油莎豆快速繁殖體系構(gòu)建研究

王曉龍， 鐘 鵬 ， 楊 曌， 柴 華， 李莎莎， 徐艷霞， 吳 玥， 高海娟，王宏偉 ， 王建麗， 李 偉， 王若丁， 孫 蕊， 李 莉， 張 楊

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古通遼 028000；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

油莎豆（Cyperus esculentus）又名油莎草，是莎草科多年生草本植物， 原產(chǎn)于非洲地中海地區(qū)， 自20 世紀(jì)50 年代由北京植物園從蘇聯(lián)將油莎豆種質(zhì)資源首次引入我國， 在我國常作一年生作物栽培（李佳婷等，2019）。 油莎豆塊莖富含油脂，是適宜沙地生長的草類，喜溫暖濕潤氣候環(huán)境，其適應(yīng)性強(qiáng)，具有抗旱、耐澇、耐貧瘠且耐鹽堿等特性，其地上莖葉營養(yǎng)豐富，含粗脂肪（7.6% ～9.1%）、糖（10.6%）、粗蛋白質(zhì)（9.8%）和粗纖維（19.3%）等（Bai 等，2021；陳星，2013），其是集糧、油、飼為一體，具有較高綜合利用價(jià)值的作物，是家畜和家禽十分喜愛的飼料（李變變等，2023；RazolaDíaz 等，2022）。 油莎豆以塊莖繁殖，近幾年來，隨著我國種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，油莎豆從2017 年（2.4×103hm2）至2019 年（13.3×103hm2）種植面積迅猛增加，其在新疆、內(nèi)蒙古、吉林、河南、黑龍江等地區(qū)均有栽培（楊向東和李子勇，2022）。

我國油莎豆種質(zhì)資源遺傳多樣性較低，現(xiàn)存優(yōu)良品種十分匱乏， 加之油莎豆種植在我國氣候環(huán)境下一般不開花或開花不結(jié)實(shí)， 因此采用常規(guī)雜交育種方法培育優(yōu)良新品種比較困難（馬紫薇等，2022；陽振樂，2017），大多只能以塊莖繁殖，而長期用其繁殖，易出現(xiàn)品種退化、品質(zhì)降低、帶菌嚴(yán)重等問題。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)手段是加快植物繁殖及獲得無菌植株的行之有效方法， 可實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的種質(zhì)創(chuàng)新及種苗規(guī)?；a(chǎn)， 該項(xiàng)技術(shù)目前已在農(nóng)作物如馬鈴薯（Solanum tuberosum）、 甘薯 （Dioscorea esculenta）、蒜（Allium sativum）等生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用（楊尋，2021； 馮光惠等，2015； 王鵬等，2015；趙彥杰，2006）。 但關(guān)于油莎豆莖尖組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)的研究卻較少且不成熟， 限制了油莎豆種植推廣和種質(zhì)資源創(chuàng)新。 因此，本研究選取油莎豆莖尖作為外植體，MS 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 通過以添加不同比例的生長調(diào)節(jié)劑來進(jìn)行莖尖分化誘導(dǎo)及生根誘導(dǎo)， 進(jìn)而構(gòu)建油莎豆種質(zhì)快速繁殖體系， 為寒區(qū)高效繁育油莎豆優(yōu)異種苗及種質(zhì)資源創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為黑油莎2 號(hào)油莎豆，種子由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供?；瘜W(xué)試劑6-芐基腺膘呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）由福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司提供。 MS 和1/2MS 培養(yǎng)基，由青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 最佳莖尖消毒方法選擇 油莎豆種子消毒后，放入恒溫水浴鍋中35 ℃浸泡24 h，之后置于27 ℃環(huán)境溫度下催芽。 待頂芽長至1 ～2 cm 時(shí)，用解剖刀切下頂芽，設(shè)置不同的消毒處理（75%酒精30 s+0.1%升汞消毒時(shí)間分別設(shè)定為A1=3 min、A2 =4 min、A3 =5 min、A4 =10 min、A5 =15 min），每個(gè)處理30 株，3 次重復(fù)，消毒后用無菌水沖洗6 次，置于無菌紙上吸干頂芽表面水分，將頂芽置于雙目解剖鏡下，用解剖刀切取莖尖（1 ～2 mm）分生組織，接種于頂芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L 蔗糖+7.0 g/L瓊脂，pH 5.8），培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照14 h/d，黑暗10 h/d， 光強(qiáng)150 μmol/m2·s，20 d 后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)量、死亡數(shù)量和存活數(shù)量，并計(jì)算污染率、成苗率。

污染率/%=（污染外植體數(shù)量/外植體總個(gè)數(shù)）×100；

存活率/%=（存活外植體數(shù)量/外植體總個(gè)數(shù)）×100。

1.2.2 莖尖分化培養(yǎng)基篩選 將消毒后的莖尖，放置于雙目解剖鏡下，用解剖刀切取莖尖（1 ～2 mm）分生組織，接種于不同激素配比的培養(yǎng)基上（表1），每個(gè)處理接種50 個(gè)莖尖，3 次重復(fù)，培養(yǎng)室溫度為25 ℃，光照14 h/d，黑暗10 h/d，光強(qiáng)為150 μmol/m2·s，20 d 后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)、死亡數(shù)、成苗數(shù)，計(jì)算成苗率：

表1 莖尖分化培養(yǎng)基

成苗率/%=（成苗外植體個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)）×100。

1.2.3 快速繁殖與生根培養(yǎng)基篩選 將分化的莖尖，接種于不同激素配比的快速繁殖培養(yǎng)基上，處理為MS+6-BA（0.8、1.0、1.2 mg/L），每個(gè)處理接種30 株，3 次重復(fù)。

將快速繁殖培養(yǎng)基中小苗（2 ～3 cm）接種于生根培養(yǎng)基上，1/2MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度激素（IBA、IAA 和NAA，表2），每個(gè)處理接種30 苗，3 次重復(fù)，20 d 后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)及根系形態(tài)，計(jì)算生根率：

表2 無菌苗生根培養(yǎng)基

生根率/%=（生根外植體個(gè)數(shù)/外植體總個(gè)數(shù)）×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel（2010）處理數(shù)據(jù)，用Sigma Plot（12.5）作圖，采用SAS（9.0）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑油莎2 號(hào)莖尖消毒 由圖1 可知，黑油莎2 號(hào)莖尖污染率為15.56% ～44.44%； 死亡率為12.22% ～53.33%；存活率為31.11% ～67.78%。隨消毒時(shí)間的增加， 黑油莎2 號(hào)莖尖污染率呈現(xiàn)降低的趨勢，死亡率呈現(xiàn)升高趨勢，而存活率則呈現(xiàn)先升后降的變化。 0.1%升汞消毒3 min 時(shí)即A1，黑油莎2 號(hào)莖尖污染率顯著高于其他消毒處理（P＜0.05）；A2（消毒4 min）時(shí)，黑油莎2 號(hào)莖尖存活率顯著高于其他消毒處理（P＜0.05），且呈現(xiàn)峰值，分別是A1（3 min）、A3（5 min）、A4（10 min）、A5 （15 min） 處理的1.65、1.38、1.90、2.17 倍；A5（消毒15 min）時(shí)，黑油莎2 號(hào)莖尖死亡率顯著高于其他消毒處理（P＜0.05）。 此結(jié)果表明，75%酒精30 s+0.1%升汞消毒4 min 時(shí)黑油莎2 號(hào)莖尖消毒效果最好。

圖1 消毒方法與效果比較

2.2 黑油莎2 號(hào)莖尖分化培養(yǎng) 由圖2 可見，在不同激素處理中黑油莎2 號(hào)莖尖污染率為8.67% ～31.33%； 死亡率為28.67% ～65.33%； 成苗率為18.00% ～62.67%。其中B2 處理時(shí)，黑油莎2 號(hào)莖尖分化成苗率呈現(xiàn)最高值， 顯著高于其他處理（P＜0.05）， 其次是B3 和C2， 分別為34.67%、34.33%，A1 和A2 較低。 在B2、D1、D2 處理時(shí)，黑油莎2 號(hào)莖尖污染率量較低， 分別為8.67%、10.00%、11.33%，顯著低于其他處理（P＜0.05）。以上結(jié)果表明， 在MS 培養(yǎng)基中加入0.9 mg/L 6-BA 和0.3 mg/L NAA 時(shí)， 黑油莎2 號(hào)莖尖誘導(dǎo)分化成苗效果最優(yōu)。

圖2 不同激素對黑油莎2 號(hào)莖尖分化的影響

2.3 黑油莎2 號(hào)快速繁殖培養(yǎng) 由圖3 可知，6-BA 為1.0 mg/L 即A2 時(shí)，黑油莎2 號(hào)無菌苗死亡率為6.67%，顯著低于A2 和A3 處理（P＜0.05），此時(shí)A2 黑油莎2 號(hào)無菌苗分化率呈現(xiàn)最高值，為94.33%， 與A1 和A3 處理相比增加12.11%和16.55%， 且A2 黑油莎2 號(hào)無菌苗分化率顯著高于A1 和A3 處理（P＜0.05）。 以上結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L 6-BA 可顯著提高黑油莎2 號(hào)無菌苗的繁殖速率。

圖3 不同6-BA 濃度對黑油莎2 號(hào)無菌苗快繁的影響

2.4 黑油莎2 號(hào)生根培養(yǎng) 由表3 可見，在1/2MS培養(yǎng)基上添加不同濃度的IBA、NAA 和IAA 時(shí)生根率差異較大，A2 時(shí)， 黑油莎2 號(hào)無菌苗生根數(shù)量（29.00）最高，顯著高于其他處理（P＜0.05），生根率為96.67%，且根系粗壯，根長為0.9 ～3.0 cm，而IAA 培養(yǎng)基中， 黑油莎2 號(hào)無菌苗生根率為62.22% ～ 83.33% ，NAA 生根率為42.22% ～62.22%，明顯低于IBA 和IAA 處理。該結(jié)果表明，黑油莎2 號(hào)最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS 培養(yǎng)基添加0.2 mg/L IBA，此培養(yǎng)基不僅生根率高，而且根系粗壯、不易褐化。

表3 不同激素對黑油莎2 號(hào)生根的影響

3 討論

植物組織培養(yǎng)是選取植物某個(gè)部位（組織、細(xì)胞、器官）為外植體，在人工可控的無菌環(huán)境下，利用富含植株生長發(fā)育所需養(yǎng)分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在激素調(diào)控下使其發(fā)育成完整植株（張慧君和陳勁楓，2015）。其中莖尖培養(yǎng)也稱分生組織培養(yǎng)，由于莖尖頂端分生組織攜帶病毒較少， 所以應(yīng)用莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)是行之有效的方法。研究表明，通過營養(yǎng)塊莖、 球莖等繁殖的植物如馬鈴薯、 山藥（Rhizoma dioscorea）、半夏（Pinellia ternata）、荸薺（Eleocharis dulcis）等，傳統(tǒng)繁殖方式不僅擴(kuò)繁速度慢，消耗種莖多，而且長期塊莖無性繁殖易積累病毒， 因而利用組織培養(yǎng)進(jìn)行離體快繁是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的一種快速繁育種苗及優(yōu)化種質(zhì)的技術(shù)（陳芝華等，2018；靳松等，2017；馮光惠等，2015；陳利萍，2009）。其中，外植體消毒是本試驗(yàn)中的最關(guān)鍵步驟， 消毒效果不佳， 將直接導(dǎo)致培養(yǎng)基污染， 并對試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)造成影響。 培養(yǎng)基污染主要有人為因素和外植體引發(fā)， 而外植體本身攜帶大量的細(xì)菌和真菌， 只能通過尋找合適的消毒試劑、 適宜的藥劑濃度及嚴(yán)格的消毒時(shí)間來降低污染。 油莎豆塊莖長于地下，其表面布滿細(xì)菌，甚至部分細(xì)菌已進(jìn)入到塊莖內(nèi)部， 因此選擇適宜的消毒方法將其徹底消毒尤為關(guān)鍵。本研究中，75%酒精結(jié)合0.1%升汞消毒4 min 時(shí)，黑油莎2 號(hào)莖尖存活率最高， 隨消毒時(shí)間延長或縮短均影響消毒效果，這與黃思（2015）的研究結(jié)果趨于一致，但與吳瓊（2007）用0.2%升汞消毒的結(jié)果卻不盡相同，這可能是品種不同或消毒部位不同所引起的，究其原因， 可能是由于0.1%升汞中的汞離子（Hg+） 進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后主要與酶或蛋白質(zhì)上的巰基（-SH）結(jié)合而使之失活或變性，因此0.1%升汞更適宜油莎豆莖尖消毒。 同時(shí)消毒時(shí)長也會(huì)影響外植體消毒效果， 消毒時(shí)間過長造成外植體不可逆損傷，時(shí)間過短則外植體消毒不徹底，所以掌控好消毒時(shí)間也是外植體消毒的關(guān)鍵（黃思，2015）。

植物生長和發(fā)育過程是源于分生組織不斷進(jìn)行分裂、分化而成。 植株在早期階段胚形成以后，其頂端生長點(diǎn)隨著種胚的萌發(fā)生長， 起初形成莖尖分生組織，之后又逐漸分化成初生分生組織，最后形成地上部分如莖和葉（陸維超等，2016；韓德元，1997）。而在莖尖的分化過程中，植物莖尖分生組織的形態(tài)特征、 理化特性以及內(nèi)源激素含量都會(huì)發(fā)生變化（張慧君和陳勁楓，2015）。 因此，外源植物激素的種類、 水平及組合對植物組織的分化和增殖顯得十分重要。 細(xì)胞分裂素是植物組織培養(yǎng)過程中促進(jìn)組織分化和生長的物質(zhì)， 不同細(xì)胞分裂素種類及濃度對組培苗的分化增殖效果不同（陸維超等，2016）。 本研究中， 隨6-芐基腺膘呤（6-BA）濃度增加，黑油莎2 號(hào)莖尖分化成苗率表現(xiàn)為先升后降的變化， 試驗(yàn)確定了黑油莎2 號(hào)莖尖分化最佳濃度為6-BA 0.9 mg/L，此時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的莖尖分化速度最快， 分化成苗率最高， 植株健壯，這與黃思（2015）的研究結(jié)果基本一致，說明細(xì)胞分裂素正向調(diào)控莖尖分生組織的細(xì)胞分化，并能控制分生組織的大小和分化速度。 而6-BA 濃度（0.9 mg/L）一定時(shí)，黑油莎2 號(hào)莖尖分化的最佳萘乙酸（NAA）濃度為0.3 mg/L，當(dāng)NAA 濃度高于或低于該濃度，成苗率呈現(xiàn)明顯降低，而陳利萍（2009）卻指出，NAA 0.1 mg/L 是較為理想的誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比，本研究結(jié)果與其有所不同，這可能與材料本身的遺傳特性及取材大小有關(guān)， 由此說明適宜生長素濃度能加快莖尖細(xì)胞分裂活動(dòng)，對莖尖分生組織的分化起到促進(jìn)作用， 而生長素濃度高于特定閥值（最適濃度）時(shí)，則對莖尖分化具有抑制作用（陸維超等，2016）。 本研究中，MS+1.0 mg/L 6-BA 可明顯提高黑油莎2 號(hào)無菌苗繁殖速率，這與黃思（2015）的研究結(jié)果相一致，而瞿萍梅等（2007）則認(rèn)為，MS+0.5 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基的繼代增殖效果更好， 這可能與供試品種的遺傳特性及基因型不同有關(guān)（李佳婷等，2019）。 此外，從生根培養(yǎng)的誘導(dǎo)方面可以推測出， 不用植物或同一植物不同品種間的差異導(dǎo)致莖尖分化苗的生根難易程度不同。 韓曉勇等（2013）研究指出，1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.02%活性炭培養(yǎng)基為鐵棍山藥生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基， 平均生根天數(shù)為12 d，生根率100%，根系最長為1.04 cm；張振霞等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 吲哚丁酸（IBA）培養(yǎng)基為廣山藥的最佳生根培養(yǎng)基配方，主根性狀明顯，出現(xiàn)較多的不定根和毛狀根。 目前對于油莎豆的組織培養(yǎng)研究報(bào)道很少，本研究中，黑油莎2 號(hào)莖尖分化苗在1/2MS 培養(yǎng)基上生根，1/2MS+0.2 mg/L IBA 為快速生根培養(yǎng)基配方， 該培養(yǎng)基黑油莎2 號(hào)再生苗生根率為96.67%，這與瞿萍梅等（2007）的研究結(jié)果相一致，說明盡管品種不同，但最適宜生根培養(yǎng)基激素配比基本相同， 可見油莎豆芽誘導(dǎo)生根對激素種類具有一定的依賴性。 油莎豆快速繁殖體系構(gòu)建不僅縮短了莖尖分化誘導(dǎo)時(shí)間， 而且提高了無菌苗生根率， 為油莎豆優(yōu)質(zhì)種苗高效繁育奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）黑油莎2 號(hào)最佳莖尖消毒方法為75%酒精30 s+0.1%升汞4 min。 （2）最優(yōu)莖尖分化培養(yǎng)基成分為MS+0.9 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。 （3） 最佳快速繁殖培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA。 （4）最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.2 mg/L IBA。