楊屬派間5個(gè)種特異性InDel引物及在派間雜交子代鑒別中的應(yīng)用*

戴曉港 韓峭子 尹佟明

（林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 林木遺傳與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省林木遺傳和高效培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 南京 210037）

楊樹(shù)(Populus)是楊柳科(Salicaceae)楊屬樹(shù)種的統(tǒng)稱，因其生長(zhǎng)快，適應(yīng)性強(qiáng)，木材用途廣，被廣泛應(yīng)用于生態(tài)防護(hù)林和用材林建設(shè)。第九次全國(guó)森林資源清查數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)現(xiàn)有楊樹(shù)人工林757.1萬(wàn)hm2，是世界上楊樹(shù)人工林面積最大的國(guó)家(國(guó)家林業(yè)和草原局, 2019)。目前，我國(guó)楊樹(shù)人工林推廣的楊樹(shù)良種主要是通過(guò)常規(guī)雜交育種培育，現(xiàn)代生物技術(shù)也為實(shí)現(xiàn)楊樹(shù)精準(zhǔn)高效育種提供了新的契機(jī)，但雜交育種仍然是目前及今后更長(zhǎng)時(shí)間培育楊樹(shù)新品種的重要手段(李善文等, 2004; 陳贏男等, 2022)。楊屬全世界共有85種，Eckenwalder(1996)根據(jù)楊樹(shù)形態(tài)學(xué)特性和種間雜交的可交配性，將楊屬分為5個(gè)派，分別是白楊派(Sect.Leuce)，青楊派(Sect.Tacamahaca)，大葉楊派(Sect. Leucoides)，黑楊派(Sect.Aigeiros)和胡楊派(Sect. Turanga)。楊屬派內(nèi)種間雜交容易，黑楊派和青楊派、黑楊派和大葉楊派之間在自然條件下也容易產(chǎn)生天然雜種，但其余派間存在生殖隔離(Eckenwalder, 1996)。為了拓寬楊樹(shù)雜交育種親本的遺傳基礎(chǔ)，聚合不同樹(shù)種間的優(yōu)良基因，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)花粉蒙導(dǎo)法、化學(xué)試劑熏蒸柱頭法、胚拯救等措施克服了楊屬派間雜交的生殖隔離，獲得了楊屬遠(yuǎn)緣雜交子代(Zhanget al., 2005; 彭儒勝等, 2013; 彭儒勝, 2018)。20世紀(jì)50—60年代，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院的育種工作者以小葉楊(P. simonii)為母本與歐洲黑楊(P. nigra)雜交，并選育了小黑楊(Populus ×xiaohei)。徐緯英(1958)開(kāi)展了山楊×小葉楊、毛白楊×小葉楊等雜交試驗(yàn)，證實(shí)了青楊派與白楊派之間的可配性。董天慈（1980）在20世紀(jì)60年代也進(jìn)行了楊屬不同派間的雜交，其中以小葉楊為母本與父本胡楊(P. euphratica)雜交，獲得了青楊派和胡楊派的雜交子代，選育的小胡楊2號(hào)(P. simonii×P.euphratica)于2020年也通過(guò)了國(guó)家良種認(rèn)定。彭儒勝等(2013)利用正己烷熏蒸美洲黑楊(P. deltoides)柱頭，分別與胡楊和山楊(P. davidiana)雜交，獲得了黑楊派和胡楊派、黑楊派和白楊派的派間雜交個(gè)體。

楊樹(shù)雜交通常采用套袋隔離授粉，在雜交過(guò)程中易受到和母本同種的花粉污染；在采用花粉蒙導(dǎo)時(shí)，如果花粉沒(méi)有徹底失去活力，也會(huì)導(dǎo)致同種花粉的污染。因此，對(duì)種間雜交子代的真實(shí)性鑒定是進(jìn)行雜種選育的基礎(chǔ)。形態(tài)學(xué)鑒定是最直接的方法，但種間雜交子代一般會(huì)出現(xiàn)偏母本型、偏父本型和中間型，且表型性狀受環(huán)境條件的影響而性狀表現(xiàn)不同(彭儒勝等, 2013)。分子標(biāo)記是以遺傳物質(zhì)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)，可以直接反映遺傳物質(zhì)在DNA水平上的差異，為種間雜交子代的鑒別提供了快速、準(zhǔn)確的手段。李毅等(2002)、張玉平等(2015)和李曉宇等(2019)等分別利用RAPD、AFLP標(biāo)記鑒定楊屬種間雜交子代的真實(shí)性，但上述顯性標(biāo)記易受外源DNA污染，穩(wěn)定性和重復(fù)性差。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，SNP分子標(biāo)記成為第三代分子標(biāo)記，和其他分子標(biāo)記相比，SNP分子標(biāo)記具有分布均勻廣泛、遺傳穩(wěn)定性高、二等位基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果易于判讀等特點(diǎn)，而被廣泛用于植物的遺傳多樣性分析、品種鑒別等(賈會(huì)霞等, 2015; 黃承玲等, 2021)。本研究基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，開(kāi)發(fā)楊屬5派之間5種楊樹(shù)種特異性InDel分子標(biāo)記，為鑒別楊屬派間雜交子代的真實(shí)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美洲黑楊、山楊、小葉楊、大葉楊(P.lasiocarpa)和胡楊，分別來(lái)源于楊屬黑楊派、白楊派、青楊派、大葉楊派和胡楊派。其中美洲黑楊自然群體材料收集于江蘇省泗洪縣半城馬浪湖林場(chǎng)有限公司美洲黑楊種質(zhì)資源庫(kù)，每個(gè)半同胞家系只選取1株，共取53株；山楊和小葉楊自然群體個(gè)體于2020年4月采集于青海省互助縣北山林場(chǎng)大通河流域，每個(gè)樹(shù)種各采集樣品100份；大葉楊自然群體40個(gè)個(gè)體采集于湖北恩施太陽(yáng)河鄉(xiāng)；四川大學(xué)馬濤提供的25份胡楊來(lái)源于新疆維吾爾自治區(qū)塔里木河流域。小胡楊2號(hào)由北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王君提供；黑胡楊(P. deltoides×P. euphratica)由遼寧省楊樹(shù)研究所彭儒勝提供；美洲黑楊和小葉楊的種間雜交個(gè)體黑小楊(P. deltoides×P. simonii)來(lái)源于泗洪縣半城馬浪湖林場(chǎng)有限公司美洲黑楊種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測(cè) 使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根DP320)提取楊樹(shù)基因組DNA。取約0.1 g新萌發(fā)的幼嫩葉片放入2 mL離心管，同時(shí)在離心管中加入10粒氧化鋯珠(d=3 mm)，投入液氮中冷凍后，利用Tissuelyser32組織破碎儀，50 Hz研磨30 s，然后迅速向離心管中加入裂解液。參照試劑盒操作步驟提取DNA，使用前在裂解液中加入6 μL巰基乙醇以防止樣品氧化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA濃度，根據(jù)測(cè)定濃度將DNA稀釋至20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?。? μL稀釋后的DNA，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的完整性，電壓5 V·cm-1，電泳時(shí)間25 min。

1.2.2 InDel引物在不同種楊樹(shù)中通用性的電子檢測(cè)將在美洲黑楊和小葉楊中設(shè)計(jì)的特異性InDel引物(戴曉港等, 2021)，首先采用SeqHunter2(Yeet al.,2012)的默認(rèn)參數(shù)比對(duì)到胡楊基因組 (Maet al., 2014)，與胡楊基因組序列完全匹配或僅存在一個(gè)堿基差異，且比對(duì)上基因組的片段與引物設(shè)計(jì)的目的片段長(zhǎng)度差異不大于50 bp，則默認(rèn)為引物是在胡楊中通用；依此類(lèi)推，將胡楊中通用的引物比對(duì)到山楊基因組，再將在山楊中通用的引物比對(duì)到小葉楊基因組，最后再將小葉楊中通用的引物比對(duì)到大葉楊基因組，獲得楊屬不同派5個(gè)種的通用性引物。

1.2.3 通用性InDel引物驗(yàn)證及種內(nèi)保守引物篩選根據(jù)引物通用性電子檢測(cè)結(jié)果，在不同染色體上共選取48對(duì)引物送至南京金斯瑞生物工程有限公司合成。從楊樹(shù)5個(gè)派中各選取1個(gè)DNA對(duì)合成引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系10 μL：1 μL 10×Buffer，2 μL 20 ng·μL-1DNA，0.4 μL 2.5 mM dNTP，2 μL 2 μmol·L-1primer，0.5 U ExTaq(Takara)，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL。PCR擴(kuò)增所用儀器為ABI 9700 PCR system，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，58 ℃ 引物退火30 s，72 ℃延伸30 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min，25 ℃保存。采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)引物通用性及多態(tài)性，電泳電壓180 V，電泳時(shí)間90 min，篩選出在楊屬5個(gè)派的5個(gè)不同種中都能成功擴(kuò)增且種間存在差異的引物。

1.2.4 種間多態(tài)引物在種內(nèi)的保守性驗(yàn)證 從楊屬5個(gè)派的5個(gè)種的自然群體材料中，每個(gè)樹(shù)種取15個(gè)不同個(gè)體的DNA等量混合，然后利用1.2.3中篩選出的條帶清晰且種間存在差異的引物，對(duì)每個(gè)樹(shù)種的混合DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為10 μL：1 μL 10×Buffer，2 μL 20 ng·μL-1DNA，0.2 μL 2.5 mM dNTP，1.0 μL 10 μmol·L-1Fluorescein-12-dUTP，2 μL 2 μmol·L-1正向和反向引物，0.5 U ExTaq，ddH2O補(bǔ)齊至10 μL；擴(kuò)增程序同1.2.3。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送南京生工生物工程有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。對(duì)于種內(nèi)保守、種間存在差異的引物，再對(duì)5個(gè)種的自然群體材料每個(gè)樹(shù)種各24個(gè)個(gè)體進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送南京生工生物工程有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型，進(jìn)一步檢測(cè)引物在各個(gè)種中的特異性。

1.2.5 種特異性引物進(jìn)行雜交子代鑒別 選用上述篩選出的種間存在差異、種內(nèi)保守的引物2對(duì)，分別對(duì)美洲黑楊×胡楊雜交子代黑胡楊、小葉楊×胡楊雜交子代小胡楊2號(hào)以及美洲黑楊×小葉楊雜交子代黑小楊進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，驗(yàn)證楊樹(shù)種特異性引物用于3個(gè)種間雜交子代鑒別的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel引物在楊屬5個(gè)派間的通用性分析

從美洲黑楊和小葉楊差異InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物數(shù)據(jù)庫(kù)中(戴曉港等, 2021)，隨機(jī)選取5 000對(duì)引物(引物序列已上傳至https://doi.org/10.6084/m9.figshare.23550081.v2)。將上述引物首先比對(duì)到胡楊基因組，通過(guò)篩選獲得1 437對(duì)胡楊中是通用的引物；將這些在胡楊中通用的引物比對(duì)山楊基因組，獲得616對(duì)在山楊中通用的引物；再將山楊中通用的引物比對(duì)到小葉楊基因組，得到498對(duì)在小葉楊中的通用性引物；最后將這些引物再比對(duì)到大葉楊基因組，獲得341對(duì)在大葉楊中通用引物。這341對(duì)引物分別比對(duì)胡楊、山楊、小葉楊和大葉楊基因組，理論上這些引物在楊屬5個(gè)派的5個(gè)種中都可以通用。從不同染色體上選取引物合成，在楊樹(shù)19條染色體的其中16條染色體上共選擇了48對(duì)引物，用于引物種特異性試驗(yàn)驗(yàn)證(表1)。

2.2 InDel引物通用的驗(yàn)證

分別從楊屬5個(gè)派的5個(gè)種中取1個(gè)DNA對(duì)上述引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)引物在不同派楊樹(shù)中的通用性(圖1)。經(jīng)過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)43對(duì)引物在楊樹(shù)5個(gè)派的5個(gè)種中均能成功擴(kuò)增，引物通用率達(dá)89.6%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)SeqHunter2的通用性檢測(cè)，可有效提高引物的通用性。在這43對(duì)引物中，共有19對(duì)引物在5個(gè)種中擴(kuò)增條帶清晰且在不同種間存在片段大小的差別，如圖1中的Chr13_10582756、Chr14_8116923、Chr14_8116975、Chr16_23377014和Chr16_4159851等。

圖1 InDel引物在楊屬5個(gè)派中的通用性Fig. 1 Universality of InDel primers in five section of Populus

2.3 通用性引物種內(nèi)保守性初步篩選

對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)在5個(gè)派的5個(gè)種中均能成功擴(kuò)增且不同種間存在長(zhǎng)度差異的引物，再用美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊自然群體各15個(gè)個(gè)體等量混合的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)引物在種內(nèi)的保守性及種間的多態(tài)性（圖2）。經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，引物Chr10_612702在胡楊中能擴(kuò)增出126 bp和151 bp 2個(gè)片段，由于使用混合DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因此不能準(zhǔn)確判斷這2個(gè)片段是否在胡楊每個(gè)個(gè)體中均為特有，這樣的引物則被淘汰。而引物Chr13_10582756在楊屬5個(gè)派的5個(gè)種15個(gè)DNA混和樣品中均只能擴(kuò)增出單1條帶，且種間存在長(zhǎng)度差異，說(shuō)明這對(duì)引物擴(kuò)增位點(diǎn)在種內(nèi)不同個(gè)體之間是保守的。此外還有3對(duì)引物Chr8_9018898、Chr12_4341229和Chr13_1006589也在每個(gè)種的混合DNA中均只能擴(kuò)增出1個(gè)條帶，且不同種間存在長(zhǎng)度差異，這些引物用于下一步采用自然群體單個(gè)DNA進(jìn)行種內(nèi)保守性和種間差異性驗(yàn)證。

圖2 混合DNA檢測(cè)InDel引物在楊屬5個(gè)派中的保守性Fig. 2 Conservation of InDel primers tested by mixed DNA in five section of Populus

2.4 物種特異性引物篩選

對(duì)混合DNA檢測(cè)在種內(nèi)保守、種間存在差異的Chr8_9018898、Chr12_4341229、Chr13_1006589和Chr13_10582756引物，分別從美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊的自然群體材料中各取24個(gè)不同個(gè)體，對(duì)每個(gè)樣品單獨(dú)擴(kuò)增，進(jìn)一步進(jìn)行種內(nèi)保守性和種間差異性檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上述4對(duì)引物中，只有Chr12_4341229和Chr13_10582756在每個(gè)派的樹(shù)種中擴(kuò)增的條帶均為保守序列，且不同種間存在長(zhǎng)度差異。引物Chr12_4341229在美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊中均只能擴(kuò)增出1個(gè)位點(diǎn)，條帶大小分別為148、152、152、159和113 bp (圖3)。引物Chr13_10582756在美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊中也均只能擴(kuò)增出1個(gè)位點(diǎn)，條帶大小分別為140、144、140、159和116 bp (圖4)。

圖3 引物Chr12_4341229擴(kuò)增美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊自然群體Fig. 3 Partial amplification results of primer Chr12_4341229 of five different natural population of poplar species

圖4 引物Chr13_10 582 756擴(kuò)增美洲黑楊、小葉楊、大葉楊、胡楊和山楊自然群體結(jié)果Fig. 4 Partial amplification results of primer Chr13_10 582 756 of five different natural population of poplar species

2.5 種特異性引物檢測(cè)種間雜交子代的真實(shí)性

利用引物Chr12_4341229和Chr13_10582756分別對(duì)黑胡楊、小胡楊和黑小楊進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。引物Chr12_4341229在黑胡楊中可以檢測(cè)到140 bp和159 bp 2個(gè)片段，同樣引物Chr13_10582756在黑胡楊中也可以檢測(cè)到148bp和159 bp 2個(gè)片段。2對(duì)引物均檢測(cè)到2條片段，其中一條均來(lái)自美洲黑楊，而另一條則來(lái)自胡楊，這與美洲黑楊和胡楊自然群體個(gè)體檢測(cè)的結(jié)果一致，由此可判斷雜交子代為美洲黑楊和胡楊的種間雜交子代。同樣在小胡楊2號(hào)及黑小楊中，2對(duì)引物均擴(kuò)增出2個(gè)條帶，對(duì)比自然群體擴(kuò)增結(jié)果，也證實(shí)了黑小楊和小胡楊2號(hào)均為真實(shí)的派間雜交子代。

圖5 引物Chr12_4341229和Chr13_10582756檢測(cè)種間雜交子代真實(shí)性Fig. 5 Interspecific hybrids authenticity identification by primers of Chr12_4341229 and Chr13_10582756

3 討論

雜交是林木種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的重要手段和方法之一。楊屬胡楊派胡楊具有耐干旱貧瘠、耐鹽堿等特性(Maet al., 2014)，為了將耐鹽堿、耐干旱基因聚合到其他速生楊樹(shù)中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的派間雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明胡楊和楊屬其余4個(gè)派之間雜交不親和(張金鳳等, 2007; DiFazioet al., 2011)。近年來(lái)，楊樹(shù)育種學(xué)家采用花粉蒙導(dǎo)、正己烷熏蒸柱頭等措施，利用胡楊花粉分別和青楊派小葉楊、黑楊派美洲黑楊進(jìn)行雜交，獲得了派間雜交子代。但育苗時(shí)也發(fā)現(xiàn)，雜交子代一般會(huì)出現(xiàn)偏母本型、偏父本型和中間型，因此，派間雜交子代的真實(shí)性難以鑒定。分子標(biāo)記技術(shù)為楊樹(shù)遠(yuǎn)緣雜交子代的真實(shí)性鑒定提供了可能，如RAPD和AFLP等用于楊屬不同派間雜交子代鑒定，提升遠(yuǎn)源雜交真實(shí)性(江錫兵等, 2013;張玉平等, 2015; 李曉宇等, 2019)，但顯性分子標(biāo)記存在鑒定重復(fù)性差、操作復(fù)雜等缺陷。利用共顯性SSR分子標(biāo)記對(duì)以銀腺楊為母本，不同個(gè)體毛白楊混合花粉雜交子代的真實(shí)性鑒定，采用15對(duì)SSR引物對(duì)F1代個(gè)體進(jìn)行父本鑒定，鑒定率為84.1%；而對(duì)胡楊和美洲黑楊派間雜交子代的真實(shí)性鑒別時(shí)僅采用了1對(duì)SSR引物(彭儒勝等, 2013)。雖然獲得的子代也為真實(shí)的派間雜交子代，但如果供體花粉在這個(gè)SSR位點(diǎn)和母本同種的雄株相同，就會(huì)出現(xiàn)鑒別錯(cuò)誤(圖6)。物種特異性引物是進(jìn)行種間鑒別的理想標(biāo)記，如張紅蓮等(2010)通過(guò)對(duì)鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）和北美鵝掌楸（Liriodendron chinense）自然群體的篩選，開(kāi)發(fā)出一對(duì)種特異性引物，為鵝掌楸、北美鵝掌楸種間雜交子代的真實(shí)性鑒定提供了一種快速、簡(jiǎn)便穩(wěn)定的方法。戴曉港等(2021)基于美洲黑楊和小葉楊的重測(cè)序序列開(kāi)發(fā)了2對(duì)美洲黑楊和小葉楊的種特異性引物，任意1對(duì)引物均可以用于黑楊派和青楊派種間雜交子代的真實(shí)性鑒別。本研究以楊屬5個(gè)派別中的美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊自然群體為材料，開(kāi)發(fā)了2對(duì)楊屬不同種的特異性引物，可以用于楊屬5個(gè)不同派間雜交子代的鑒別，即使污染花粉來(lái)自母本同種個(gè)體，2對(duì)引物組合即可使鑒別的準(zhǔn)確率達(dá)到100%(圖6)。

圖6 常規(guī)SSR標(biāo)記和物種特異性分子標(biāo)記檢測(cè)種間雜交子代示意Fig. 6 Schematic diagram of conventional SSR and species-specific molecular marker for identification of interspecific hybrid offspring

物種特異性引物在種間雜交子代的真實(shí)性鑒別中具有鑒別準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。但由于種間雜交子代鑒別的種特異性引物開(kāi)發(fā)需要大量自然群體材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，如張紅蓮等(2010)在篩選鵝掌楸和北美鵝掌楸種特異性引物時(shí)，初步篩選的8對(duì)的引物要分別對(duì)2個(gè)樹(shù)種各30個(gè)個(gè)體進(jìn)行480個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最終篩選出1對(duì)種特異性引物。賈婕等（2014）在進(jìn)行馬尾松和濕地松種特異性引物開(kāi)發(fā)時(shí)，需要采用初步篩選的15對(duì)引物對(duì)馬尾松不同種源30個(gè)個(gè)體和濕地松不同種源31個(gè)個(gè)體單獨(dú)擴(kuò)增，共進(jìn)行915個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，也僅篩選到1對(duì)引物可以用于這2個(gè)種的種間雜交子代檢測(cè)。本研究中初步篩選的19對(duì)引物用5個(gè)樹(shù)種進(jìn)行特異性檢測(cè)時(shí)，如果按照上述研究方案需要進(jìn)行2 850個(gè)PCR反應(yīng)，但在進(jìn)行種特異性引物篩選時(shí)，將同1個(gè)種自然群體個(gè)體的DNA進(jìn)行等量混合，再采用引物對(duì)混合DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，僅進(jìn)行了95個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，篩選出4對(duì)在種內(nèi)保守但在5個(gè)種間存在差異的引物，上述結(jié)果說(shuō)明采用混合DNA篩選種特異性引物不但是可行的，同時(shí)還可以大大提高篩選效率。對(duì)混合DNA篩選獲得的引物，最后再采用5個(gè)種各24個(gè)單獨(dú)DNA對(duì)這4對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，最終篩選出2對(duì)引物可以用于美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊任意2個(gè)種間雜交子代的真實(shí)性鑒別。

4 結(jié)論

從美洲黑楊和小葉楊中種特異性的5 000對(duì)InDel引物中，篩選出341對(duì)在5個(gè)派的5個(gè)種之間通用的引物。從不同的染色體上共選取48對(duì)引物，最終篩選出2對(duì)引物在楊屬派間5個(gè)種中存在長(zhǎng)度差異而在派內(nèi)保守。2對(duì)引物同時(shí)使用，可以用于美洲黑楊、小葉楊、山楊、大葉楊和胡楊任意2個(gè)種間雜交子代的真實(shí)性鑒別。