ℃生理鹽水洗去表面血液，濾紙擦干后稱質(zhì)量，加入生理鹽水制成10%肝臟勻漿。血清與肝臟勻漿均置于冰浴備用。采用試劑盒測定血清及肝臟總蛋白（TP）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力、過氧化氫酶（CAT）活力以及丙二醛（MDA）含量。

1.3.2 緩解視疲勞功能研究 本試驗于東北林業(yè)大學在校學生中選擇18～22 歲具有視疲勞癥狀的志愿者共40 名，排除不符合納入標準，未按規(guī)定飲用受試物者，最終有效受試者為39 名。具體分組試飲方法見表2。

表2 藍莓原漿試飲試驗方法Table 2 Test method for blueberry pulp

參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》 的規(guī)定，觀察指標分為安全性指標與功效指標，本試驗僅對藍莓原漿對視疲勞的緩解功效進行分析測定。功效判斷標準見表3。

表3 視疲勞癥狀判定方法（半定量積分法）Table 3 Determination method of visual fatigue symptom（Semi-quantitative integral method）

視疲勞即由于各種因素導致人眼在視物之時超過其視覺功能所能承受的負荷，而在用眼后出現(xiàn)視覺障礙、眼部不適或伴有全身癥狀等以致不能正常使用視功能的一組癥候群[15]。主要體現(xiàn)為6大癥狀：眼脹、眼酸痛、眼畏光流淚、視物模糊、眼干澀以及眼異物感。為進一步全面掌握受試者試飲期間視疲勞改善情況，針對這6 大癥狀，試驗人員通過設計調(diào)查問卷收集飲用藍莓原漿期間各位受試者視疲勞的改善情況，打分標準見表4。

表4 日判定標準Table 4 Daily judgment criteria

1.4 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓原漿抗氧化功能研究

2.1.1 藍莓原漿對小鼠體質(zhì)量的影響 體質(zhì)量通?？梢宰钪苯拥胤从吵鰟游锏纳鏍顟B(tài)。進食、飲水異常，體內(nèi)各個器官工作狀態(tài)不佳的小鼠，通常會表現(xiàn)為小鼠體質(zhì)量下降，毛發(fā)稀疏灰暗，精神狀態(tài)萎靡。

如表5 所示，對小鼠進行灌胃處理之前，各劑量組之間小鼠體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），說明分組前小鼠個體間身體狀況相似，可以保證小鼠身體狀況均處于同一水平。灌胃30 d 后，中劑量組小鼠體重與高劑量組相比差異性顯著（P＜0.05），表明適量的藍莓原漿可能對小鼠的進食具有促進作用，使小鼠體質(zhì)量增加；而高劑量組小鼠體質(zhì)量相比于灌胃前下降了2.28 g，可能是小鼠普遍的胃容量為1.5～2.0 mL，藍莓原漿灌胃量增加占據(jù)了小鼠的胃部空間，導致小鼠進食量下降，飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)的攝入受到抑制，進而使小鼠體質(zhì)量降低。

表5 藍莓原漿對小鼠體質(zhì)量的影響Table 5 Effects of blueberry pulp on body weight in mice

2.1.2 藍莓原漿對小鼠臟器系數(shù)的影響 臟器系數(shù)能直觀體現(xiàn)出受試物對小鼠臟器的影響。心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟是動物機體中參與代謝的重要器官，其發(fā)育狀態(tài)可以反映出代謝機能同時能間接反映出生長狀態(tài)[16]。

臟器系數(shù)見表6，各劑量組之間兩兩比較，心、肝、脾以及腎臟器系數(shù)均差異不顯著（P＞0.05）；而對比肺臟器系數(shù)發(fā)現(xiàn)灌胃組小鼠的肺臟器系數(shù)偏小，考慮到給予小鼠的藍莓原漿是由野生藍莓全果壓榨制成，濃稠并含有果肉的深藍紫色液體狀態(tài)，由于液體濃稠，導致灌胃難度加大，在小鼠掙扎過程中可能出現(xiàn)液體吸入氣管從而對小鼠肺部造成負面影響。

表6 藍莓原漿對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 6 Effecs of blueberry pulp on organ index in mice

2.1.3 藍莓原漿對小鼠血清及肝臟總蛋白（TP）含量的影響 蛋白質(zhì)可以說是參與了包括疾病和健康在內(nèi)的所有生命過程。最近一項深入的血清蛋白質(zhì)組調(diào)查顯示血清蛋白質(zhì)網(wǎng)絡與常見疾病密切相關(guān)[17]，突出了血清蛋白作為潛在病原體的生物標記物的新作用，在動物實驗中血清及肝臟蛋白含量具有重要參考意義。

由圖1 可知，空白對照組與灌胃組兩兩相比，血清蛋白含量均存在顯著差異（P<0.05），由此推斷藍莓原漿可以增加小鼠血清蛋白含量，灌胃組小鼠的機體功能狀態(tài)得到了一定程度的提高；同時中劑量組與陽性對照相比不存在顯著差異（P>0.05），可知藍莓原漿中劑量組中花青素對小鼠血清蛋白含量的增加作用與抗壞血酸相似。

圖1 藍莓原漿對小鼠血清蛋白及肝臟蛋白含量的影響Fig. 1 Effects of blueberry pulp on serum protein and liver protein content in mice

比較各劑量組間肝臟蛋白含量，灌胃組中肝臟蛋白含量雖稍高于對照組，但與對照組相比不存在顯著差異（P>0.05）。

2.1.4 藍莓原漿對小鼠體內(nèi)SOD 活力的影響 SOD是在進化過程中形成的、廣泛存在于生物體內(nèi)，可有效清除超氧陰離子自由基的主要酶類之一，在抗氧化方面發(fā)揮了重要作用[18]。SOD 在有限的催化速率下，將超氧自由基分解為O2和H2O2，為機體抗氧化提供第一道酶防線[19]。不同劑量藍莓花青素對小鼠肝臟及血清中SOD 酶活力的影響如圖2 所示。

圖2 藍莓原漿對小鼠血清及肝臟中SOD 酶活力的影響Fig. 2 Effects of blueberry pulp on SOD activity in serum and liver of mice

隨著藍莓原漿用量的增加，小鼠肝臟中SOD酶活力呈上升趨勢；中、高劑量組與空白對照組相比均存在顯著差異（P<0.05）；同時中、高劑量組小鼠肝臟SOD 酶活力與陽性對照組相似，說明藍莓原漿能夠提高小鼠肝臟SOD 酶活力，并且與計量呈正相關(guān)關(guān)系。Chen 等[20]從山茱萸中提取出富含花青素的提取物ANF 也可通過提高小鼠體內(nèi)SOD 酶活力達到提高抗氧化能力的目的，與本研究結(jié)果相似。

小鼠血清中SOD 酶活力雖隨著藍莓原漿用量的增加而略有增大，但各劑量組之間無顯著差異（P>0.05）。綜上可知劑量為250 mg/kg 對提高小鼠體內(nèi)SOD 酶活力效果最佳。

2.1.5 藍莓原漿對小鼠體內(nèi)CAT 活力的影響 CAT作為一種含鐵的同四聚體酶，主要作用為催化H2O2分解產(chǎn)生H2O 和O2[21]，在活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除過程中起著重要作用。

如圖所3 示，當藍莓花青素含量為100 mg/kg時，小鼠肝臟中CAT 酶活力最高，隨著劑量增加CAT 酶活力呈下降趨勢；陽性對照組小鼠體內(nèi)CAT 酶活力最低；小鼠血清中CAT 酶活力也隨著藍莓原漿用量的增加而略有降低，差異不顯著（P＞0.05）。由此可說明適量的藍莓原漿攝入可對小鼠體內(nèi)CAT 酶活力的增強起到促進作用，劑量為100 mg/kg 促進作用最大。

2.1.6 藍莓原漿對小鼠體內(nèi)MDA 含量的影響MDA 含量可反映出機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，MDA 含量越少，說明機體細胞受損傷程度越小。

如圖4 所示，灌胃組小鼠肝臟MDA 含量與對照組相比均有明顯減少，說明藍莓原漿與抗壞血酸對小鼠體內(nèi)抗氧化起到了積極作用；當花青素劑量為150 mg/kg 時，小鼠肝臟MDA 含量最低，為（2.64±0.58）nmol/mg prot，并且與空白、低、高劑量組兩兩相比均存在顯著差異（P＜0.05）；當藍莓原漿灌胃量為0.53 mL，即花青素用量為250 mg/kg 時，小鼠血清中MDA 含量最低，且與其它劑量組相比均存在顯著性差異（P＜0.05）。綜合比較可知高劑量藍莓原漿攝入可以明顯降低小鼠體內(nèi)MDA 含量，有效地抑制小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用。

圖4 藍莓原漿對小鼠血清及肝臟中MDA 含量的影響Fig. 4 Effects of blueberry pulp on MDA content in serum and liver of mice

2.2 藍莓原漿緩解視疲勞功能研究

有研究表明，以花青素為代表的黃酮類化合物可能參與了涉及視覺生理學和眼睛健康不同過程中的2 個主要方面[22]：一是在視覺信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮作用，而其機理目前尚不清楚；二是類黃酮也可能作為抗氧化劑發(fā)揮作用[23]，這在眼睛中尤其重要。相比于其它器官，眼部氧化應激十分顯著，它的損害可導致包括黃斑變性在內(nèi)的許多視覺病理問題。視覺疲勞即是眼部氧化應激的最初體現(xiàn)，因此本試驗以視疲勞作為測定指標，通過體現(xiàn)疲勞程度的6 大癥狀來評估藍莓原漿緩解視疲勞的能力。

2.2.1 藍莓原漿對受試者眼脹與眼酸痛的改善效果 長時間的用眼導致睫狀肌長時間的固定在一個姿勢，處于緊張狀態(tài)，逐漸失去原有的舒縮能力，即眼肌放松調(diào)節(jié)障礙。眼部毛細血管血液流通緩慢，眼部供氧不足，引起眼脹、眼酸痛癥狀。

由圖5a 可以看出，試飲組中女性受試者在試飲30 d 左右，眼脹狀況得到明顯改善，并開始相對穩(wěn)定地在3～4 分之間浮動；男性受試者在第13天就出現(xiàn)明顯的改善情況，在試飲25 d 時打分情況相對穩(wěn)定下來；女性試飲者在飲用藍莓原漿第9 天時（見圖5b），眼酸痛狀況開始有所改善，而在試飲10～30 d 期間打分情況浮動相對加大。在試飲30 d 后，打分情況穩(wěn)定在4 分左右。男性試飲者在試飲第7 天出現(xiàn)明顯改善，而自此直到試飲結(jié)束打分情況均在3～4 之間出現(xiàn)不同程度的浮動?？梢娝{莓原漿對男性眼脹及眼酸痛改善情況見效較快，這可能與男生好動，相比于女生戶外活動以及體育鍛煉更加頻繁，眼部疲勞狀況改善更明顯有關(guān)。

圖5 藍莓原漿對視疲勞癥狀積分的影響Fig. 5 Effects of blueberry pulp on visual fatigue symptom score

2.2.2 藍莓原漿對受試者眼畏光流淚與視物模糊的改善效果 畏光流淚與視物模糊通常發(fā)生在眼部疲勞程度較重，或眼部炎癥存在的情況下，在一般人群中出現(xiàn)幾率相較于其它幾項疲勞癥狀出現(xiàn)幾率較低。由于熬夜玩手機、睡眠質(zhì)量不佳、用眼過度等不良習慣刺激，造成瞼板腺油脂分泌功能障礙，使眼表潤滑度降低，淚膜不穩(wěn)定，形成畏光流淚，嚴重者導致視物模糊。

由圖6a 可以看出，試飲組男性在第8 天后打分情況就基本穩(wěn)定在4 分左右，女性在試飲第12天打分情況穩(wěn)定在4 左右。說明藍莓原漿對于緩解眼部畏光流淚狀況效果良好。對照組中女性受試者打分情況極不穩(wěn)定，幾乎所有男性受試者在60 d 的試飲期間眼部畏光流淚狀況沒有得到改善。試飲20 d 后，試飲組男女受試者打分情況均在3～4 范圍波動（見圖6b），這是由于眼部畏光流淚及視物模糊的程度與當天人們用眼程度直接相關(guān)，導致對照組打分情況的較大波動。

圖6 藍莓原漿對視疲勞癥狀積分的影響Fig. 6 Effects of blueberry pulp on visual fatigue symptom score

2.2.3 藍莓原漿對受試者眼干澀與眼異物感的改善效果 在視疲勞的6 大癥狀中，干眼的發(fā)生率和頻率明顯高于其他它眼部癥狀[24]，電子產(chǎn)品的藍光會損傷角膜和淚膜，使淚膜的穩(wěn)定性下降。長時間注視紙張或屏幕也導致眨眼頻率減少，淚液缺乏或過度蒸發(fā)從而引起眼干。眼球轉(zhuǎn)動過程中由于缺少淚液的潤滑作用，對周圍組織異物等敏感度增加，與眼皮之間的摩擦增大就會產(chǎn)生異物感。

由圖7a 可以看出，試飲組中女性受試者在試飲第23 天時，眼干癥狀開始有明顯改善，并在此以后分數(shù)均在4 左右波動。圖7b 中女性受試者在第25 天眼異物感開始有明顯改善，打分情況在4左右；而男性受試者在試飲第9 天時眼干與眼異物感癥狀均得到明顯改善。

圖7 藍莓原漿對視疲勞癥狀積分的影響Fig. 7 Effects of blueberry pulp on visual fatigue symptom score

綜上所述，飲用了藍莓原漿的男性試飲者視力改善情況相較于女性試飲者效果更加明顯，并且見效更快；而對照組中男性試飲者各癥狀幾乎沒有改善。這可能與個人生活作息、運動健身狀況以及用眼習慣息息相關(guān)，具體原因有待進一步研究。

2.2.4 藍莓原漿對受試者視疲勞癥狀改善效果總體分析 現(xiàn)代人們由于長時間暴露于電子產(chǎn)品之下，用眼時間大大延長，這就使得眼部受到氧化壓力，即氧自由基等代謝廢物不斷增加，打破了自由基間的自我調(diào)節(jié)平衡[25]。自由基具有的一個額外未配對的電子導致其的不穩(wěn)定性，同時也會給生物蛋白質(zhì)及DNA 帶來損傷[26]，反映到眼部的損害即為眼部視疲勞，其損害程度由視疲勞癥狀總積分體現(xiàn)。

由圖8 可知，食用本試驗藍莓原漿60 d 后，男女試飲者視疲勞癥狀總積分均有下降趨勢。其中男性試飲者效果顯著（P<0.05），其總積分下降了2.30。對照組在試飲前、后數(shù)據(jù)差異無明顯變化（P>0.05）。由此可見，飲用藍莓原漿后，人們整體視疲勞狀況得到了改善，藍莓原漿有助于緩解人們眼部疲勞狀況，并進一步對視力產(chǎn)生良性作用。

2.2.5 明視持久度變化 明視持久度（Duration of photopic vision）表示為明視時間與注視時間的百分比，如今被廣泛用于評價人體視疲勞程度。明視持久度越大，說明眼部狀態(tài)越好，疲勞程度越小。

由圖9 可知，經(jīng)過60 d 的試飲期后，試飲組明視持久度增加。女生明視持久度由0.58±0.08 增加至0.61±0.07；男生明視持久度增加更為顯著（P<0.05），由0.52±0.05 增加至0.65±0.06，說明藍莓原漿對試飲組同學視疲勞狀況起到了良好的改善作用，并在男性群體中體現(xiàn)更為顯著。

圖9 藍莓原漿對明視持久度的影響Fig. 9 Effects of blueberry pulp on duration of photopic vision

3 結(jié)論

本試驗以原花青素含量為11.6 g/L 的藍莓原漿為研究對象，經(jīng)動物實驗與人體試飲試驗表明高劑量藍莓原漿（花青素含量為250 mg/kg）攝入可以提高小鼠體內(nèi)SOD 酶活力同時顯著降低MDA 含量；低劑量藍莓原漿（花青素含量為100 mg/kg）攝入可對小鼠體內(nèi)CAT 酶活力的增強起明顯促進作用；人體試飲本試驗藍莓原漿60 d后，試飲組視疲勞癥狀及明視持久度均得到良好改善，并在男性群體中體現(xiàn)出顯著性。綜上，長期食用藍莓原漿有助于提高機體抗氧化能力，進而可以達到保護視網(wǎng)膜，緩解視疲勞的作用。