馬鈴薯高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

張薇

摘要 為優(yōu)化馬鈴薯高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究鄂馬鈴薯3號莖段外植體在不同激素濃度配比下愈傷組織及分化情況，獲得最佳愈傷組織及分化激素配比，再采用根癌農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化進行篩選，獲得最佳轉(zhuǎn)化體系，為馬鈴薯優(yōu)質(zhì)品種的基因工程育種提供依據(jù)。結(jié)果表明，不同激素濃度配比下愈傷組織及分化率差異較大，其中2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA 激素配比下可高效再生出芽，出芽率高達(dá)100%，芽長勢粗壯。通過構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambia1301，以GV3101為介導(dǎo)菌株，預(yù)培養(yǎng)2～3 d，共培養(yǎng)2～3 d，350 mg/L羧芐青霉素，50 mg/L卡那霉素篩選濃度轉(zhuǎn)化效果較好，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)65%，其中轉(zhuǎn)化苗在0.8 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA激素配比的培養(yǎng)基中可形成再生植株，再生率達(dá)80%，苗莖粗壯，根系發(fā)達(dá)。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯；莖段；激素；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化率

中圖分類號 S532? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）03-0035-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.009

Optimization of High Efficiency Regeneration and Genetic Transformation System in Potato

Abstract In order to optimize the efficient regeneration and genetic transformation system of potato， the effects by using stem segment of Hubei potato No.3 as explants were studied in different hormone concentration ratios， and the optimal callus and differentiation hormone ratio were obtained. Then， the genetic transformation of Agrobacterium tumefaciens was used for screening to obtain the best transformation system， which provided the basis for genetic engineering breeding of high quality potato varieties. The results showed that the callus and differentiation rate were great different under the ratio of different hormone concentration. The hormone ratio of 2.0 mg/L ZR and 0.1 mg/L IAA could regenerate the buds efficiently， the germination rate was as high as 100%， and the bud growth was strong. By constructing expression vector pCambia1301 in plant， GV3101-mediated strain， pre-cultured for 2-3 days， and co-cultured for 2-3 days， and 350 mg/L carbenicillin， and 50 mg/L kanamycin to screen the concentration was better. The transformation efficiency could reach 65%. The transformed seedlings could form regenerated plants in the medium of 0.8 mg/L IBA and 0.2 mg/L NAA hormone. The regeneration rate could reach 80%， the stems were thick and the roots were developed.

Key words Potato;Stem segment;Hormone;Genetic transformation;Conversion rate

馬鈴薯（Solanun tuberosum L.）為茄科茄屬一年生草本塊莖植物［1］，是我國主要糧食作物之一，產(chǎn)量排在小麥、玉米、水稻之后占第四位［2］。馬鈴薯具有生長周期短、營養(yǎng)豐富、加工產(chǎn)品眾多等特點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人民生活中占有重要地位。

馬鈴薯栽種常采用無性繁殖的方式［3］，即塊莖的種苗繁育方式。這導(dǎo)致許多品種發(fā)生退化，且隨著栽培年限的延長更加嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)其原因在于各種病毒、細(xì)菌、真菌等對馬鈴薯塊莖和種苗的侵染。采用植株組織培養(yǎng)的方式可連續(xù)產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)種苗和無毒種薯。通過馬鈴薯莖尖的脫毒、葉片和莖段等器官的快繁都能達(dá)到較好的效果［4-6］。另外，通過基因工程技術(shù)培育抗病、抗蟲及抗逆性強、品質(zhì)改良的種薯［7-8］。

許多國內(nèi)外研究者［9-12］對馬鈴薯再生體系進行了研究，MS為常用的基本培養(yǎng)基；莖尖、莖段、薯塊等是再生途徑中主要采用的外植體；實驗常采用的激素有細(xì)胞分裂素6-BA和ZT，細(xì)胞生長素IAA、NAA、2，4-D、赤霉素。雖然馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系已有報道，但由于適用的轉(zhuǎn)化受體及外植體材料存在差異［13-15］，轉(zhuǎn)化過程也有從愈傷的間接再生體系和直接分化再生體系的存在［16-18］，導(dǎo)致馬鈴薯試驗所需試驗條件及培養(yǎng)基組成等差異明顯。筆者研究了不同激素配比對馬鈴薯品種鄂馬鈴薯3號莖段愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為馬鈴薯優(yōu)質(zhì)品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用鄂馬鈴薯3號無菌瓶苗莖段作為外植體。

1.2 培養(yǎng)基

以MS培養(yǎng)基，附加不同6-BA、ZR、NAA、IAA、GA3激素，20 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.8，作為愈傷誘導(dǎo)及分化的基本培養(yǎng)基。以MS+30 g/L蔗糖+pH 5.8作為根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時侵染液。以MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+pH 5.8，附加不同濃度IBA和NAA，作為轉(zhuǎn)基因植株再生的基本培養(yǎng)基。以LB作為菌體培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，即5 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化鈉，17 g/L瓊脂，pH 7.0，附加50 mg/L利福平（Rifampin，以下簡寫為Rif）和50 mg/L卡那霉素（Kanamycin，以下簡寫為Kan）。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)及芽的分化

將苗齡15～20 d的馬鈴薯無菌瓶苗莖段切成長0.5～0.8 cm小段，接種于附加不同濃度6-BA、ZR、NAA、IAA、GA3的13種梯度培養(yǎng)基（表1）中，進行愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，每個梯度3個重復(fù)。20～25 ℃光照培養(yǎng)，1 500～2 000 lx光照16 h，培養(yǎng)20 d后觀察愈傷出愈情況及出芽率（出芽率=出芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%）。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建

1.4.1 農(nóng)桿菌菌液制備。

構(gòu)建植物表達(dá)載體pCambia1301，利用GV3101菌株，獲得農(nóng)桿菌菌液。農(nóng)桿菌單菌落在附加50 mg/L Rif和50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，加入MS（附加200 μmol/L乙酰丁香酮）液體培養(yǎng)基中重懸20～30 min，稀釋至OD600=0.4～0.6，備用。

1.4.2 莖段的預(yù)培養(yǎng)。

將苗齡15～20 d的馬鈴薯無菌瓶苗莖段切成長0.5～0.8 cm小段，置于預(yù)培養(yǎng)基中，20～25 ℃，避光培養(yǎng)2～3 d。預(yù)培養(yǎng)基選用愈傷誘導(dǎo)效果較佳的2.5 mg/L ZR+1.0 mg/L IAA+0.20 mg/L GA3激素配比培養(yǎng)基（表1 10號梯度）。

1.4.3 侵染及共培養(yǎng)。

預(yù)培后的莖段放入無菌培養(yǎng)皿（90 mm×90 mm）中，倒入農(nóng)桿菌菌液，期間不斷振蕩，侵染8 min，莖段轉(zhuǎn)入吸干紙上吸干表面殘留菌液，接種于墊有濾紙的共培培養(yǎng)基中，20～25 ℃，避光培養(yǎng)2～3 d。選用激素配比為2.5 mg/L ZR+1.0 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3（表1 10號梯度）作為共培培養(yǎng)基，并附加200 μmol/L乙酰丁香酮。

1.4.4 轉(zhuǎn)化莖段的篩選及抗性芽的獲得。

共培后將莖段轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中，20～25 ℃光照培養(yǎng)，每15～20 d換一次板，直至分化出抗性芽。選用2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA激素配比培養(yǎng)基（表1 7號梯度）作為篩選培養(yǎng)基，附加抑菌劑350 mg/L羧芐青霉素和卡那霉素。利用濃度梯度試驗確定Kan最適濃度，設(shè)立5個濃度梯度（0、25、50、75、100 mg/L），每個梯度3個重復(fù)。20～25 ℃光照培養(yǎng)16 h，每15 d換一次板，觀察第40天時外植體的篩選及出芽情況。

1.4.5 轉(zhuǎn)化抗性植株的再生。

轉(zhuǎn)化苗再生培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+pH 5.8，附加不同激素濃度的NAA和IBA進行配比，30 mg/L Kan 和350 mg/L羧芐青霉素，根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果設(shè)置5個處理（表2），將已分化出1～2 cm小苗，從基部切下，插入生根培養(yǎng)基中，每瓶5棵生根苗，每個梯度3個重復(fù)。觀察轉(zhuǎn)化抗性植株生根率（生根率=已長根植株數(shù)/總植株數(shù)×100%）及根長勢情況。

1.4.6 轉(zhuǎn)化植物的PCR鑒定。

待轉(zhuǎn)化植株生根后，采用CTAB法提取DNA。未轉(zhuǎn)化生根野生苗基因組DNA為陰性對照，植物表達(dá)載體質(zhì)粒為陽性對照，利用Kan抗性基因NPTII的2個特異引物（5′→3′）CGTTGTCACTGAAGCGGGAGGG和GAGCGGCGATACCGTAAAGCAC進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，94 ℃ 5 min，72 ℃ 8 min，35個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保溫。PCR反應(yīng)條件為 10 μL Mix+7.4 μL ddH2O+0.3 μL引物-F+0.3 μL引物-R+2 μL DNA，反應(yīng)結(jié)束后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計和分析，計算該轉(zhuǎn)化體系下的轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化率 =已檢出Kan抗性的陽性植株數(shù)/總再生植株數(shù)×100%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化的影響

使用細(xì)胞分裂素6-BA和ZR，細(xì)胞生長素NAA和IAA，以及赤霉素GA3 3類植物激素，并根據(jù)前人研究結(jié)果，設(shè)計了5種激素不同濃度配比的13個處理梯度。結(jié)果表明，鄂馬鈴薯3號莖段可直接分化出芽（梯度1～3號除外），不同激素配比下的愈傷誘導(dǎo)和芽分化情況差異明顯（表1）。

2種激素配比下（梯度1～7號），出愈率較高的是3號（2.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA）和7號（2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA）2個處理，外植體莖段傷口處長出愈傷組織，呈綠色。3種和4種激素配比下（8～13號），出愈率明顯高于2種激素配比，外植體莖段各部位均有愈傷長出，傷口處較多，呈淺綠色。

6-BA與NAA激素配比下未分化出芽，且與GA3配合使用時出芽率極低，分化出的芽較細(xì)，無明顯葉片，表明6-BA不利于鄂馬鈴薯3號莖段的分化，但對愈傷組織的誘導(dǎo)能夠起到一定的作用。ZR與GA3、IAA和6-BA多種激素配比（梯度8～13號）下出芽率均達(dá)100%，但所出芽較細(xì)，無明顯葉片，苗弱；ZR與IAA配比（梯度6～7號）時能得到較高的出芽率，分化出的芽較粗，葉片較大且呈深綠色，苗壯，其中7號（2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA）出芽率可達(dá)100%。結(jié)果表明，ZR和GA3這2種配比其他激素時，可以促進鄂馬鈴薯3號莖段的分化出芽，但ZR誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽較壯，GA3誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽較弱。考慮操作的方便性、芽生長的狀態(tài)、試驗成本等，鄂馬鈴薯3號莖段愈傷誘導(dǎo)及分化出芽的最佳激素配比為2.0 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA。

2.2 遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2.2.1 卡那霉素濃度對外植體出愈率和出芽率的影響。

在預(yù)培、侵染及共培后，將莖段置于含有不同濃度Kan（0、25、50、75、100 mg/L共計5個處理梯度）的培養(yǎng)基中，40 d后觀察愈傷組織及出芽情況（圖1）。當(dāng)Kan濃度為0和25 mg/L時，不能有效抑制愈傷組織生長及芽的分化，無法進行有效的篩選，且增加了后期檢測抗性植株的難度；當(dāng)Kan濃度為50 mg/L時愈傷誘導(dǎo)率較低，出芽率為80%；當(dāng)Kan濃度為75 mg/L時愈傷組織誘導(dǎo)率急劇降低且莖段外植體多數(shù)褐化，出芽率為27.8%；當(dāng)Kan濃度為100 mg/L時莖段全部褐化壞死，且出芽率為零。因此，選取50 mg/L Kan是理想的篩選濃度，既能有效地抑制愈傷的誘導(dǎo)及芽的分化，又不致于細(xì)胞迅速死亡。

2.2.2 IBA和NAA配比對轉(zhuǎn)化植株根誘導(dǎo)及再生的影響。

5個處理均能誘導(dǎo)出根，且所誘導(dǎo)出的根長勢情況及誘導(dǎo)率均存在一定差異（表2和圖2），根誘導(dǎo)率為處理③> 處理①（⑤）>處理②>處理①，生根率最高可達(dá)80%。2種激素（IBA和NAA）不論是單獨使用還是配合使用均能誘導(dǎo)抗性苗長根，單一激素使用時（④和⑤），IBA誘導(dǎo)產(chǎn)生的根較長較細(xì)，NAA誘導(dǎo)產(chǎn)生的根較短較粗；2種激素配合（①～③）使用誘導(dǎo)產(chǎn)生的根比單獨使用NAA時要長，比單獨使用IBA時要粗，由此可知，2種激素配合使用對根的發(fā)育及生長更有利。表明選擇處理③ 0.8 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA作為轉(zhuǎn)基因植株再生的培養(yǎng)基。

2.2.3 PCR檢測轉(zhuǎn)化效率。

對已獲得的轉(zhuǎn)化再生抗性植株進行PCR檢測（圖3），檢測40棵抗性植株，有26棵具Kan抗性的抗性植株，轉(zhuǎn)化效率為65%，其中還有少量呈現(xiàn)弱帶的抗性植株，可能是DNA提取時DNA濃度較低或轉(zhuǎn)化后的拷貝數(shù)較低導(dǎo)致。

3 結(jié)論與討論

該研究表明，鄂馬鈴薯3號作為無性繁殖的作物，容易誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和再生植物，整個試驗周期較短、出芽率高、再生植物粗壯，在此基礎(chǔ)上進行根癌農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究也得到了較高的轉(zhuǎn)化率（65%），是基因工程育種中優(yōu)質(zhì)種薯獲得的來源。另外，受體系統(tǒng)的建立，關(guān)系到組織培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)化的成敗，該試驗選用試管苗莖段作為外植體，進行組織培養(yǎng)，具有取材方便、不易污染等優(yōu)點，成功建立和優(yōu)化了該品種莖段外植體的愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)體系，可以直接通過外植體一步分化出苗，出芽率達(dá)100%。

由于植物快繁過程中生長素和分裂素等激素的水平和配比，對誘發(fā)細(xì)胞的分裂、生長和分化起著決定性作用［19］。因此，該試驗研究了5種激素水平下的13種處理方式莖段外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化試驗，結(jié)果表明，在2 mg/L ZR+0.1 mg/L IAA激素配比下能夠較好地進行愈傷誘導(dǎo)及芽的分化，分化率高達(dá)100%。在馬鈴薯組織快繁的研究中，研究者［20-22］常用激素NAA、6-BA、GA3 3種進行芽的分化，分化率都未達(dá)100%；王萍等［11］研究表明ZT是誘導(dǎo)馬鈴薯分化較為理想的激素，分化率達(dá)57.14%，很少用到激素ZR，而該試驗嘗試使用ZR，且表明ZR能夠成功地誘導(dǎo)馬鈴薯愈傷組織及芽的分化，分化率高達(dá)100%，認(rèn)為ZR是一種應(yīng)用于馬鈴薯芽分化時較好的一種植物生長調(diào)節(jié)劑。

選用組培最佳試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進行根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)化，確定了鄂馬鈴薯3號莖段外植體的最佳Kan選擇壓為50 mg/L，再生抗性芽率達(dá)80%，轉(zhuǎn)化植株陽性率達(dá)65%，使用0.8 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA配比下轉(zhuǎn)化芽再生植株根粗壯。試驗選擇壓與薯塊［23-24］Kan選擇壓相同，而葉片［25］的選擇壓為20 mg/L Kan，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是基因型和試驗外植體選取的不同，后期需根據(jù)實際情況進行選擇壓敏感性試驗，以獲得最佳選擇壓。轉(zhuǎn)化苗生根時使用激素IBA或NAA只能增強或減弱苗根的長勢，Veale等［15］不添加激素直接進行生根，羅源［18］在轉(zhuǎn)化苗生根時添加激素NAA，而該試驗選用IBA和NAA配合使用獲得較高的生根率，根長勢粗壯。

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