響應(yīng)面法優(yōu)化柞蠶蛹蟲草活性肽提取工藝研究

劉博佳， 李正鈺， 柳葉飛， 王 澤，5， 徐方旭

（1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；3.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧沈陽(yáng) 110034；4.遼寧省功能性蛹蟲草重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110034；5.沈陽(yáng)市功能性蛹蟲草產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧沈陽(yáng) 110034；6.遼寧省蛹蟲草種質(zhì)資源庫(kù)，遼寧沈陽(yáng) 110034）

活性肽在自然界中廣泛存在并且具有多種生理活性（黃靜雅等，2020），可改善人們的健康狀況，用于疾病的預(yù)防及治療，例如免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)骨密度、降血脂等（錢磊等，2016；李勇等，2010）。 因此，活性肽是篩選藥物、制備保健食品、食品添加劑以及疫苗的天然資源（李亞潔等，2020；李晶等，2014；張勝等，2010），在生物醫(yī)藥及保健食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景 （Xian 等，2021；Liu 等，2020；Wang等，2018；孫亞男等，2017；劉潔等，1997）。

活性肽是蛋白質(zhì)的功能活性片段， 可以提供生長(zhǎng)發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)元素， 其跟蛋白質(zhì)比起來(lái)有獨(dú)特的生理活性特點(diǎn)?；钚噪挠捎隗w積小、在體內(nèi)使用率高而有著良好的健康推動(dòng)作用。近幾年，日本和英國(guó)等國(guó)家已用活性肽功能因子開發(fā)出各種美妝類產(chǎn)品和老年人食品等系列產(chǎn)品， 并取得良好的反饋，增加了社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

柞蠶蛹蟲草富含蛋白質(zhì)（都興范等，2021），是制備活性肽的首選材料。 但由于缺少產(chǎn)品精深加工，無(wú)法有效提高柞蠶蛹蟲草相關(guān)產(chǎn)品的附加值。目前， 以菌菇類為材料制備活性肽的研究已有較多報(bào)道（張芳藝等，2023；熊川等，2019；劉果等，2017），制備方式方法也很多，其中酶解法因具有工藝成熟、副產(chǎn)物生成少、專一性好、人體容易吸收等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。 本文主要對(duì)柞蠶蛹蟲草蛋白的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化（張禹等，2021； 蘆鑫等，2018；馬淑慧等，2017），旨在提供一種高效的柞蠶蛹蟲草蛋白酶解方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 供試材料：柞蠶蛹蟲草由沈陽(yáng)師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所提供。

主要試劑：硫酸銅，酒石酸鈉鉀，鹽酸，氫氧化鈉，硫酸，蒽酮，堿性蛋白酶，胰蛋白酶。

雙縮脲試劑配制： 溶解1.5 g 硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉于500 mL 去離子水中， 在攪拌下加入300 mL 的10%氫氧化鈉溶液， 用水稀釋到1 L，貯存于內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中備用標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液配制： 用0.05 mol/L 的氫氧化鈉溶液配制濃度為5 g/L 的牛血清蛋白溶液。

1.2 儀器與設(shè)備 ESJ-182 型電子天平購(gòu)自中國(guó)沈陽(yáng)市龍騰電子有限公司；TG1650-W 型高速離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘怡離心機(jī)儀器有限公司；CS-Ⅲ型高純水發(fā)生儀購(gòu)自經(jīng)緯分析儀器有限責(zé)任公司；SB25-12 型超聲波清洗機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技技術(shù)股份有限公司；H-H 型數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-5100 型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 柞蠶蛹蟲草蛋白質(zhì)的制備 柞蠶蛹蟲草干品置于55 ℃烘箱中，待完全烘干后稱取100 g 樣品加入1000 mL 水浸泡0.5 h，撈出后擠干水分剁碎，再放入之前用來(lái)浸泡的1000 mL 水中，溫火煮1 h 后用紗布過(guò)濾。重復(fù)2 次，再用多層紗布過(guò)濾，浸提液定容至1 L 備用。

用0.1 mol/L 的NaOH 溶液將上述浸提液pH調(diào)至10.0。浸提1 h，6000 r/min 離心15 min，取上清液，再用0.1 mol/L 的HCl 將上清液pH 調(diào)至等電點(diǎn)，靜沉1 h，待沉淀析出后，6000 r/min 離心15 min，得到蛋白質(zhì)沉淀。 將沉淀調(diào)至中性后進(jìn)行冷凍干燥制得柞蠶蛹蟲草蛋白粉， 保存到離心管中備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上篩選結(jié)果，選取最佳的酶組合（堿性蛋白酶+胰蛋白酶），從加酶量、酶解時(shí)間、酶解pH 和反應(yīng)溫度四個(gè)因素進(jìn)行考察， 確定四個(gè)因素對(duì)柞蠶蛹蟲草蛋白液酶解程度的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 10 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以酶解時(shí)間（A）、加酶量（B）、pH（C）和反應(yīng)溫度（D）為影響因素，以多肽得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（王元川等，2023；金司陽(yáng)等，2023）， 優(yōu)化柞蠶蛹蟲草活性肽的提取工藝（鄭冰姝等，2021；張睿，2015），響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 加酶量對(duì)多肽得率的影響 由圖1 可知，當(dāng)?shù)孜镆欢〞r(shí)， 多肽得率隨加酶量的增加呈先升高后下降最終趨于平緩的趨勢(shì)。 當(dāng)加酶量達(dá)到2%時(shí)，多肽得率最大，為75%。隨著酶量的繼續(xù)增加在2% ~ 2.5%時(shí)， 多肽得率呈下降趨勢(shì)， 降至60%之后， 盡管酶量繼續(xù)增加， 多肽得率穩(wěn)定在60%左右。 因此2%的加酶量為最佳比例。

圖1 加酶量對(duì)多肽得率的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)多肽得率的影響 由圖2 可知，從總體上看，在一定的溫度變化范圍內(nèi)，多肽的得率隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)多肽提取率最高，為50%。 當(dāng)溫度高于55 ℃后，多肽得率有輕微下降的趨勢(shì)，但差異較小。通過(guò)酶的相關(guān)特性可知， 當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低，所以推測(cè)高于55 ℃后的下降趨勢(shì)是因此產(chǎn)生。 所以，確定多肽提取的最佳溫度為55 ℃，并將55 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)多肽得率的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多肽得率的影響 由圖3 可知，酶解時(shí)間達(dá)2 h 的多肽得率最高，為55%。 短于或長(zhǎng)于這個(gè)時(shí)間， 多肽的得率均低于55%，由圖可明顯看出，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，多肽得率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間到6 h 后，多肽得率基本平穩(wěn)，在45%左右輕微波動(dòng)。 因此，應(yīng)選擇2 h 作為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)多肽得率的影響

2.1.4 pH 對(duì)多肽得率的影響由圖4 可知，多肽得率隨pH 的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)。 pH為7 ～8 時(shí)多肽得率穩(wěn)定在48%左右，當(dāng)pH 繼續(xù)升高到9 后，此時(shí)多肽得率最高，達(dá)到55%。 pH升高到10 時(shí)，多肽得率仍穩(wěn)定在55%。 而后，隨著pH 的繼續(xù)升高，多肽得率開始下降。 因此，pH在9 ～10，均是可選擇的最佳酶解pH。

圖4 pH 對(duì)多肽得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，以多肽得率為評(píng)定指標(biāo)，分別進(jìn)行29組試驗(yàn)， 采用Design-Expert 10 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸擬合，響應(yīng)值（Y）和各因子（A、B、C、D） 之間的二次回歸模型為：Y=83.52-0.63A-0.87B-8.95C+2.57D-17.88AB+3.57AC+16.55AD-1.48BC +4.55BD +6.3CD -17.54A2-14.01B2-15.21C2-13.26D2。 回歸模型方差分析見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

失擬項(xiàng)P 值為0.1726＞0.1， 表明二次模型擬合程度較好， 能準(zhǔn)確反映不同條件對(duì)柞蠶蛹蟲草多肽得率的影響。模型系數(shù)分析表明，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間誤差較小，一次項(xiàng)對(duì)模型具有顯著性影響（P＜0.05），根據(jù)F 值可知，試驗(yàn)各因素對(duì)柞蠶蛹蟲草多肽得率影響的強(qiáng)弱順序依次為：pH＞加酶量＞反應(yīng)溫度＞酶解時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面交互作用分析 利用Design-Expert 10 軟件繪制四個(gè)因素交互作用對(duì)柞蠶蛹蟲草多肽提取率影響的響應(yīng)圖。 由圖5 可知，pH、酶解時(shí)間、反應(yīng)溫度和加酶量對(duì)多肽得率的影響均顯著，其中，pH 對(duì)多肽得率的影響最為顯著。 通過(guò)對(duì)響應(yīng)面坡度， 等高線密度以及性狀等多方面對(duì)比分析四種因素對(duì)柞蠶蛹蟲草多肽得率的影響順序?yàn)椋簆H＞酶解時(shí)間＞反應(yīng)溫度＞加酶量。

圖5 四因素對(duì)多肽得率影響的響應(yīng)面圖

2.4 最佳提取工藝的確認(rèn)與驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面軟件得出的數(shù)據(jù)分析可知， 柞蠶蛹蟲草蛋白液最優(yōu)酶解條件為：酶解時(shí)間2.81 h、加酶量2%、pH 9.77、反應(yīng)溫度56.04 ℃。考慮到試驗(yàn)的可操作性，調(diào)整最佳酶解條件為： 酶解時(shí)間2.8 h、 加酶量2%、pH 9.7、反應(yīng)溫度56 ℃。 按照修正條件進(jìn)行三次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證， 測(cè)得柞蠶蛹蟲草多肽得率平均值為86.1%，與預(yù)測(cè)值87.52%接近，表明最佳提取條件下提取的多肽得率比較穩(wěn)定， 該模型能較好地預(yù)測(cè)輔助提取柞蠶蛹蟲草活性肽。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 對(duì)柞蠶蛹蟲草蛋白的提取條件采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果表明， 柞蠶蛹蟲草蛋白的最優(yōu)提取條件為酶解時(shí)間2.8 h、加酶量2%、pH 9.7、反應(yīng)溫度56 ℃。 在此條件下， 提取的多肽得率為86.1%， 與預(yù)測(cè)值87.52%接近，說(shuō)明該條件下提取的柞蠶蛹蟲草多肽得率較高，該模型具有較好的預(yù)測(cè)性，可為今后柞蠶蛹蟲草產(chǎn)業(yè)化開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。