基于梯度降溫的草魚暫養(yǎng)及有水?；钸\輸技術(shù)

何靜怡，魏 涯，岑劍偉,3, ，郝淑賢，陳勝軍，黃 卉，趙永強(qiáng)，王悅齊，楊少玲，林 織

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572019；4.廣東順欣海洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 陽江 529800）

我國消費者對“生猛海鮮”的意識根深蒂固，鮮活水產(chǎn)品的售價比冷凍產(chǎn)品高，經(jīng)濟(jì)類活魚售價是冷凍或冷藏魚的2～5 倍，鮮活水產(chǎn)品的長途保活運輸是實現(xiàn)產(chǎn)品升值的有效途徑[1-2]，因此?；钸\輸是鮮活水產(chǎn)品市場流通的核心關(guān)鍵技術(shù)。目前對運輸應(yīng)激因素的考慮更加全面，多種生理生化指標(biāo)的測量及組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使得魚體的應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制逐漸清晰[3]，有水運輸中水質(zhì)及魚類應(yīng)激行為的實時監(jiān)測技術(shù)已實現(xiàn)遠(yuǎn)程化、智能化[4-5]，活運技術(shù)的進(jìn)步改善了我國水產(chǎn)品產(chǎn)銷及分布不均衡等問題。草魚（Ctenopharyngodon idellas）作為我國四大家魚之一，是重要的經(jīng)濟(jì)魚類，因自身具有廣溫性、易訓(xùn)食、長速快的特點使其養(yǎng)殖量常年穩(wěn)居首位[6]，2021年我國草魚總產(chǎn)量為557.51萬 t，居全國淡水養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量第一[7]。溫度是影響活魚運輸?shù)闹匾蛩?，合適的低溫環(huán)境可有效減慢代謝，維持運輸過程中的良好水質(zhì)和減少能量消耗，Santos等[8]研究水溫對江尾海鰻幼魚的麻醉效果，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)和復(fù)蘇時間隨溫度升高而降低，且不受體質(zhì)量影響；Chen Chengzhuang等[9]研究高溫脅迫下不同飼養(yǎng)策略對鯉魚各項血清生化指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)間歇喂養(yǎng)方式可減小其高溫應(yīng)激的體內(nèi)氧化反應(yīng)；這些研究均揭示了溫度對魚類的重要性。此外，冷馴是活魚運輸中必不可少的步驟，作為暫養(yǎng)的關(guān)鍵步驟之一，降溫速率將直接影響魚體健康進(jìn)而影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。目前關(guān)于草魚?；钸\輸中溫度及降溫速率的研究尚少，本實驗探索降溫速率對草魚存活時長、生化指標(biāo)等的影響，以期為制定草魚暫養(yǎng)及有水運輸規(guī)范、實現(xiàn)草魚長途有水?；钸\輸提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚購自廣東省廣州市蓮湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為（1200±100）g，體長（43±2）cm，無體表傷，眼球清澈，鱗片完整。實驗用魚置于提前曝氣的水中暫養(yǎng)2 h以緩解運輸及操作應(yīng)激，期間保證供氧充足。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、葡萄糖檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；魚皮質(zhì)醇（cortisol，COR）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 北京萊伯沃德科技有限公司；氨氮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、納氏試劑北京金智研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

風(fēng)冷式冷水機(jī) 蘇州肯道節(jié)能設(shè)備有限公司；Multi 3630 IDS便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀 德國WTW公司；Synergy全功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HWS-24恒溫水浴鍋上海一恒科學(xué)儀器有限公司；高速臺式冷凍離心機(jī)湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 草魚休眠臨界溫度

利用實驗室自制梯度降溫及暫養(yǎng)裝置（圖1），按照袁圓玥等[10]的降溫方式進(jìn)行梯度降溫實驗：當(dāng)溫度（T）＞25 ℃時，以3 ℃/h降溫；當(dāng)10 ℃＜T≤25 ℃，以2 ℃/h降溫；當(dāng)T≤10 ℃時，以1 ℃/h降溫。將緩解運輸應(yīng)激后的9 尾草魚放入預(yù)先曝氣24 h的清水中，水中溶氧大于8.5 mg/L、pH 7.5±0.2、暫養(yǎng)密度為1∶20（kg/L）。記錄草魚在不同溫度下的呼吸頻率及活動現(xiàn)象，鰓蓋一張一合記為一次呼吸，統(tǒng)計1 min的呼吸次數(shù)[11]，并記錄不同溫度下魚體對光照（室內(nèi)自然光）、敲擊箱體產(chǎn)生的振動聲、物體輕觸體表等反應(yīng)的靈敏度。

圖1 實驗室梯度降溫及暫養(yǎng)裝置Fig.1 Schematic diagrams of gradient cooling and temporary care devices used in the laboratory

1.3.2 冷馴降溫處理

以梯度降溫方式（10 ℃＜T≤25 ℃，以2 ℃/h降溫）[10]將暫養(yǎng)箱水溫從室溫（23～25 ℃）分別降至24、20、18、16、14、12 ℃，每個溫度記錄6 尾魚，每4 h觀察草魚存活狀態(tài)，每12 h采集水樣，參考HJ 535—2009《水質(zhì) 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法》[12]的方法測定氨氮濃度。

由實驗結(jié)果可知，16 ℃為草魚的半休眠溫度，分別以1、3、5、7 ℃/h將暫養(yǎng)水箱溫度從室溫（23～25 ℃）降溫至16 ℃后，快速將草魚轉(zhuǎn)移至pH 7.5±0.2、溶氧大于8.5 mg/L、魚-水比為1∶20（kg/L）的保活水箱中，冷水機(jī)控溫，保證水溫為（16.0±0.1）℃，?；钇陂g室內(nèi)無光照，空氣泵持續(xù)打氧。設(shè)置3 組平行，每組15 尾魚，分別在?；?、12、24、36、48 h時各取3 尾魚。以室溫條件下（不做降溫處理）?；畹牟蒴~為對照組，魚-水比、其他水環(huán)境參數(shù)及光照同實驗組。

1.3.3 血清制備

分別在?；?、12、24、36、48 h時各取3 尾魚采血。參考袁仲瑾等[11]的方法，用一次性無菌針管從草魚尾部靜脈取血，全血不加抗凝劑，37 ℃恒溫生化箱中靜置0.5 h，待血液凝固分層后，以4 ℃、4000 r/min離心10 min，取血清于－80 ℃保存?zhèn)溆?，分別取對照組?；?、12、24、36、48 h的草魚血液，血清制備方法同實驗組。

1.3.4 血清生化指標(biāo)測定

用檢測試劑盒測定ALT活力、AST活力、AKP活力、COR質(zhì)量濃度、血糖（glucose，GLU）濃度。

1.3.5 抗氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

用檢測試劑盒測定SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力、MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚休眠臨界溫度確定

魚類等變溫動物都有一個能區(qū)分生死的溫度，稱為臨界溫度[13]，在有水保活過程中，合適的低溫環(huán)境可降低魚體呼吸頻率和代謝水平，在無水?；钸^程中，可將環(huán)境溫度降低至魚類的生態(tài)冰溫區(qū)使其進(jìn)入休眠狀態(tài)[14]。由表1可知，草魚的應(yīng)激靈敏度和呼吸頻率隨溫度降低逐漸下降。當(dāng)溫度高于28 ℃時，呼吸急促，出現(xiàn)浮頭或撞壁等應(yīng)激行為；在20～26 ℃時，魚體應(yīng)激敏感，鰓蓋張合規(guī)律，魚體正常游動；溫度降至18 ℃時，呼吸頻率明顯降低，對敲擊箱體的振動聲和光照反應(yīng)不明顯，對觸碰刺激仍保持敏感；降至16 ℃時，應(yīng)激反應(yīng)遲鈍，全部靜止在水底，鰓蓋張合幅度??；降溫至8 ℃時，鰓蓋半閉合，將魚體放回室溫水中5～8 min內(nèi)復(fù)蘇；降至6 ℃時，魚體出現(xiàn)裂鰓，根據(jù)蔡曉芳[13]和袁仲瑾[11]等關(guān)于臨界溫度的判斷方法，以出現(xiàn)呼吸極不規(guī)律、觀察不到鰓蓋張合甚至出現(xiàn)裂鰓時的溫度作為臨界溫度，故認(rèn)為6 ℃為草魚的運輸臨界溫度，16 ℃的魚體應(yīng)激不敏感，靜止在水底，是適合草魚運輸?shù)陌胄菝邷囟取?/p>

表1 不同溫度下草魚的呼吸頻率和活動現(xiàn)象Table 1 Respiratory rates and activity phenomena of grass carp at different temperatures

2.2 不同溫度條件下的水質(zhì)總氨氮質(zhì)量濃度變化及草魚生存函數(shù)曲線

水質(zhì)對魚類存活具有重要意義，溫度、氨氮濃度等是魚類存活的重要影響因素[15]，Zhao Congcong等[16]研究不同濃度的總氨氮質(zhì)量濃度對幼年草魚存活80 d后各器官特異性的影響，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度總氨氮有利于促進(jìn)和維持草魚苗生長，當(dāng)總氨氮質(zhì)量濃度達(dá)到9.0 mg/L時，肌肉細(xì)胞開始表現(xiàn)出毒性，不同器官的抗氧化系統(tǒng)反應(yīng)不同，其中鰓更易受到低濃度氨氮的影響。當(dāng)水溫大于28 ℃和小于12 ℃時會引起魚體不良生理反應(yīng)，這與周鑫[17]研究的溫度脅迫結(jié)果一致，當(dāng)溫度超過26 ℃時草魚各組織中熱應(yīng)激蛋白70（heat stress protein 70，hsp70）和hsp90的表達(dá)量均顯著上升，說明溫度升高導(dǎo)致魚體內(nèi)蛋白質(zhì)變性，而溫度高于28 ℃時，草魚的耗氧率隨溫度升高而下降。由圖2可知，水質(zhì)氨氮質(zhì)量濃度隨?；顣r間延長和溫度升高持續(xù)增加，?；钕嗤瑫r間下，24 ℃水溫中氨氮質(zhì)量濃度最高，該溫度下?；?8 h后的水質(zhì)總氨氮質(zhì)量濃度為23.70 mg/L，而該?；顣r間下12、14、16 ℃的總氨氮質(zhì)量濃度顯著降低，分別為8.23、8.27、8.73 mg/L，這與黃蓋鰈、梭鱸的排氨率隨溫度降低而降低的研究結(jié)果[18-19]一致，表明低溫可有效降低草魚的新陳代謝，減緩水體中氨氮的富集速度。硬骨魚的排泄產(chǎn)物主要由氨和尿素組成，其中氨氮占排泄物總量的80%[20]，魚作為變溫動物，溫度可直接影響其新陳代謝速率和蛋白質(zhì)利用率。有研究表明，魚類的氨氮排泄率與溫度呈正相關(guān)[21-22]。圖3為不同溫度下草魚的生存函數(shù)曲線，16 ℃下草魚的存活率最高，存活時間最長，66.7%的草魚存活時長超過70 h，而12、14、24 ℃僅有33.3%存活時長超過50 h，結(jié)合存活時長、總氨氮質(zhì)量濃度及草魚的活動情況，認(rèn)為16 ℃是草魚進(jìn)行暫養(yǎng)及有水?；钸\輸?shù)耐扑]溫度。

圖2 溫度對水質(zhì)總氨氮質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of temperature on the concentration of total ammonia nitrogen in water

圖3 溫度對草魚存活時間的影響Fig.3 Effect of temperature on the survival time of grass carp

2.3 降溫速率對草魚血清生化指標(biāo)的影響

由圖4A～C可知，1、5 ℃/h降溫處理組在?；?8 h后ALT、AST、AKP水平均高于3 ℃/h組和對照組，魚體承受的應(yīng)激損傷隨時間延長逐漸加重；以3 ℃/h速率降溫時，魚體的AST及AKP活力在不同?；顣r間點達(dá)最大值后下降，表明在此條件下，魚體能較快完成自身調(diào)節(jié)，在低溫環(huán)境下重新達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡。3 ℃/h組AST活力在保活12 h時達(dá)最大值（143.75 U/L），?；?8 h下降為102.01 U/L，低于相同?；顣r長下其他降溫處理組；各組的ALT活力整體上隨保活時間延長逐漸升高，1、5 ℃/h降溫處理組?；?8 h后ALT活力分別為3 ℃/h組的1.5、1.8 倍；3 ℃/h組AKP活力隨?；顣r間延長先增加后降低，1、3、5 ℃/h組最大值分別為48.74、45.53、60.55 U/L，是對照組的2.1、2.4 倍和3.0 倍，5 ℃/h組的AKP活力最高，影響最大。由圖4D、E可知，3 個降溫處理組保活12、24、36 h的COR及GLU水平均顯著高于對照組；3 ℃/h降溫處理組?；?8 h后的GLU含量顯著低于1、5 ℃/h組。1 ℃/h降溫處理組?；? h時，COR和GLU水平均顯著高于其他組別；由于在1 ℃/h降溫速率下，達(dá)到半休眠溫度所需的冷馴時間長，魚體處于水溫變化的時間長，GLU濃度隨時間延長先增加后降低，與COR質(zhì)量濃度變化趨勢一致；1、3、5 ℃/h降溫處理組GLU濃度分別在?；?2、24 h和36 h達(dá)最大值，為6.10、5.52、7.18 mmol/L，?；?8 h后GLU濃度均有所下降，但仍高于對照組GLU水平。對比對照組與降溫處理組的5 項血清生化指標(biāo)可得，降溫操作使魚體產(chǎn)生應(yīng)激，其中5 ℃/h降溫速率快，水溫短時間內(nèi)快速降低造成魚體強(qiáng)烈應(yīng)激，COR質(zhì)量濃度迅速升至較高水平應(yīng)對刺激，保證機(jī)體的正常生命活動，相比于長時間的慢速降溫，短時間的快速降溫使魚體的應(yīng)激更強(qiáng)烈，而1 ℃/h組降溫至16 ℃所需時間長，進(jìn)入半休眠狀態(tài)晚于3、5 ℃/h組，水溫長時間變化導(dǎo)致魚體產(chǎn)生持續(xù)應(yīng)激反應(yīng)，因此以1、5 ℃/h的速率降至16 ℃后進(jìn)行?；钍刽~體的應(yīng)激比3 ℃/h更強(qiáng)烈，損傷更大。

圖4 降溫速率對草魚ALT（A）、AST（B）、AKP（C）、COR（D）、GLU（E）的影響Fig.4 Effect of cooling rate on ALT (A),AST (B),AKP (C),COR (D),and GLU (E) in grass carp

2.4 降溫速率對草魚抗氧化能力的影響

SOD是魚體的主要抗氧化物酶，作為機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的首道防線，其消除氧化脅迫的效果顯著，SOD活力能間接反映機(jī)體清除自由基的能力[23]，由圖5A可知，相比于對照組，降溫處理組的SOD活性均顯著增加，隨?；顣r間延長先增加后降低，1、3、5 ℃/h降溫處理組均在?；?6 h達(dá)最大值，分別為260.49、276.23、315.01 U/mg，是對照組?；钕嗤瑫r長的1.9、2.1、2.4 倍。CAT是清除自由基重要的抗氧化酶，3、5 ℃/h降溫處理組的CAT活力?；?4 h達(dá)最大值（7.06、6.92 U/mg），隨后逐漸下降；1 ℃/h降溫處理組的CAT活力隨?；顣r間延長逐漸升高，?；?8 h后與對照組相比無顯著差異，均低于3、5 ℃/h組（圖5B）。GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)中的酶類抗氧化劑，能清除因自由基氧化所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，降解H2O2，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害[20]。由圖5C可知，3 ℃/h組的GSH-Px活力隨?；顣r間延長先增加后降低；?；?8 h的1 ℃/h組GSH-Px活力高于3、5 ℃/h降溫處理組和對照組，且3 ℃/h降溫處理組的GSH-Px活力恢復(fù)至初始狀態(tài)；?；?8 h后1、5 ℃/h處理組GSH-Px活力是3 ℃/h組的1.2、1.1 倍。據(jù)劉奇奇[24]研究操作及低溫脅迫對四指馬鲅的抗氧化系統(tǒng)結(jié)果可知，魚體在應(yīng)對低溫應(yīng)激時，肝臟和肌肉等不同組織中的GSHPx含量不同，肝臟中含量更高，GSH-Px活性可間接反映肝臟損傷狀態(tài)，酶活性的升高說明活性氧自由基含量增加，表明1、5 ℃/h條件對魚體的氧化應(yīng)激更嚴(yán)重。根據(jù)Kim等[25]研究魚類氧化應(yīng)激的結(jié)果可知，較高的SOD、CAT、GSH-Px活性分別與體內(nèi)過高的O2－·、H2O2和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平有關(guān)。SOD和GSH-Px活性在快、慢速降溫處理組中均較高，表明在降溫過程中，產(chǎn)生較多的O2－·和ROS，上述兩種酶在清除和抵御ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，這與羅偉等[26]的研究結(jié)果相似，在溫度應(yīng)激下魚血清中GSH-Px活性較高。由圖5D可知，1 ℃/h降溫處理組的MDA含量隨保活時間延長先升高后降低再升高，在24 h時降至最低，3、5 ℃/h組均在?；?6 h降至最小值5.27、6.02 nmol/mg；1、3、5 ℃/h降溫處理組?；?8 h的MDA含量分別是對照組?；?8 h的1.9、1.4 倍和1.7 倍，可見1、5 ℃/h降溫處理組魚體的氧化應(yīng)激強(qiáng)烈，ROS含量增多，從而加深氧化應(yīng)激反應(yīng)程度。降溫處理組的SOD、CAT及GSH-Px活力基本上隨?；顣r間延長先升高后降低，表明降溫導(dǎo)致魚體內(nèi)自由基失衡，誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)，3 ℃/h降溫處理組?；?8 h后，酶活性恢復(fù)至初始狀態(tài)，而過快或過慢降溫對魚體組織均會造成不同程度損傷，不能及時且準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)抗氧化酶的含量達(dá)到穩(wěn)態(tài)環(huán)境，1、5 ℃/h降溫處理組對魚體的線粒體數(shù)量和功能的影響遠(yuǎn)大于3 ℃/h組，進(jìn)而影響ROS的產(chǎn)生。

圖5 降溫速率對草魚SOD活性（A）、CAT活性（B）、GSH-Px活性（C）、MDA含量（D）的影響Fig.5 Effect of cooling rate on SOD (A),CAT (B),GSH-Px (C),and MDA (D) levels in grass carp

3 討論

3.1 草魚的臨界溫度確定

本實驗中，溫度變化引起草魚應(yīng)激反應(yīng)，溫度升高草魚代謝加快，應(yīng)激敏感，對水體的污染加重，溫度過低產(chǎn)生低溫脅迫，眼球出現(xiàn)紅血絲等不良生理反應(yīng)。在草魚的有水?；钸\輸中，水溫不應(yīng)高于28 ℃或低于6 ℃。通過觀察12～24 ℃范圍內(nèi)草魚的存活情況及水質(zhì)總氨氮質(zhì)量濃度發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高，氨氮質(zhì)量濃度顯著增加，存活時間延長先增加后減少。這和朱祥宇等[27]研究不同溫度條件下草魚苗的排氨率結(jié)果相似，在24 ℃水中排氨率達(dá)到最大值（18.99 mg/h），15 ℃達(dá)到最小值（7.53 mg/h），草魚的耗氧率、排糞率均隨溫度升高而增加，呼吸代謝增強(qiáng)，水質(zhì)污染速率加快，心肌興奮性加強(qiáng)，過高的溫度將導(dǎo)致呼吸活動和心臟功能紊亂。因此，當(dāng)溫度高于28 ℃或低于6 ℃時不利于草魚的保活運輸，在16 ℃時草魚進(jìn)入半休眠狀態(tài)，應(yīng)激反應(yīng)遲鈍，存活時間最長，總氨氮含量最低，是進(jìn)行運輸?shù)睦硐霚囟取?/p>

3.2 不同降溫速率對草魚應(yīng)激反應(yīng)的影響

魚類在進(jìn)行長途運輸過程中，常受到來自外界的壓力，其生理應(yīng)激從激活交感神經(jīng)反應(yīng)開始，刺激垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素，再由腎間組織釋放以COR為主的皮質(zhì)類固醇，參與應(yīng)激反應(yīng)的被動調(diào)節(jié)[28]，COR刺激下游生理過程（新成代謝和免疫反應(yīng)）應(yīng)對環(huán)境變化，進(jìn)一步影響動物的行為、生長和生存，高COR水平與食物攝入量、食物轉(zhuǎn)化效率、能量消耗和生長性能呈負(fù)相關(guān)[29]。葡萄糖含量的升高主要是由兒茶酚胺和COR分別激活肝臟糖異生和肌肉組織糖原分解引起，葡萄糖通過影響胰島素的分泌進(jìn)而影響蛋白質(zhì)分解和脂肪氧化[29-31]，魚體內(nèi)的血糖由于肝臟糖原代謝和糖異生反應(yīng)，短期內(nèi)出現(xiàn)“高血糖”癥狀[10]，隨保活時間延長，該癥狀得以緩解。不同降溫速率下COR和GLU含量隨時間延長先增加后降低，均高于對照組，表明降溫引起魚體應(yīng)激，保活24 h內(nèi)COR質(zhì)量濃度和GLU濃度升高，48 h后兩指標(biāo)均有所下降，甚至與?；畛跗跓o顯著差異，表明48 h后魚體可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)各系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境，亦表明COR及GLU濃度僅適合作為短期應(yīng)激魚體的評估指標(biāo)，超過48 h后該指標(biāo)的準(zhǔn)確度降低。與1、5 ℃/h降溫處理組相比，3 ℃/h降溫處理組的COR質(zhì)量濃度和GLU濃度最低，?；?8 h后基本恢復(fù)初始水平，表明以3 ℃/h的降溫速率進(jìn)行冷馴時魚體的應(yīng)激反應(yīng)程度小。

3.3 不同降溫速率對草魚肝臟的影響

肝臟是魚體內(nèi)最大的腺體器官，具有代謝、營養(yǎng)吸收、免疫等多種功能[32]，ALT和AST是肝臟連接糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)代謝的重要酶，作為評價肝臟病變程度最可靠的指標(biāo)，當(dāng)魚體未受到強(qiáng)烈應(yīng)激時2 種酶活性較低[33]，其中，ALT主要存在于肝臟中，AST除存在于肝臟外，還存在于心肌細(xì)胞中，因此AST活力亦能反映心肌細(xì)胞受損傷程度[34]。AKP是重要的磷酸單酯水解酶和非特異性磷酸酶，能催化磷酸單酯水解反應(yīng)，同時在消解病原體、細(xì)胞吞噬、蛋白質(zhì)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移、鈣磷代謝等過程中發(fā)揮重要作用，可衡量魚體非特異性免疫能力水平，在非必需氨基酸的合成和蛋白質(zhì)分解代謝中發(fā)揮重要的中間作用[35-37]。?；?8 h后1、5 ℃/h降溫處理組的AST和ALT活力均高于3 ℃/h組，表明1、5 ℃/h的降溫速率對心肌和肝臟的損傷更顯著，這與華茂圳等[38]研究降溫速率對斑石鯛無水?；畹慕Y(jié)果一致，其認(rèn)為3 ℃/h冷馴后無水保活6 h對斑石鯛產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)最小，本實驗中以3 ℃/h對草魚進(jìn)行冷馴，降溫梯度小、時間短，魚體可快速進(jìn)入半休眠狀態(tài)。在應(yīng)激過程中，ROS過量產(chǎn)生會增加溶酶體膜的通透性和溶酶體蛋白水解酶向胞漿的釋放，其中AKP是溶酶體的主要酶之一[36]，其活性可反映溶酶體狀態(tài)，進(jìn)而反映魚體的非特異性免疫能力。3 ℃/h組?；?6 h的AKP活力下降，表明魚體隨?；顣r間延長在調(diào)節(jié)自身免疫，達(dá)到新的平衡狀態(tài)。1 ℃/h組的AKP活力持續(xù)增加，表明長時間的冷馴過程也對魚體免疫能力造成損害；?；?8 h后5 ℃/h組的AKP活力高于3 ℃/h，快速降溫會損傷溶酶體膜，對魚體的免疫系統(tǒng)造成傷害。

3.4 不同降溫速率對草魚氧化應(yīng)激的影響

ROS的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間缺乏平衡（即氧化應(yīng)激）會導(dǎo)致DNA羥化、蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡[39]，因此與氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高會對DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成破壞性影響。其中SOD、CAT、GSH-Px是魚體內(nèi)重要的抗氧化酶系[40]，其活性可反映魚體內(nèi)的氧化應(yīng)激程度，SOD主要催化·分解為O2和H2O2，H2O2被CAT和GSH-Px等部分消除，GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種催化H2O2分解的酶，能特異性地催化還原型谷胱甘肽與H2O2的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[40-42]。同時，GSH-Px能夠催化GSH變?yōu)檠趸凸入赘孰?，使有毒的過氧化物還原變?yōu)闊o毒的羥基化合物[43]。體內(nèi)ROS的不斷積累誘發(fā)膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量反映了細(xì)胞膜過氧化的程度，是判斷脂質(zhì)過氧化程度和組織損傷的指標(biāo)[11]。

緩慢降溫能避免因溫度快速變化導(dǎo)致魚體應(yīng)激，但將延長魚體進(jìn)入半休眠狀態(tài)的時間，長時間處于水溫變化的環(huán)境中可能導(dǎo)致魚體持續(xù)應(yīng)激，而快速降溫可縮短冷馴時間，但降溫過快對魚體組織損傷巨大。本實驗中，7 ℃/h降溫速率下草魚的存活時長小于40 h，不利于長途活運；5 ℃/h降溫處理組的SOD活性高于其他組別，表明該降溫速率對魚體的應(yīng)激顯著，產(chǎn)生大量ROS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，縮短存活時長。1、5 ℃/h處理組降溫結(jié)束后的MDA含量均顯著高于3 ℃/h，隨?；顣r間延長，快速降溫會損傷魚體肝臟等器官，減少酶的釋放，降低清除自由基的能力，加深脂質(zhì)過氧化程度，升高M(jìn)DA含量。以3 ℃/h降至16 ℃?；?8 h后血清生化指標(biāo)及抗氧化酶活力與該降溫速率下保活0 h的差異最小，在該降溫速率下魚體能通過調(diào)節(jié)自身代謝，使得魚體的抗氧化及非特異性免疫能力在低溫下達(dá)到新的平衡狀態(tài)，3 ℃/h降溫處理的草魚抗逆性最強(qiáng)，這與張玉晗等[44]在無水?；钸^程中低溫休眠處理花鱸發(fā)現(xiàn)3 ℃/h處理后?；? h對花鱸的肝臟損傷最低結(jié)論相似。

4 結(jié)論

本實驗基于梯度降溫研究了草魚的臨界及半休眠溫度，記錄不同溫度條件下草魚的存活時長、監(jiān)測不同溫度下水質(zhì)氨氮含量間接反映溫度對草魚生理代謝的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)草魚暫養(yǎng)及有水活運的最適溫度為16 ℃，其臨界低溫為6～8 ℃；在進(jìn)行長途運輸時，水溫應(yīng)當(dāng)小于24 ℃。分別以1、3、5、7 ℃/h的降溫速率將暫養(yǎng)箱水溫從室溫（23～25 ℃）降至草魚半休眠溫度（16 ℃）后開展保活，在不同?；顣r長測量血清各項指標(biāo)，得到在暫養(yǎng)冷馴過程中，適合草魚的降溫速率為3 ℃/h，該降溫速率對草魚體內(nèi)各項生理影響最小，其抗逆性最強(qiáng)，適合長途運輸。本研究獲得了草魚適宜的暫養(yǎng)及運輸推薦溫度，后續(xù)模擬長途運輸實驗亟待開展，驗證經(jīng)過3 ℃/h的降溫速率冷馴后的草魚在不同運輸條件的生理變化及對其品質(zhì)的影響，加快草魚低溫誘導(dǎo)休眠技術(shù)在產(chǎn)業(yè)上的推廣應(yīng)用。