日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)幼貓免疫功能的影響

龐曉玥， 許春榮， 葉嘉莉， 邱文粵， 章心婷， 蘇依曼， 蘇榮勝

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 廣東廣州 510642；2.廣東原喵智能科技有限公司，廣東順德 528000）

幼貓是指6 月齡內(nèi)的貓， 在這個(gè)階段的小貓身體各器官發(fā)育尚未完全，對(duì)外界刺激如寒冷、酷暑、 暴風(fēng)雨等天氣的變化及飼養(yǎng)環(huán)境的轉(zhuǎn)換反應(yīng)能力差，適應(yīng)能力弱；且由于缺乏自然免疫力，若不及時(shí)做好驅(qū)蟲(chóng)和免疫， 容易導(dǎo)致幼貓染病或夭折（蔣珊珊等，2020）。 研究表明，約有70%的免疫細(xì)胞位于消化道中（王昱丁等，2018），因此在滿足幼貓基本營(yíng)養(yǎng)需求、 提供驅(qū)蟲(chóng)和免疫基礎(chǔ)保障的同時(shí)， 在日糧中添加能夠激活免疫力和提高抵抗力的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)幼貓的健康生長(zhǎng)和發(fā)育尤為重要。

黑水虻（Hermetia illucens）是一種腐生性的水虻科昆蟲(chóng)，出現(xiàn)于全球熱帶和溫帶地區(qū)。成年的黑水虻不咬人或叮人， 且不傳播任何特定疾?。╓ang 等，2017）。 它作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)替代品的同時(shí)，還富含多種微量和常量營(yíng)養(yǎng)素。研究表明，其能夠顯著改善畜禽的腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、 提高抗氧化能力， 從而提高抗病力（劉彬等，2023）。螺旋藻（spirulina，SP）屬低等水生植物，是最早被人類食用的藻類， 其含有非常豐富的蛋白質(zhì)，以及人類和動(dòng)物所需的必需氨基酸， 并具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性（劉晶等，2022）。本試驗(yàn)以黑水虻和SP 為日糧中的營(yíng)養(yǎng)性添加劑，探究它們對(duì)幼貓生長(zhǎng)性能、免疫功能以及抗氧化方面的影響，為其在保障幼貓健康生長(zhǎng)發(fā)育中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 18 只45 ~ 60 日齡斷奶田園幼貓由海大威海寵物試驗(yàn)基地提供， 免疫驅(qū)蟲(chóng)史完整，幼貓每日喂食兩次，自由飲水，進(jìn)行為期1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后正式試驗(yàn)24 d。 試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寵物醫(yī)學(xué)研究中心進(jìn)行， 并由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寵物醫(yī)學(xué)研究中心負(fù)責(zé)日常飼喂管理。將18 只幼貓隨機(jī)分為3 組，每組6 只。 對(duì)照組幼貓飼喂某進(jìn)口品牌幼貓糧 （H 組）； 試驗(yàn)組幼貓飼喂無(wú)谷鮮肉昆蟲(chóng)蛋白貓糧[基于空白對(duì)照組配方，額外添加黑水虻和螺旋藻，生產(chǎn)于海大寵物食品（威海）有限公司。 T 組]；空白對(duì)照組幼貓飼喂海瑞特75+幼貓貓糧[基礎(chǔ)配方貓糧，生產(chǎn)于海大寵物食品（威海）有限公司。75+組]。在試驗(yàn)第24 天靜脈采集幼貓血液各5 mL， 離心后取血清進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)并存至-80 ℃。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器 貓免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG） 、免疫球蛋白M（IgM） ELISA試劑盒，購(gòu)自Abcam；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-2 （IL-2） 、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）ELISA 試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；FPV、FHV 和FCV 抗體快速檢測(cè)試劑盒， 購(gòu)自安捷產(chǎn)品生產(chǎn)公司。 總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒由南京建成生物研究所提供；Nanodrop-2000 型微量紫外分光光度計(jì)、MULTISKAN FC 型酶標(biāo)儀由美國(guó)Thermo Fisher 公司提供；熒光定量檢測(cè)儀由韓國(guó)安捷BIONOTE Vcheck 公司提供。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 平均日增重和平均日采食量 試驗(yàn)第1 天早上開(kāi)始稱取每只貓的糧重量， 在晚上喂食前稱取白天剩余糧重量及新放糧的重量， 并在第2 天早上稱取前一晚糧剩余克數(shù)， 直至試驗(yàn)開(kāi)始后的第25 天。 記錄并計(jì)算每只貓的平均日采食量，計(jì)算公式為： 平均日采食量=（早上糧重量-晚上剩余糧重量）+（晚上新放糧重量-第2 天早上糧剩余量）]/試驗(yàn)天數(shù)。

于正式試驗(yàn)第1 天及第24 天幼貓禁食2 h后， 準(zhǔn)確稱量其空腹體重。 計(jì)算每只貓的平均日增重，計(jì)算公式為：平均日增重=（試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重-試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)體重）/試驗(yàn)天數(shù)。

1.3.2 免疫力指標(biāo)檢測(cè) 正式試驗(yàn)第24 天每只貓靜脈采血5 mL， 靜置30 min 后以3000 r/min離心3 min，吸取上清液于新的EP 管，即為血清樣品。 測(cè)定的免疫功能指標(biāo)包括Ig A、Ig G、Ig M、IL-6、IL-2 和TNF-α， 具體操作按各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 貓三聯(lián)抗體水平檢測(cè) 血清獲得方法同1.3.2；測(cè)定的血清貓三聯(lián)抗體水平種類包括FPV、FCV 和FHV；吸取5μL 血清樣品加入測(cè)定稀釋液管中充分混合， 將檢測(cè)試紙插入儀器槽中并加入100 μL 混合充分的樣品到樣品孔，等待儀器檢測(cè)讀取結(jié)果。

1.3.4 血清代謝組學(xué)檢測(cè)不同貓糧對(duì)幼貓血清中代謝物的影響 將血清樣本從-80℃冰箱中取出，經(jīng)過(guò)處理后運(yùn)用超高效液相色譜質(zhì)譜連用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。 色譜柱為Waters 的ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）。數(shù)據(jù)采用主成分分析（PCA）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，隨后采用正交二乘法-判別分析（OPLS-DA）的變量重要性投影（VIP），進(jìn)行兩兩比較，篩選出有差異的代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05、VIP＞1，當(dāng)差異代謝物同時(shí)滿足這兩個(gè)條件時(shí)， 說(shuō)明該代謝物的組間差異性顯著。

1.3.5 血清抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 血清獲得方法同1.3.2；測(cè)定指標(biāo)包括SOD、CAT、T-AOC 和MDA，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.6 糞便形狀評(píng)分 試驗(yàn)結(jié)束前一周， 每天對(duì)糞便的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分， 糞便評(píng)分過(guò)程由同一人進(jìn)行評(píng)估，按照1 ～5 分制，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 糞便形狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，采用GraphPad Prism 8（GraphPad 軟件，美國(guó)）進(jìn)行單因子方差分析（one-way ANOVA）。 在本研究中，“*”表示與對(duì)照組相比的組，“#”表示與空白對(duì)照組相比的組。 其中P＜0.05 和P＜0.01 分別表示差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)幼貓生長(zhǎng)發(fā)育的影響 每組幼貓平均日增重如圖1（a）所示，H組幼貓平均日增重23.3g；T 組幼貓平均日增重27.83g；75+組幼貓平均日增重25.31g。 三組幼貓的平均日采食量如圖1（b）所示，其中H 組平均日采食量61.97g；，T 組平均日采食量71.61 g；75+組平均日采食量65.55g。 T 組幼貓平均日增重和平均日采食量最高。

圖1 各組平均日增重和平均日采食量對(duì)比

2.2 日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)免疫功能指標(biāo)的影響 從圖2（a）可以看出，與H 組相比，T 組的IgM 水平提高10.72%（P＜0.05）；而75+組與T組相比，IgM 水平下降了12.28%（P＜0.01）；IgA與IgG 水平三組相比則未見(jiàn)明顯差異。 由圖2（b）可以看出，T 組和75+組的IL-6 和IL-2 水平均高于H 組， 其中T 組IL-2 水平較H 組要顯著增高22.53%（P＜0.01）。 此外T 組的TNF-α 水平低于其他兩組，且與75+組相比顯著降低13.74%（P＜0.01）。

圖2 各組免疫功能指標(biāo)水平對(duì)比

2.3 日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)貓三聯(lián)抗體水平的影響 如圖3 所示，T 組的FCV 和FPV 抗體水平均高于75+組， 且75+組的FCV 抗體水平較H 組顯著降低47.5%（P＜0.05）。 而FHV 抗體水平三組未見(jiàn)明顯差異。

圖3 各組貓三聯(lián)抗體水平對(duì)比

2.4 日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)幼貓血清中代謝物的影響 首先對(duì)三組樣本進(jìn)行PCA 分析，由圖4（a）可知，三組樣本均位于95%置信區(qū)間內(nèi)，且各組樣本能較好地聚類在一起。使用OPLS-DA分析對(duì)三組樣本進(jìn)行兩兩比對(duì)分析并篩選出差異代謝物，由圖4（b ～d）可得，在OPLS-DA 模型下各組樣品分離明顯，可進(jìn)一步篩選差異代謝物。表2 為三組對(duì)比后篩選的差異代謝物， 在本試驗(yàn)中與H 組相比，T 組的茶皂醇A、環(huán)丙甲酸B、馬齒莧黃素II 和熊果酸有所上調(diào)， 而75+組的甘油三酯也有所上調(diào)。與75+組對(duì)比，T 組的茶皂醇A、環(huán)丙甲酸B、馬齒莧黃素II、熊果酸、13，14-二氫前列腺素-1α 和10，20-二羥基二十酸也有所上調(diào)。

圖4 PCA（a）得分圖和OPLS-DA 得分圖（b ～d）

表2 三個(gè)試驗(yàn)組之間差異代謝物

2.5 日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)血清抗氧化指標(biāo)水平的影響 從圖5（a ～c）可以看出，T 組的SOD、CAT 和T-AOC 的活力水平最高， 其次為H組， 其中與75+組相比，T 組的T-AOC 水平升高極為顯著（P＜0.01）， 升高了490%， 而H 組與75+組相比也明顯升高了303.23%（P＜0.05）。 由圖5d 可知，75+組的MDA 水平最高（P＜0.05）較H 組與T 組分別升高了80.85%和77.08%。

圖5 各組抗氧化指標(biāo)水平對(duì)比圖

2.6 日糧添加黑水虻和螺旋藻對(duì)糞便形狀的影響 三個(gè)組的貓糞便形狀評(píng)分如圖6 所示，H 組幼貓平均糞便評(píng)分4.75 分，75+組幼貓平均糞便評(píng)分4.83 分，T 組幼貓平均糞便評(píng)分最高，為4.95 分，糞便形狀良好，堅(jiān)硬且干燥。

圖6 各組貓糞便形狀評(píng)分對(duì)比

3 討論

隨著養(yǎng)貓人數(shù)的激增 （尤其是養(yǎng)幼貓的人數(shù)），越來(lái)越多的寵主在滿足幼貓基本營(yíng)養(yǎng)需求的同時(shí)開(kāi)始關(guān)心幼貓的抵抗力問(wèn)題。 當(dāng)幼貓抵抗力下降時(shí)，會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、毛發(fā)干枯、容易生病等癥狀，嚴(yán)重影響幼貓的生長(zhǎng)發(fā)育。新生幼貓從母貓乳汁中獲得免疫球蛋白，從而獲得免疫力。但一般在幾周后，這種免疫力便開(kāi)始逐漸下降。此時(shí)除了給幼貓定期驅(qū)蟲(chóng)和接種疫苗外， 還可通過(guò)在日糧中添加特定的營(yíng)養(yǎng)素， 輔助提高幼貓的免疫力和抵抗力，使幼貓健康生長(zhǎng)發(fā)育。此前已有研究證實(shí)，黑水虻和螺旋藻的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，并已被應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖中（張金金等，2021；韋金河等，2009），但在幼貓飼養(yǎng)中的應(yīng)用還鮮見(jiàn)報(bào)道。在本研究中， 試驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)在日糧中添加黑水虻和螺旋藻可提高幼貓的免疫力和抗氧化能力，從而提高幼貓的抵抗力。

研究表明， 將黑水虻和螺旋藻作為營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖中， 可以提高畜禽生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和提高抗氧化能力，從而提高抗病力（劉彬等，2023；張金金等，2021；林春榕等，2013；萬(wàn)順康等，2013）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，T組的平均日增重及平均日采食量最高， 說(shuō)明相較于其他兩組，T 組的生長(zhǎng)性能最好。 IgA、IgG 和IgM 這三種免疫球蛋白是參與體液免疫的主要抗體， 通過(guò)檢測(cè)它們?cè)谘逯械暮靠闪私庥棕垯C(jī)體合成免疫球蛋白的功能及機(jī)體抗感染免疫能力，代表機(jī)體的體液免疫水平。 IL-6 和IL-2 作為促進(jìn)T、B 細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要影響。 TNF-α 是由單核-巨噬細(xì)胞合成和釋放的多功能細(xì)胞因子， 參與免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)， 在許多重要的生理和病理活動(dòng)中起關(guān)鍵作用（余偉明等，1991）。 本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加黑水虻和螺旋藻可促進(jìn)血清IgA、IgM 水平升高， 并在顯著升高IL-2 和IL-6 水平的同時(shí)抑制了TNF-α 的表達(dá)。 除此之外，貓三聯(lián)疫苗的抗體水平結(jié)果也從側(cè)面反映出了它們提高了這些抗體在幼貓?bào)w內(nèi)的滴度， 增強(qiáng)幼貓?jiān)诿鎸?duì)這三種常見(jiàn)傳染病病毒時(shí)的抵抗力。

血液代謝物的變化能夠?qū)崟r(shí)反映動(dòng)物的代謝狀況、營(yíng)養(yǎng)水平和健康情況，與傳統(tǒng)的血液生化指標(biāo)相比， 代謝組學(xué)能更加系統(tǒng)地反映機(jī)體的生理健康狀況，更利于指導(dǎo)和預(yù)防某些營(yíng)養(yǎng)代謝?。ɡ钬泛赖?，2022）。 茶皂醇A 由茶皂素水解得來(lái)，研究表明茶皂素能促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育， 提高血液中的免疫因子水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力（王留幸等，2022；常肖肖等，2017；常肖肖等，2016）。熊果酸具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等功效，能有效地清除自由基，具有很好的抗氧化能力（霍明洋等，2022）。 在本試驗(yàn)中，T 組代謝物中的茶皂醇A 和熊果酸水平顯著上調(diào)（p ＜0.05），說(shuō)明日糧中添加黑水虻和螺旋藻能增強(qiáng)幼貓的免疫力和提高抗氧化水平。

氧化應(yīng)激的特點(diǎn)是內(nèi)源性抗氧化防御功能降低， 無(wú)法抵抗活性氧 （ROS） 的過(guò)度產(chǎn)生（Lushchak，2014）。當(dāng)它過(guò)度生成時(shí)會(huì)對(duì)包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞造成嚴(yán)重毒害，并導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 受損（Freeman 等，1982）。 體內(nèi)氧化應(yīng)激水平可以通過(guò)多種生物標(biāo)志物來(lái)測(cè)量，如MDA、SOD、T-AOC 等。 MDA 是體內(nèi)ROS 自由基反應(yīng)的終產(chǎn)物， 其被認(rèn)為是評(píng)估脂質(zhì)氧化損傷的最敏感標(biāo)記之一 （Frijhoff 等，2015）。 通過(guò)測(cè)定MDA 的含量，可間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊后的受損程度。 SOD 是體內(nèi)最重要的抗氧化酶類之一， 能把有害的超氧化自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫， 隨后CAT 將過(guò)氧化氫分解為完全無(wú)害的水（張玉棟等，2020；林春榕等，2013），為機(jī)體提供抗氧化防御機(jī)理。T-AOC 是指各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等總的抗氧化水平， 其反映了生物活性物質(zhì)的抗氧化能力（Wang 等，2012）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加黑水虻和螺旋藻可使SOD 活性和T-AOC 能力顯著提高，并抑制MDA 的生成，說(shuō)明它們具有清除自由基、 保護(hù)幼貓免受氧化損傷的能力。

4 結(jié)論

綜上所述， 日糧中添加黑水虻和螺旋藻可促進(jìn)幼貓生長(zhǎng)發(fā)育， 還能增強(qiáng)幼貓的免疫功能和抗氧化能力，從而提高幼貓的抵抗力，減少患病的可能。