烏牛早紅茶對高脂飲食小鼠降脂功能和腸道菌群的調(diào)控作用

葉江成，趙 進，張一帆，龔明秀，俞曉平

（1 中國計量大學生命科學學院 食品營養(yǎng)與質(zhì)量安全研究所 杭州310018 2 生物計量與檢驗檢疫技術(shù)浙江省重點實驗室 杭州310018 3 特色農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與危害物控制技術(shù)浙江省重點實驗室 杭州 310018）

肥胖是一種多因素導(dǎo)致的代謝性疾病[1]，它能引起各種慢性疾病，包括心血管疾病[2]、Ⅱ型糖尿病[3]、高血壓[4]、高血脂[5]、脂肪肝[6]和癌癥[7]等。世界衛(wèi)生組織應(yīng)用身體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）來判斷個體是否肥胖，并將超重和肥胖定義為一種損害健康的疾病，體現(xiàn)為異?；蜻^多的脂肪堆積[8-9]。肥胖的本質(zhì)是基于能量代謝不平衡所造成的脂肪堆積，減少能量攝入和增加能量消耗是影響肥胖的有效方法。目前，肥胖尚無有效的治療手段，主要通過調(diào)節(jié)飲食、體育鍛煉和藥物干預(yù)[10]。肥胖治療藥物都有一定的副作用[11-12]，如導(dǎo)致營養(yǎng)吸收障礙和神經(jīng)問題等。預(yù)防或改善肥胖是當今重大的社會和科學問題?，F(xiàn)今研究人員在分子水平對天然植物產(chǎn)品進行了廣泛研究[13-14]，其健康功效已逐漸被全球消費者接受和喜愛。功能性的食品作為膳食干預(yù)肥胖比藥物治療更受歡迎。

茶葉作為天然、無毒的安全產(chǎn)品，能夠改善高膽固醇血癥[15]、高血脂癥[16]、高血糖[17]、非酒精性脂肪肝[18-19]，并具有調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)代謝的功效[20-21]。Pan 等[22]研究發(fā)現(xiàn)英紅九號紅茶能夠減少小鼠的攝食量，并可能通過LKB1/AMPK 途徑調(diào)節(jié)脂肪生成來預(yù)防肥胖。Pan 等[23]的研究發(fā)現(xiàn)紅茶多酚在預(yù)防肥胖方面比綠茶多酚更為有效，其能夠抑制脂質(zhì)和糖類物質(zhì)的吸收；通過AMPK 途徑促進脂質(zhì)代謝，抑制前脂肪細胞的分化和增殖減少脂質(zhì)積累；還能減少氧化應(yīng)激來干預(yù)肥胖及代謝綜合征。此外，大量研究[24-26]表明通過高脂飲食建立的動物肥胖模型，其腸道菌群發(fā)生了顯著變化，高脂飲食導(dǎo)致的肥胖及其代謝紊亂可能與腸道菌群組成及其相對豐度的變化有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)去咖啡堿的紅茶多酚誘導(dǎo)肥胖小鼠腸道菌群的改變和短鏈脂肪酸的增加，并促進肝臟AMPK 磷酸化水平增加，最終對于高脂飲食肥胖小鼠起到降脂減肥的作用[27]。

烏牛早是中國茶葉的地區(qū)特色品種，原產(chǎn)地是浙江永嘉縣，是中國茶類中特早發(fā)芽的品種，比西湖龍井等早1 個月，每年3 月初即可采制大量上市，深受消費者青睞。關(guān)于烏牛早紅茶的抗肥胖健康效應(yīng)研究尚未見報道，其干預(yù)肥胖及其脂質(zhì)代謝的功效機理也不清楚。本研究以高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠建立肥胖模型，探究烏牛早紅茶水提物預(yù)防高脂血癥肥胖小鼠的分子機理，以及調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的干預(yù)作用等。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏牛早鮮葉采集時間為2021 年5 月1 日，在浙江三農(nóng)茶業(yè)有限公司按照紅茶加工工藝制作而成烏牛早紅茶制品。8 周齡雄性SPF 級C57BL/6小鼠，2021 年11 月1 日購于杭州子源實驗動物科技有限公司，使用及生產(chǎn)許可證號為SYXK（浙）2018-0009。

無水乙醇（AR）、氯化鈣（AR）、氯化鈉（AR）、磷酸二氫鉀（AR）、三水合磷酸氫二鉀（AR）、十二水合磷酸氫二鈉（AR）、堿式乙酸鉛（AR）、鹽酸（AR）、硫酸（AR）、福林酚（AR）、碳酸鈉（AR）、茚三酮（AR）、苯酚（AR）、谷氨酸（AR）、甲醇（HPLC）、乙腈（HPLC）等試劑，杭州米可化工儀器有限公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（GC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）等，上海源葉生物科技有限公司；Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶生物有限公司；小鼠血清和肝組織檢測生化指標，如總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；TRIzolPlus RNA 純化試劑盒購，Thermo Fisher 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D 三溫三控水槽，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；臺式低速自動平衡離心機L400，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-5200 紫外-可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；FA1004 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；高效液相色譜，沃特世公司；美國MD 全波長酶標儀Spectra Max190，北京嘉鵬同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵，邦西儀器科技（上海）有限公司；電熱恒溫干燥箱，上海葉拓儀器儀表有限公司；超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉主要功能成分的測定 烏牛早紅茶主要成分檢測指標為：水分、水浸出物、咖啡堿、茶多酚及其兒茶素、茶黃素、游離氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白和總黃酮含量。參考方法依次分別為：GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法[28]、GB/T 8305-2013《茶水浸出物測定》[29]、GB/T 8312-2013《茶 咖啡堿測定》中的紫外分光光度法[30]、GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[31]、GB/T 30483-2013《茶葉中茶黃素的測定 高效液相色譜法》中的高效液相色譜法[32]、GB/T 8314-2013《茶游離氨基酸總量的測定》[33]、硫酸苯酚法[34]、考馬斯亮藍染色法，以及超聲輔助提取總黃酮后三氯化鋁法檢測[35]。

1.3.2 茶葉水提物的制備 參照Li 等[36]的方法，用95 ℃熱水按料液比1 ∶20 浸提烏牛早紅茶5 min，立即通過減壓抽濾水提取物并收集濾液，然后在-55 ℃條件下真空冷凍干燥24 h，制備茶水提取物凍干粉，后續(xù)根據(jù)動物實驗方案配置相應(yīng)濃度茶湯進行小鼠灌胃。

1.3.3 動物實驗方案設(shè)計 30 只8 周齡雄性C57BL/6 小鼠，統(tǒng)一安置在常規(guī)環(huán)境（12 h 光/暗循環(huán)）中，自由取食飲水適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按小鼠體質(zhì)量隨機分為3 組：正常組（NC）、模型組（MC）、烏牛早紅茶水提物干預(yù)組（WBT）；NC 組以普通飼料作為食物，MC 組和WBT 組以高脂肪飼料（D12492，含有60%脂肪熱量）作為食物；WBT 組水提物凍干粉配制液（以蒸餾水溶解）的灌胃質(zhì)量濃度為3 mg/mL，灌胃劑量為0.2 mL，NC 組和MC組灌胃等量生理鹽水，定時記錄各組小鼠的食物攝入量和體質(zhì)量變化。

1.3.4 小鼠葡萄糖耐受實驗 在小鼠飼養(yǎng)實驗第5 周，將3 組小鼠進行禁食12 h 后口服葡萄糖，觀察其耐受實驗情況。按照2 g/kg bw 劑量灌胃小鼠20%葡萄糖溶液后，分別在0，15，30，60 min 和120 min 時間點采集小鼠尾靜脈血樣，應(yīng)用羅氏血糖儀和檢測試紙條測定相應(yīng)時間點的小鼠血糖值。

1.3.5 小鼠血清和肝臟生化指標檢測 將小鼠全血經(jīng)過離心（4 ℃，3 000 r/min，10 min）得到血清樣本（-80 ℃保存），分別測定小鼠血脂和肝組織指標，如TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含 量，AST 和ALT 酶活性。

1.3.6 小鼠肝組織蘇木精和伊紅（HE）染色 參考Xu 等[37]的方法，采集小鼠肝臟同一部位，將其在中性福爾馬林緩沖液中固定24 h，石蠟包埋切片后，使用蘇木精和伊紅（HE）對切片進行染色，組織病理學觀察和分析結(jié)果。

1.3.7 實時熒光定量PCR 分析 從肝臟中提取總RNA，并使用RNase-Free DNase Set（Qiagen）來去除DNA 污染。然后使用Nanodrop 2000 紫外-可見分光光度計（Beckman）對RNA 濃度進行分光光度測量。使用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix（Thermo）將總RNA 轉(zhuǎn)化為單鏈cDNA，并使用Power SYBRGreen PCR Master Mix（Applied Biosystems）進行實時PCR。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，1 min；變性95 ℃，15 s，退火和延伸63 ℃，25 s。使用比較循環(huán)閾值（ΔΔCt）方法對各基因的相對表達水平進行統(tǒng)計分析。

1.3.8 蛋白質(zhì)印跡法 參考Li 等[38]的方法，采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析小鼠肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)表達情況。通過SuperSignalWest Dura Extended Duration Substrate 進行顯影和定影，使用Image J 1.8.0 圖像處理軟件（美國）分析條帶的光密度值，每個條帶重復(fù)3 次，目的蛋白相對表達量={目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參（光密度值）}×10n進行表示。

1.3.9 腸道菌群分析 采集小鼠結(jié)腸糞便，通過16S rRNA 基因高通量測序得到操作分類單元（OTUs）（根據(jù)16S rRNA 基因序列相似度聚類得到的一組相似的序列），通過使用Usearch 軟件（5.2 版）進行OTU 聚類分析，并對其進行分類學注釋特征性序列和微生物多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0 進行單因素方差分析，P<0.05 為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏牛早紅茶主要功能成分及其組分含量檢測

烏牛早紅茶主要功能成分及其組分含量檢測結(jié)果如表1 所示，茶多酚為（12.07±0.13）%、咖啡堿為（3.51±0.07）%、游離氨基酸為（6.16±0.10）%、可溶性糖為（1.27 ± 0.04）%、總黃酮為（0.70 ±0.01）%、可溶性蛋白為（2.76±0.08）%、水分含量為（4.19 ± 0.02）g/100 g、水浸出物為（39.99 ±0.35）%。

表1 烏牛早紅茶主要功能成分及其組分含量檢測結(jié)果Table 1 Main functional components content of Wuniu Zao black tea

由于紅茶制作工藝的不同，兒茶素含量較少，總量僅為（1.81 ± 0.05）%，其中EGCG 含量最高（0.77±0.02）%，其余成分含量依次為ECG（0.66±0.02）%，EC（0.14±0.01）%，C（0.14±0.01）%，EGC（0.12±0.01）%。茶黃素[39]是一種紅茶特有的水溶性色素，在紅茶的制作過程中，茶多酚（主要是兒茶素）類物質(zhì)首先被氧化成醌，然后進一步氧化和聚合成茶黃素。烏牛早紅茶的茶黃素總量為（0.47± 0.80）%，其中含量最高的是TF-3-G（0.22 ±0.25）%，其余成分含量依次為TFDG（0.11 ±0.25）%、TF-3'-G（0.07 ± 0.15）%、TF（0.05 ±0.02）%。

2.2 WBT 對肥胖小鼠體質(zhì)量、能量攝入量、臟器指數(shù)和Lee’s 指數(shù)的影響

由圖1 和表2 可知，經(jīng)過9 周高脂飲食C57BL/6 小鼠肥胖模型造模成功。圖1 為小鼠及其肝組織、附睪白色脂肪、體質(zhì)量和能量攝入結(jié)果，表明NC、MC 和WBT 共3 組小鼠在體型、肝臟和附睪白色脂肪的大小具有明顯的區(qū)別。MC 組小鼠肝臟呈現(xiàn)異常的灰色和肝臟腫大，這是由于MC 組小鼠長期高脂飲食導(dǎo)致肝臟脂肪變性；而WBT 組小鼠肝臟與NC 組相似，這表明在WBT 的干預(yù)下，高脂飲食導(dǎo)致的小鼠肝臟脂肪變性有被抑制的作用。小鼠的肝臟系數(shù)顯示MC 組的肝臟指數(shù)顯著大于NC 組和WBT 組（P<0.05），也證實了WBT 具有改善小鼠肝臟脂肪變性和肝臟腫大的作用。

圖1 小鼠體型、肝組織、附睪白色脂肪組織、體質(zhì)量、能量攝入量的變化Fig. 1 Changes in body size，liver tissue，epididymal white adipose tissue，body weight，and energy intake of mice

表2 小鼠的臟器指數(shù)、Lee's 指數(shù)、初始體質(zhì)量、最終體質(zhì)量和增加體質(zhì)量Table 2 Organs index，Lee's index，initial body weight，final body weight and weight gain of mice in each group

表2 為小鼠的臟器指數(shù)、Lee’s 指數(shù)、初始體質(zhì)量、最終體質(zhì)量和增加體質(zhì)量。由表2 可以得到結(jié)果，高脂飼料能夠顯著增加小鼠（C57BL/6）的體質(zhì)量（P<0.05），MC 的小鼠終體質(zhì)量遠高于NC 的終體質(zhì)量（P<0.05），WBT 的小鼠最終體質(zhì)量也與MC 具有顯著差異（P<0.05）。圖1c 為3 組小鼠每日能量攝入量，MC 組遠高于NC 組和WBT 組。另外，由表2 中小鼠心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和Lee’s 指數(shù)結(jié)果，均顯示MC 和NC 具有顯著差異（P<0.05），而WBT 小鼠的心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和Lee’s 指數(shù)也與MC 組具有顯著差異性（P<0.05），說明WBT 能夠抑制高脂飲食導(dǎo)致的臟器脂肪變性增加，有效干預(yù)高脂飲食引起的小鼠體重和臟器脂肪增加的趨勢。

2.3 WBT 對肥胖小鼠葡萄糖耐受的影響

高脂飲食的小鼠和肥胖患者一樣往往具有葡萄糖耐受功能受損的現(xiàn)象。為探究WBT 調(diào)節(jié)血糖水平效應(yīng)，在小鼠飼養(yǎng)實驗第5 周進行口服葡萄糖耐量實驗。表3 為口服20%葡萄糖溶液后各組小鼠的血糖含量變化以及曲線下面積（AUC）。

表3 口服20%葡萄糖溶液后各組小鼠血糖變化以及曲線下面積（AUC）Table 3 Blood glucose changes and area under curve（AUC）of mice in each group after oral administration of 20% glucose solution

如表3 所示，MC 組小鼠的初始血糖含量與NC 組和WBT 組初始血糖含量具有顯著差異（P<0.05），小鼠在口服20%葡萄糖溶液后，在第15，30，60 分鐘和120 分鐘的血糖含量均與NC 組和WBT 組具有顯著差異性（P<0.05）。相對于單點的血糖值，糖耐曲線下面積能更全面清晰地分析血糖變化的程度，MC 組小鼠的AUC 遠大于NC組（P<0.05），說明MC 組的小鼠糖耐受受損顯著，WBT 具有顯著降低高脂飼料飲食誘導(dǎo)的小鼠血糖水平和延緩AUC 增加的能力（P<0.05）。分析結(jié)果表明高脂飲食能引起小鼠葡萄糖耐受功能受損，糖脂代謝過程失衡，WBT 能顯著改善糖脂代謝水平，具有干預(yù)高脂飲食對小鼠造成的葡萄糖不耐受癥狀的能力。

2.4 WBT 對肥胖小鼠血清生化指標的影響

小鼠血清的生化指標含量檢測結(jié)果如圖2 所示。MC 組小鼠血清中血脂指標（TC、TG 和LDLC）和肝功能指標（AST 和ALT 酶活性）上升明顯，與NC 組相比差異顯著（P<0.05）；與MC 組相比，WBT 組小鼠血清指標如TC、TG 和LDL-C 含量皆表現(xiàn)顯著性降低（P<0.05）。血清中的HDL-C 含量在3 組間無顯著性差異，WBT 雖然增加了高脂飲食肥胖小鼠血清中的HDL-C 水平，但是無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。同時，與MC 組相比，WBT 小鼠肝組織生化指標AST 和ALT 的含量顯著性降低（P<0.05），表明WBT 能夠有效抑制高脂飲食肥胖小鼠的血脂水平增加趨勢，具有改善高脂飲食導(dǎo)致的小鼠肝損傷癥狀的作用。

圖2 小鼠血清生化指標的檢測結(jié)果Fig. 2 Detection results of serum biochemical indexes in mice

2.5 WBT 對肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

如圖3a 為小鼠肝臟組織切片的HE 染色結(jié)果，NC 組小鼠肝臟切片中細胞的染色狀態(tài)紅藍清晰，細胞形態(tài)完整；MC 組的小鼠肝細胞排列不整齊，細胞之間存在較大體積的脂肪小空泡，可以觀察部分明顯固縮的細胞核；WBT 組小鼠肝臟切片顯示肝細胞排列較整齊，主要表現(xiàn)為細胞之間脂肪空泡尺寸明顯縮小，表明WBT 明顯抑制了高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟的脂肪累積。實驗小鼠肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果如上圖3c 所示：3 組樣品中6 個基因表達量兩兩之間都表現(xiàn)為差異性極顯著（P<0.05），高脂飲食顯著增加了基因如SREBP1c、FAS、ACC1 和SCD1 的轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05）；并且結(jié)果還表明CD36 和PAI-1 相對表達量顯著增加（P<0.05）。SREBP1c、FAS、ACC1 和SCD1 在脂肪酸合成過程中均發(fā)揮重要作用，結(jié)果表明WBT 能夠有效降低脂肪酸調(diào)控基因SREBP1c、FAS、ACC1 和SCD1的表達量（P<0.05）。CD36 是一種重要跨膜糖蛋白，主要功能為促進長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運，在WBT 組肝組織中的轉(zhuǎn)錄水平降低顯著（P<0.05）；另外，WBT 組小鼠肝組織與代謝綜合征和動脈粥樣硬化形成相關(guān)的PAI-1 基因轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)顯著性降低（P<0.05）。結(jié)果表明WBT 能明顯調(diào)控脂質(zhì)代謝基因的表達水平，進而保護高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝組織繼續(xù)發(fā)揮正常代謝功能，并且具有明顯的降脂減肥功效。圖3b 和3d 結(jié)果顯示MC 組小鼠肝組織SREBP1、FAS、ACC1 和p-ACC1 蛋白表達水平顯著高于NC，同時印證了WBT 的抑制蛋白質(zhì)表達增加作用，WBT 組小鼠肝組織SREBP1C、FAS 和ACC1 蛋白水平，與MC 組相比，具有相應(yīng)降低趨勢，并伴隨著ACC1 磷酸化（p-ACC1）水平升高，抑制了肝臟中的脂肪酸合成和脂肪生成，達到減少小鼠肝臟脂質(zhì)積累的作用，這與之前文獻報道研究結(jié)果具有一致性[36]。

圖3 肥胖小鼠脂質(zhì)代謝通路信號變化Fig. 3 Changes of signal of lipid metabolism pathway in obese mice

2.6 WBT 對肥胖小鼠腸道菌群的影響

為了探究WBT 對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用，本研究基于Illumina Novaseq 測序平臺對小鼠結(jié)腸段糞便進行高通量測序分析（16S rRNA）。將3 組18 個樣品高通量測序所得的原始序列經(jīng)過質(zhì)控得到高質(zhì)量序列，使用USEARCH 10.0 進行OTUs 聚類劃分（相似性97%水平），共得到668 個OTUs，如圖4 為3 組小鼠腸道菌群的差異性展示。NC、MC 和WBT 小鼠3 組中共有238 個相同OTUs；此外，NC 組有93 個特有OUTs，MC 組有70 個特有OUTs，WBT組有56 個特有OUTs，說明3 組小鼠腸道菌群整體差異性較大，MC 組和WBT 組都具有影響小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的能力。

圖4 OTUs 韋恩圖Fig. 4 OTUs venn diagram

小鼠腸道菌群的Alpha（α）多樣性分析結(jié)果如圖5a，基于Chao 豐富度估計量（Chao1 richness estimator）的 結(jié)果顯示，與NC 組相比，MC 組Chao1 指數(shù)明顯降低（P<0.05），表明MC 組腸道菌群的相對豐度下降，而WBT 組Chao1 指數(shù)與MC組相比有顯著上升（P<0.05）。如圖5b 所示，MC 組香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon-wiener diversity index）與NC 組相比也表現(xiàn)出明顯下降的趨勢（P<0.05），說明MC 組腸道菌群的多樣性顯著減少了，WBT 組香農(nóng)指數(shù)顯著上升（P<0.05），WBT 能提高高脂飲食小鼠腸道菌群的多樣性。

圖5 3 組小鼠腸道菌群多樣性的影響Fig. 5 Effects of gut microbiota diversity in 3 groups of mice

此外，基于主成分分析（Principal component analysis，PCA）和主坐標分析（Principal coordinat analysis，PcoA）的Beta（β）多樣性分析表明，PCA（PC1 和PC2 分別占小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)總體差異的38.68%和13.67%）如圖5c 所示，發(fā)現(xiàn)MC 組小鼠腸道菌群離散程度極大，與NC 組整體分布明顯不同，具有較大的組間差異性，說明高脂飲食誘導(dǎo)小鼠腸道菌群發(fā)生了變化，WBT 組小鼠腸道菌群與MC 組相比，離散程度變小，在整體分布上與NC 組差距較大，一定程度上改善了高脂飲食小鼠腸道菌群的變化。如圖5d 所示，PcoA（PC1 和PC2分別占腸道菌群結(jié)構(gòu)總體差異的55.47%和22.29%）結(jié)果表明，各組腸道菌群在圖5 中呈現(xiàn)分散分布，整體分布差異較大，WBT 組離NC 組更近，其小鼠腸道菌群在x 軸方向上的投影往NC組移動，說明在WBT 的干預(yù)下高脂飲食小鼠的腸道菌群有正?；内厔?。

基于分類學對OTUs 進行注釋對小鼠腸道菌群在門水平的相對分布進行分析（圖6），3 組小鼠腸道菌群相對豐度顯著不同，NC 組小鼠腸道菌群的優(yōu)勢菌群主要是擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高脂飲食的影響下擬桿菌門、放線菌門和變形菌門等3 種菌的相對豐度明顯下降，其中擬桿菌門和變形桿菌門兩種菌的相對豐度下降顯著（P<0.05），厚壁菌門相對豐度增加顯著（P<0.05）。除NC 組的優(yōu)勢菌之外，還發(fā)現(xiàn)脫硫菌門（Desulfobacterota）和彎曲桿菌門（Compylobacterota）的相對豐度也得到了明顯增加。經(jīng)過WBT 干預(yù)，高脂飲食小鼠腸道菌群中厚壁菌門相對豐度的上升趨勢得到了緩解，并顯著提高了擬桿菌門相對豐度（P<0.05）。

圖6 3 組小鼠腸道菌群相對豐度的變化趨勢Fig. 6 Trend of relative abundance of gut microbiota in 3 groups of mice

圖7 高脂飲食對小鼠腸道菌群功能豐度的影響Fig. 7 Effects of high-fat diet on functional abundance of gut microbiota in mice

圖8 WBT 對小鼠腸道菌群功能豐度的影響Fig. 8 Effects of WBT on functional abundance of gut microbiota in mice

3 討論

肥胖是多因素導(dǎo)致的代謝性疾病，本研究以高脂飲食C57BL/6 小鼠作為肥胖模型，經(jīng)過9 周高脂飲食誘導(dǎo)，并同時設(shè)立WBT 干預(yù)組。實驗結(jié)果表明，MC 組小鼠具有和前人研究[40-41]相似的結(jié)果：高脂飲食肥胖小鼠有高血脂和肝功能受損的癥狀，其體質(zhì)量、臟器指數(shù)和Lee’s 指數(shù)顯著升高（P<0.05），血糖、每日能量攝入明顯提高，糖耐受功能顯著受損，肝臟腫大并伴有脂肪變性，血清中的TC、TG、LDL-C 含量、AST 和ALT 酶活性均顯著性提高（P<0.05），表明MC 組C57BL/6 小鼠肥胖模型造模成功。

本研究發(fā)現(xiàn)WBT 組小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)和Lee’s 指數(shù)與MC 組相比顯著下降（P<0.05），血糖、每日能量攝入明顯減弱，糖耐受受損、肝臟腫大和肝臟脂肪變性得到了有效的緩解；LDL-C 被稱為"壞的膽固醇"，主要負責把合成的膽固醇運輸?shù)綑C體全身的其它組織，HDL-C 的功能與LDL-C 相反，主要功能是把機體外周組織的膽固醇運回肝臟中進行分解，血清中LDL-C 和HDLC 含量與肥胖的并發(fā)癥（動脈粥樣硬化、心血管疾病和冠心?。┫嚓P(guān)[42-44]，WBT 組小鼠血清中血脂（TC、TG 和LDL-C）水平均顯著性降低（P<0.05），HDL-C 水平雖有降低但是無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明肥胖小鼠的高脂血癥在WBT 的干預(yù)下具有明顯的改善效果。AST 和ALT 作為血清的常規(guī)指標能夠反應(yīng)肝功能是否受損[45]，WBT 組小鼠血清AST 和ALT 酶活性顯著下降（P<0.05），顯示W(wǎng)BT 具有能夠改善肥胖小鼠的肝功能受損作用，表明WBT 能夠有效干預(yù)和抑制高脂飲食導(dǎo)致的小鼠肥胖癥狀。

本研究檢測了小鼠肝臟中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的6 個基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。SREBP1c 屬于SREBP 轉(zhuǎn)錄因子家族[46]，在肝臟和脂肪中有著較高的表達，具有激活A(yù)CC、FAS 和SCD，在機體的肝臟脂質(zhì)代謝中起了重要作用。ACC 作為脂肪生成限速酶，還能夠起阻止脂肪酸進入線粒體進行脂肪酸氧化的作用，具有治療肝臟脂肪變性的重大潛力。FAS 和SCD 都是機體脂質(zhì)代謝的重要因子，都能夠?qū)C體的肥胖產(chǎn)生影響。CD36 是小鼠肝臟內(nèi)的脂肪酸轉(zhuǎn)運酶，與小鼠的內(nèi)臟肥胖、胰島素抵抗和非酒精性脂肪肝等疾病有關(guān)[47-48]。Henning 等[49]研究結(jié)果表明脫咖啡堿的紅茶提取物能顯著誘導(dǎo)高脂小鼠的CD36 基因表達水平下調(diào)。學者研究[50-52]發(fā)現(xiàn)PAI-1 在肥胖患者中表達水平增加，能促進脂肪組織炎癥的發(fā)展，并加劇高脂飲食導(dǎo)致的肥胖的代謝紊亂。本研究中MC 組小鼠由于高脂飲食的原因，相關(guān)脂質(zhì)代謝基因（SREBP1c、FAS、ACC1、SCD1、CD36 和PAI-1）轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)（P<0.01），并通過免疫印跡技術(shù)分析肝臟中脂肪生成相關(guān)蛋白（SREBP1、FAS、ACC1、p-ACC1）表達水平，結(jié)果顯示蛋白表達水平與相應(yīng)的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平具有一致的調(diào)控趨勢，SREBP1、FAS 和ACC1 的蛋白含量提高顯著（P<0.05），而p-ACC1 蛋白水平降低顯著（P<0.05），p-ACC1/ACC1 的蛋白相對比值也顯著降低（P<0.05），表明MC 組小鼠肝臟脂質(zhì)合成增加。WBT 組CD36 和PAI-1 的基因轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)顯著降低趨勢（P<0.05），降低了小鼠肥胖及其代謝紊亂風險。此外，WBT 組小鼠肝臟中SREBP1C、FAS和ACC1 蛋白表達水平和mRNA 轉(zhuǎn)錄水平都體現(xiàn)為顯著性降低趨勢（P<0.05），并伴隨著ACC1 磷酸化（p-ACC1）水平升高，抑制了肝臟中的脂肪酸合成，減少小鼠肝臟脂質(zhì)積累的作用。結(jié)果表明WBT 對于肥胖小鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)控具有明顯的改善作用。

肥胖在世界范圍內(nèi)的迅速增長已經(jīng)成為了健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，近年來，腸道菌群的對于肥胖的影響已成為研究熱點[53-54]。普洱茶、茯磚茶、綠茶、茶多酚和褐茶褐素等多種茶葉及其活性成分，通過調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道菌群的相對豐度，進而影響小鼠機體內(nèi)的脂質(zhì)代謝通路達到抑制機體肥胖作用[55-58]。在人類的腸道微生物區(qū)系中主要細菌門是擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門，其中最多的是厚壁菌門和擬桿菌門，約占腸道細菌的90%[59]，各菌群之間和菌群與宿主之間在健康宿主的腸道中會形成一個動態(tài)的平衡，擬桿菌和厚壁菌這兩種優(yōu)勢菌因為和肥胖的發(fā)展有關(guān)被定義為肥胖性腸道微生物[60]。這兩種菌的相對豐度與體質(zhì)量增加、腸道炎癥和肥胖的發(fā)展息息相關(guān)，厚壁菌門和擬桿菌門的比值（F/B）可以作為肥胖腸道菌群紊亂的生物標志物[61-63]。F/B 的值在高脂飲食的作用下異常上升，導(dǎo)致宿主能量代謝失衡并引起肥胖代謝綜合征發(fā)病率的增加[64]。分析本實驗小鼠腸道菌群的菌群豐度和組成，結(jié)果顯示腸道菌群在門水平存在顯著性差異（P<0.05）。高脂飲食導(dǎo)致小鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度發(fā)生了顯著變化，WBT 通過顯著增加厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度，并且降低厚壁菌門和擬桿菌門的比值，表明WBT 可能通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的相對豐度和多樣性，改善了高脂飲食造成的小鼠腸道菌群紊亂，緩解了肥胖癥狀。

為了探究不同組小鼠腸道菌群的功能基因在代謝途徑上的差異和變化，將高通量測序所得的OTUs 經(jīng)過分類學注釋后所獲得的物種組成與KEGG PATHWAY 數(shù)據(jù)庫進行比對，并在其綱水平進行功能注釋。將NC 組與MC 組進行STAMP差異性分析[65]，使用Welch's-t-test 檢驗發(fā)現(xiàn)，高脂飲食改變了小鼠腸道菌群的部分功能豐度，共有28 個功能豐度發(fā)生了顯著變化，分別體現(xiàn)為18 個功能豐度顯著增加，10 個功能豐度顯著下降。這些變化主要涉及脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝等代謝通路以及心血管疾病、免疫疾病和內(nèi)分泌和代謝疾病等復(fù)雜疾病，此外機體的一些運輸、膜轉(zhuǎn)運功能也發(fā)生了變化。由此可見，高脂飲食改變了小鼠腸道菌群的代謝功能。WBT 的干預(yù)結(jié)果表明WBT 顯著影響了高脂飲食小鼠17個腸道菌群的功能豐度，其中13 個功能豐度增加，4 個功能豐度下降，功能豐度的變化也主要涉及了脂質(zhì)、核苷酸、氨基酸等代謝通路，這與周方等[66]的研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明WBT 的功能成分經(jīng)過腸道菌群的代謝之后，改變了腸道菌群的相對豐度，可能通過這種干預(yù)來改變腸道菌群的生物代謝功能，進而調(diào)控小鼠的脂質(zhì)代謝通路，從而達到緩解肥胖的作用。

4 結(jié)論

烏牛早紅茶作為一種天然植物膳食，具有降脂減肥的巨大潛力，它可以抑制高脂飲食小鼠體質(zhì)量的增加和脂質(zhì)的累積，改善肝臟脂肪變性和糖耐受受損，并通過調(diào)控脂質(zhì)代謝來減少脂肪酸的合成。此外WBT 的干預(yù)還可以通過改善腸道菌群的多樣性和豐度來調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠腸道菌群的紊亂，特別是對于厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度的調(diào)節(jié)，進而干預(yù)小鼠肥胖及其相關(guān)代謝。