日糧添加黑水虻和螺旋藻對幼貓免疫功能的影響

龐曉玥， 許春榮， 葉嘉莉， 邱文粵， 章心婷， 蘇依曼， 蘇榮勝

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 廣東廣州 510642；2.廣東原喵智能科技有限公司，廣東順德 528000）

幼貓是指6 月齡內(nèi)的貓， 在這個階段的小貓身體各器官發(fā)育尚未完全，對外界刺激如寒冷、酷暑、 暴風(fēng)雨等天氣的變化及飼養(yǎng)環(huán)境的轉(zhuǎn)換反應(yīng)能力差，適應(yīng)能力弱；且由于缺乏自然免疫力，若不及時做好驅(qū)蟲和免疫， 容易導(dǎo)致幼貓染病或夭折（蔣珊珊等，2020）。 研究表明，約有70%的免疫細(xì)胞位于消化道中（王昱丁等，2018），因此在滿足幼貓基本營養(yǎng)需求、 提供驅(qū)蟲和免疫基礎(chǔ)保障的同時， 在日糧中添加能夠激活免疫力和提高抵抗力的營養(yǎng)素對幼貓的健康生長和發(fā)育尤為重要。

黑水虻（Hermetia illucens）是一種腐生性的水虻科昆蟲，出現(xiàn)于全球熱帶和溫帶地區(qū)。成年的黑水虻不咬人或叮人， 且不傳播任何特定疾?。╓ang 等，2017）。 它作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)替代品的同時，還富含多種微量和常量營養(yǎng)素。研究表明，其能夠顯著改善畜禽的腸道健康、增強機體免疫功能、 提高抗氧化能力， 從而提高抗病力（劉彬等，2023）。螺旋藻（spirulina，SP）屬低等水生植物，是最早被人類食用的藻類， 其含有非常豐富的蛋白質(zhì)，以及人類和動物所需的必需氨基酸， 并具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性（劉晶等，2022）。本試驗以黑水虻和SP 為日糧中的營養(yǎng)性添加劑，探究它們對幼貓生長性能、免疫功能以及抗氧化方面的影響，為其在保障幼貓健康生長發(fā)育中的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 18 只45 ~ 60 日齡斷奶田園幼貓由海大威海寵物試驗基地提供， 免疫驅(qū)蟲史完整，幼貓每日喂食兩次，自由飲水，進行為期1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后正式試驗24 d。 試驗在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寵物醫(yī)學(xué)研究中心進行， 并由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寵物醫(yī)學(xué)研究中心負(fù)責(zé)日常飼喂管理。將18 只幼貓隨機分為3 組，每組6 只。 對照組幼貓飼喂某進口品牌幼貓糧 （H 組）； 試驗組幼貓飼喂無谷鮮肉昆蟲蛋白貓糧[基于空白對照組配方，額外添加黑水虻和螺旋藻，生產(chǎn)于海大寵物食品（威海）有限公司。 T 組]；空白對照組幼貓飼喂海瑞特75+幼貓貓糧[基礎(chǔ)配方貓糧，生產(chǎn)于海大寵物食品（威海）有限公司。75+組]。在試驗第24 天靜脈采集幼貓血液各5 mL， 離心后取血清進行相應(yīng)檢測并存至-80 ℃。

1.2 試驗試劑和儀器 貓免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG） 、免疫球蛋白M（IgM） ELISA試劑盒，購自Abcam；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-2 （IL-2） 、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）ELISA 試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；FPV、FHV 和FCV 抗體快速檢測試劑盒， 購自安捷產(chǎn)品生產(chǎn)公司。 總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒由南京建成生物研究所提供；Nanodrop-2000 型微量紫外分光光度計、MULTISKAN FC 型酶標(biāo)儀由美國Thermo Fisher 公司提供；熒光定量檢測儀由韓國安捷BIONOTE Vcheck 公司提供。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 平均日增重和平均日采食量 試驗第1 天早上開始稱取每只貓的糧重量， 在晚上喂食前稱取白天剩余糧重量及新放糧的重量， 并在第2 天早上稱取前一晚糧剩余克數(shù)， 直至試驗開始后的第25 天。 記錄并計算每只貓的平均日采食量，計算公式為： 平均日采食量=（早上糧重量-晚上剩余糧重量）+（晚上新放糧重量-第2 天早上糧剩余量）]/試驗天數(shù)。

于正式試驗第1 天及第24 天幼貓禁食2 h后， 準(zhǔn)確稱量其空腹體重。 計算每只貓的平均日增重，計算公式為：平均日增重=（試驗結(jié)束時體重-試驗開始時體重）/試驗天數(shù)。

1.3.2 免疫力指標(biāo)檢測 正式試驗第24 天每只貓靜脈采血5 mL， 靜置30 min 后以3000 r/min離心3 min，吸取上清液于新的EP 管，即為血清樣品。 測定的免疫功能指標(biāo)包括Ig A、Ig G、Ig M、IL-6、IL-2 和TNF-α， 具體操作按各試劑盒說明書進行。

1.3.3 貓三聯(lián)抗體水平檢測 血清獲得方法同1.3.2；測定的血清貓三聯(lián)抗體水平種類包括FPV、FCV 和FHV；吸取5μL 血清樣品加入測定稀釋液管中充分混合， 將檢測試紙插入儀器槽中并加入100 μL 混合充分的樣品到樣品孔，等待儀器檢測讀取結(jié)果。

1.3.4 血清代謝組學(xué)檢測不同貓糧對幼貓血清中代謝物的影響 將血清樣本從-80℃冰箱中取出，經(jīng)過處理后運用超高效液相色譜質(zhì)譜連用技術(shù)進行檢測。 色譜柱為Waters 的ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）。數(shù)據(jù)采用主成分分析（PCA）進行多元統(tǒng)計分析，隨后采用正交二乘法-判別分析（OPLS-DA）的變量重要性投影（VIP），進行兩兩比較，篩選出有差異的代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05、VIP＞1，當(dāng)差異代謝物同時滿足這兩個條件時， 說明該代謝物的組間差異性顯著。

1.3.5 血清抗氧化指標(biāo)檢測 血清獲得方法同1.3.2；測定指標(biāo)包括SOD、CAT、T-AOC 和MDA，操作按試劑盒說明書進行。

1.3.6 糞便形狀評分 試驗結(jié)束前一周， 每天對糞便的質(zhì)量進行評分， 糞便評分過程由同一人進行評估，按照1 ～5 分制，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 糞便形狀評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，采用GraphPad Prism 8（GraphPad 軟件，美國）進行單因子方差分析（one-way ANOVA）。 在本研究中，“*”表示與對照組相比的組，“#”表示與空白對照組相比的組。 其中P＜0.05 和P＜0.01 分別表示差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 日糧添加黑水虻和螺旋藻對幼貓生長發(fā)育的影響 每組幼貓平均日增重如圖1（a）所示，H組幼貓平均日增重23.3g；T 組幼貓平均日增重27.83g；75+組幼貓平均日增重25.31g。 三組幼貓的平均日采食量如圖1（b）所示，其中H 組平均日采食量61.97g；，T 組平均日采食量71.61 g；75+組平均日采食量65.55g。 T 組幼貓平均日增重和平均日采食量最高。

圖1 各組平均日增重和平均日采食量對比

2.2 日糧添加黑水虻和螺旋藻對免疫功能指標(biāo)的影響 從圖2（a）可以看出，與H 組相比，T 組的IgM 水平提高10.72%（P＜0.05）；而75+組與T組相比，IgM 水平下降了12.28%（P＜0.01）；IgA與IgG 水平三組相比則未見明顯差異。 由圖2（b）可以看出，T 組和75+組的IL-6 和IL-2 水平均高于H 組， 其中T 組IL-2 水平較H 組要顯著增高22.53%（P＜0.01）。 此外T 組的TNF-α 水平低于其他兩組，且與75+組相比顯著降低13.74%（P＜0.01）。

圖2 各組免疫功能指標(biāo)水平對比

2.3 日糧添加黑水虻和螺旋藻對貓三聯(lián)抗體水平的影響 如圖3 所示，T 組的FCV 和FPV 抗體水平均高于75+組， 且75+組的FCV 抗體水平較H 組顯著降低47.5%（P＜0.05）。 而FHV 抗體水平三組未見明顯差異。

圖3 各組貓三聯(lián)抗體水平對比

2.4 日糧添加黑水虻和螺旋藻對幼貓血清中代謝物的影響 首先對三組樣本進行PCA 分析，由圖4（a）可知，三組樣本均位于95%置信區(qū)間內(nèi)，且各組樣本能較好地聚類在一起。使用OPLS-DA分析對三組樣本進行兩兩比對分析并篩選出差異代謝物，由圖4（b ～d）可得，在OPLS-DA 模型下各組樣品分離明顯，可進一步篩選差異代謝物。表2 為三組對比后篩選的差異代謝物， 在本試驗中與H 組相比，T 組的茶皂醇A、環(huán)丙甲酸B、馬齒莧黃素II 和熊果酸有所上調(diào)， 而75+組的甘油三酯也有所上調(diào)。與75+組對比，T 組的茶皂醇A、環(huán)丙甲酸B、馬齒莧黃素II、熊果酸、13，14-二氫前列腺素-1α 和10，20-二羥基二十酸也有所上調(diào)。

圖4 PCA（a）得分圖和OPLS-DA 得分圖（b ～d）

表2 三個試驗組之間差異代謝物

2.5 日糧添加黑水虻和螺旋藻對血清抗氧化指標(biāo)水平的影響 從圖5（a ～c）可以看出，T 組的SOD、CAT 和T-AOC 的活力水平最高， 其次為H組， 其中與75+組相比，T 組的T-AOC 水平升高極為顯著（P＜0.01）， 升高了490%， 而H 組與75+組相比也明顯升高了303.23%（P＜0.05）。 由圖5d 可知，75+組的MDA 水平最高（P＜0.05）較H 組與T 組分別升高了80.85%和77.08%。

圖5 各組抗氧化指標(biāo)水平對比圖

2.6 日糧添加黑水虻和螺旋藻對糞便形狀的影響 三個組的貓糞便形狀評分如圖6 所示，H 組幼貓平均糞便評分4.75 分，75+組幼貓平均糞便評分4.83 分，T 組幼貓平均糞便評分最高，為4.95 分，糞便形狀良好，堅硬且干燥。

圖6 各組貓糞便形狀評分對比

3 討論

隨著養(yǎng)貓人數(shù)的激增 （尤其是養(yǎng)幼貓的人數(shù)），越來越多的寵主在滿足幼貓基本營養(yǎng)需求的同時開始關(guān)心幼貓的抵抗力問題。 當(dāng)幼貓抵抗力下降時，會出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、毛發(fā)干枯、容易生病等癥狀，嚴(yán)重影響幼貓的生長發(fā)育。新生幼貓從母貓乳汁中獲得免疫球蛋白，從而獲得免疫力。但一般在幾周后，這種免疫力便開始逐漸下降。此時除了給幼貓定期驅(qū)蟲和接種疫苗外， 還可通過在日糧中添加特定的營養(yǎng)素， 輔助提高幼貓的免疫力和抵抗力，使幼貓健康生長發(fā)育。此前已有研究證實，黑水虻和螺旋藻的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，并已被應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖中（張金金等，2021；韋金河等，2009），但在幼貓飼養(yǎng)中的應(yīng)用還鮮見報道。在本研究中， 試驗結(jié)果表明通過在日糧中添加黑水虻和螺旋藻可提高幼貓的免疫力和抗氧化能力，從而提高幼貓的抵抗力。

研究表明， 將黑水虻和螺旋藻作為營養(yǎng)性飼料添加劑應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖中， 可以提高畜禽生產(chǎn)性能、增強機體免疫功能和提高抗氧化能力，從而提高抗病力（劉彬等，2023；張金金等，2021；林春榕等，2013；萬順康等，2013）。 本試驗結(jié)果表明，T組的平均日增重及平均日采食量最高， 說明相較于其他兩組，T 組的生長性能最好。 IgA、IgG 和IgM 這三種免疫球蛋白是參與體液免疫的主要抗體， 通過檢測它們在血清中的含量可了解幼貓機體合成免疫球蛋白的功能及機體抗感染免疫能力，代表機體的體液免疫水平。 IL-6 和IL-2 作為促進T、B 細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞生長因子，對免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要影響。 TNF-α 是由單核-巨噬細(xì)胞合成和釋放的多功能細(xì)胞因子， 參與免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)， 在許多重要的生理和病理活動中起關(guān)鍵作用（余偉明等，1991）。 本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加黑水虻和螺旋藻可促進血清IgA、IgM 水平升高， 并在顯著升高IL-2 和IL-6 水平的同時抑制了TNF-α 的表達(dá)。 除此之外，貓三聯(lián)疫苗的抗體水平結(jié)果也從側(cè)面反映出了它們提高了這些抗體在幼貓體內(nèi)的滴度， 增強幼貓在面對這三種常見傳染病病毒時的抵抗力。

血液代謝物的變化能夠?qū)崟r反映動物的代謝狀況、營養(yǎng)水平和健康情況，與傳統(tǒng)的血液生化指標(biāo)相比， 代謝組學(xué)能更加系統(tǒng)地反映機體的生理健康狀況，更利于指導(dǎo)和預(yù)防某些營養(yǎng)代謝?。ɡ钬泛赖?，2022）。 茶皂醇A 由茶皂素水解得來，研究表明茶皂素能促進畜禽生長發(fā)育， 提高血液中的免疫因子水平，增強機體免疫能力（王留幸等，2022；常肖肖等，2017；常肖肖等，2016）。熊果酸具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等功效，能有效地清除自由基，具有很好的抗氧化能力（霍明洋等，2022）。 在本試驗中，T 組代謝物中的茶皂醇A 和熊果酸水平顯著上調(diào)（p ＜0.05），說明日糧中添加黑水虻和螺旋藻能增強幼貓的免疫力和提高抗氧化水平。

氧化應(yīng)激的特點是內(nèi)源性抗氧化防御功能降低， 無法抵抗活性氧 （ROS） 的過度產(chǎn)生（Lushchak，2014）。當(dāng)它過度生成時會對包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞造成嚴(yán)重毒害，并導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 受損（Freeman 等，1982）。 體內(nèi)氧化應(yīng)激水平可以通過多種生物標(biāo)志物來測量，如MDA、SOD、T-AOC 等。 MDA 是體內(nèi)ROS 自由基反應(yīng)的終產(chǎn)物， 其被認(rèn)為是評估脂質(zhì)氧化損傷的最敏感標(biāo)記之一 （Frijhoff 等，2015）。 通過測定MDA 的含量，可間接反映出機體細(xì)胞受自由基攻擊后的受損程度。 SOD 是體內(nèi)最重要的抗氧化酶類之一， 能把有害的超氧化自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫， 隨后CAT 將過氧化氫分解為完全無害的水（張玉棟等，2020；林春榕等，2013），為機體提供抗氧化防御機理。T-AOC 是指各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等總的抗氧化水平， 其反映了生物活性物質(zhì)的抗氧化能力（Wang 等，2012）。 本試驗結(jié)果表明，日糧中添加黑水虻和螺旋藻可使SOD 活性和T-AOC 能力顯著提高，并抑制MDA 的生成，說明它們具有清除自由基、 保護幼貓免受氧化損傷的能力。

4 結(jié)論

綜上所述， 日糧中添加黑水虻和螺旋藻可促進幼貓生長發(fā)育， 還能增強幼貓的免疫功能和抗氧化能力，從而提高幼貓的抵抗力，減少患病的可能。