人工窖泥微生物群落對濃香型白酒發(fā)酵過程風(fēng)味代謝物形成的影響

毛鳳嬌，黃 均，周榮清,2, ，張宿義，秦 輝

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065；2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646699；3.四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646699）

濃香型白酒的生產(chǎn)工藝特點之一是以內(nèi)襯棲息多種厭氧微生物窖泥的長方形地下窖池為發(fā)酵容器[1]。窖泥微生物群落與窖齡和發(fā)酵過程參數(shù)的調(diào)控密切相關(guān)，顯著影響發(fā)酵過程及白酒的品質(zhì)和產(chǎn)率[2]。一般認為，許多重要風(fēng)味化合物的形成與窖泥菌群的組成與演替息息相關(guān)[3-4]。應(yīng)用可培和免培技術(shù)對窖泥的研究已經(jīng)較清楚地了解了微生物群落的構(gòu)成及功能，窖泥中的群落主要由細菌和真菌構(gòu)成[5-6]。梭菌被認為是合成丁酸、己酸等中、短鏈脂肪酸的關(guān)鍵種群之一[7]。有研究表明，隨著窖齡的增長，窖泥中的微生物多樣性增加[3]，優(yōu)質(zhì)窖泥具有穩(wěn)健的群落結(jié)構(gòu)。這些研究主要集中在破譯窖泥本身的微生物群落結(jié)構(gòu)和組成方面。然而，迄今對窖泥棲息菌群的貢獻缺乏科學(xué)的認識，目前尚不清楚窖泥微生物對風(fēng)味化合物的貢獻以及作用機制。本實驗通過設(shè)置有泥和無泥組模擬發(fā)酵體系，解析酒醅間風(fēng)味化合物的差異。同時，應(yīng)用高通量測序技術(shù)檢測酒醅中細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，探究風(fēng)味化合物與微生物群落之間的相關(guān)性，以期闡明窖泥微生物群落對風(fēng)味形成的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有試劑 成都金山化學(xué)試劑有限公司；2×Taq聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ITS1/ITS4引物、DNase/RNase-free Deionized Water和真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

強化人工窖泥為實驗室培養(yǎng)，質(zhì)量分數(shù)5%的100 a窖泥培養(yǎng)液接種到1 a的新泥中，同時接種1%的太空大曲，室溫厭氧發(fā)酵60 d[5]。太空大曲、高粱、糠殼和酒醅均取自中國四川省瀘州市一家著名白酒企業(yè)，其中太空大曲通過接種1%的母曲生產(chǎn)，母曲是在神舟十一號飛船的太空艙中育種了1 個月的大曲粉經(jīng)逐批擴大培養(yǎng)得到[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL 16M高速冷凍離心機 長沙湘麓離心機儀器公司；S100TMThermal Cycler PCR儀、Gel DocTMXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；ND-1000 NanoDrop分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；Infinite M1000 Pro全自動多功能酶標儀 瑞士Tecan有限公司；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海雙捷實驗設(shè)備有限公司；PHS3C pH計 上海大普儀器有限公司；1260高效液相色譜、Trace 1300-TQS 9000頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集

使用5 L塑料容器（28 cm×19 cm×14 cm）作為實驗室反應(yīng)器模擬白酒發(fā)酵過程。設(shè)置窖泥組（JJP）和對照組（CJP）。窖泥組使用太空大曲和100 a窖泥培養(yǎng)液強化后的人工窖泥，厚度為4～4.5 cm，對照組中沒有窖泥。按照DB510500/T 36—2016《單糧濃香型白酒原酒生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》操作工藝流程完成蒸糧，將上一輪發(fā)酵后的酒醅與高粱、糠殼按照20∶5∶1進行混合，蒸熟，冷卻至40 ℃左右后添加20%（以體系質(zhì)量計）的太空大曲混合均勻，待冷卻到室溫后，將上述發(fā)酵糟裝入自制窖池中，用窖泥密封后置于培養(yǎng)箱內(nèi)（26～28 ℃）厭氧發(fā)酵60 d[8]。在發(fā)酵的第15、30、45天和第60天分上下兩層進行取樣，對照組分別標記為U-CJP、B-CJP，實驗組分別標記為U-JJP和B-JJP。

1.3.2 理化指標檢測

總酸、總酯的檢測方法分別參照GB/T 10345.4—1989《白酒中總酸的試驗方法》、GB/T 10345.5—1989《白酒中總酯的試驗方法》。水分質(zhì)量分數(shù)通過質(zhì)量法測定，在105 ℃下干燥至少4 h直至質(zhì)量恒定。樣品與超純水按照1∶9（g/mL）混合，使用pH計直接測量pH值。通過蒸餾法及乙醇計測定乙醇體積分數(shù)。淀粉和還原糖的含量采用Fehling試劑法測定[9]。

1.3.3 有機酸分析

有機酸的測定采用高效液相色譜法，參照Chen Suqi等[10]描述的方法略作修改：稱取5.0 g樣品置于50 mL離心管中，用20 mL H2SO4溶液（0.009 mol/L）稀釋，樣品渦旋5 min（200 r/min），超聲1 h（100 W、40 kHz）。經(jīng)超聲處理后的樣品在12000 r/min（4 ℃）條件下離心10 min。取3 mL上清液加入活化后的C18SPE純化柱，收集濾液，0.22 μm濾膜過濾，最后通過1260高效液相色譜分析。色譜條件：流動相為0.009 mol/L H2SO4溶液，流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫75 ℃。色譜柱為Alltech OA-1000有機酸柱（300 mm×7.8 mm），檢測器為紫外檢測器（波長210 nm）。用標準品乳酸、乙酸、丁酸和己酸等的濃度和峰面積繪制標準曲線對樣品進行定性、定量分析。

1.3.4 揮發(fā)性代謝物分析

揮發(fā)性代謝物及含量：采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，參考Zhang Liqiang等[11]的方法：將0.500 g樣品和20 μL內(nèi)標（0.0079 g/100 mL辛酸甲酯）加入20 mL頂空瓶中，置于60 ℃水浴鍋中平衡15 min，使用固相微萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）萃取50 min，然后將其插入進樣口解吸5 min，經(jīng)質(zhì)譜檢測。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：以20∶1分流模式進樣，載氣為純度99.99%的氦氣。升溫程序：起始溫度為40 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升溫至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持10 min。進樣口溫度為270 ℃，電子電離源，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z35～400。將揮發(fā)性代謝物數(shù)據(jù)與標準譜庫（NIST 2017）對比進行鑒定，根據(jù)保留指數(shù)選取正反匹配度均大于800的物質(zhì)給予分析[12]?；趦?nèi)標辛酸甲酯濃度和峰面積對鑒定的揮發(fā)性化合物采用峰面積歸一化法計算含量。

1.3.5 DNA提取和擴增子測序分析

按照Omega Mag-bind soil DNA試劑盒的操作說明提取DNA。1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop分光光度計檢測DNA的濃度、純度和完整性。使用引物338F和806R擴增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域，真菌以ITS1區(qū)域進行擴增[13]。利用建庫試劑盒MiSeq ReagentKit v3進行文庫構(gòu)建，PCR擴增產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠切膠獲得目標片段并純化回收，酶標儀測定濃度后，等濃度混合。然后送往上海派森諾生物科技有限公司，利用Illumina MiSeq測序平臺對DNA片段進行雙端（Paired-end）測序。測序數(shù)據(jù)使用官方提供的QIIME 2（http://qiime.org）云平臺分析[14]。根據(jù)Mothur軟件（v1.31.2）的結(jié)果計算Shannon多樣性指數(shù)和Chao1豐富度指數(shù)[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

樣本平均值之間的差異顯著性通過使用S P S S Statistics 22軟件的單因素方差分析（ANOVA）進行檢驗，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Excel 2021和Origin 2021軟件繪制數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以的形式表示。采用Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)評價微生物群落的α多樣性。用Simca 14.0軟件和pheatmap軟件分別對揮發(fā)性代謝物進行偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），并對PLS-DA的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）進行評分和熱圖聚類分析。用R語言的hmisc軟件包計算優(yōu)勢微生物（相對豐度＞1%）以及揮發(fā)性代謝物之間的Spearman相關(guān)系數(shù)（ρ）和顯著性（P），并根據(jù)|ρ|＞0.6和P＜0.05構(gòu)建共生網(wǎng)絡(luò)，然后在Cytosscape（v.3.60）軟件中進行可視化。用PICRUSt2軟件分析原核生物群落的功能組成[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標和有機酸的差異分析

在發(fā)酵過程中，兩組酒醅水分都是先增高后漸趨平緩。代謝所產(chǎn)生的水分質(zhì)量分數(shù)通常是以重力作用從上自下逐漸增高[17]，因此，下層酒醅水分質(zhì)量分數(shù)較高，且JJP高于CJP（圖1）。相反地，兩組酒醅的淀粉和還原糖含量在發(fā)酵過程中逐漸降低，且下層降幅高于上層[18]。JJP因棲息在窖泥中的菌群遷移到酒醅，并與酒醅的菌群互作，形成了良好的生態(tài)位[19]，使淀粉的利用率高于CJP，下層同樣高于上層[18]。發(fā)酵15 d后，還原糖亦呈現(xiàn)類似趨勢。發(fā)酵前期CJP上層接觸了空氣，菌群繁殖速率快，產(chǎn)生的還原糖更多。因窖泥棲息了大量產(chǎn)酸菌，尤其是發(fā)酵前期JJP的下層酒醅酸度大于CJP。隨著發(fā)酵的進行，Methanogen、Clostridiumsp.等的種間氫轉(zhuǎn)移、乳酸碳鏈延長、轉(zhuǎn)化己酸和丁酸等的代謝速率提高，JJP的pH值在發(fā)酵30 d后降低速率減緩[19]。兩組酒醅的乙醇體積分數(shù)在前、中期持續(xù)增加，且發(fā)酵前期CJP高于JJP，45 d后JJP下層的乙醇體積分數(shù)高于上層，發(fā)酵結(jié)束時，類似Gao Jiangjing等[17]報道的結(jié)果，兩組間上、下層酒醅的乙醇體積分數(shù)幾乎相等。

圖1 發(fā)酵過程中酒醅的理化特性Fig.1 Physicochemical characteristics of fermented grains during fermentation

如圖2所示，兩組酒醅中4 種優(yōu)勢有機酸的含量在前30 d均增幅較高，隨之變緩。JJP因后續(xù)發(fā)酵過程部分乳酸轉(zhuǎn)化為丁酸和己酸[17]，因此后期乳酸含量低于CJP，且丁酸和己酸在上、下層的含量都高于CJP，并持續(xù)增高[20]。這些結(jié)果揭示了窖泥的重要貢獻是將乳酸轉(zhuǎn)化為丁酸和己酸[21]，促進了己酸乙酯等風(fēng)味骨架成分的合成[22]。同時窖泥中的功能菌甲烷八疊球菌（Methanosarcina）在將乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷的同時也消耗H＋，減緩了體系的酸化，促進了己酸的合成[23]。

圖2 發(fā)酵過程中酒醅有機酸的變化Fig.2 Changes in organic acid contents of fermented grains during fermentation

2.2 揮發(fā)性代謝物構(gòu)成差異分析

如圖3所示，窖泥顯著提高了酒醅中揮發(fā)性代謝物的含量。JJP揮發(fā)性代謝物的含量在發(fā)酵過程中持續(xù)增高，而CJP僅在45～60 d緩慢增加。在15 d時，JJP下層揮發(fā)性代謝物的總含量較CJP高15.10 mg/kg，但上層僅高0.32 mg/kg，其中JJP下層酒醅乙酸含量比CJP高0.79 mg/kg，發(fā)酵60 d時，高2.29 mg/kg。經(jīng)15 d發(fā)酵，JJP己酸的含量較CJP高8.60 mg/kg，發(fā)酵至60 d時，兩種酒醅間己酸含量的差值高達13.57 mg/kg。發(fā)酵15～60 d，JJP和CJP下層酒醅的丁酸含量差值在2.24～2.75 mg/kg之間，而兩組酒醅的這些代謝物在上層僅略有差異。乙酸、己酸和丁酸的乙酯類化合物在JJP中的含量都高于CJP，尤其是JJP下層酒醅中己酸乙酯的含量始終高于CJP，且30 d時高達7.95 mg/kg。乳酸乙酯在JJP的含量顯著低于CJP。發(fā)酵結(jié)束時，JJP上、下層酒醅揮發(fā)性代謝物總量分別是90.91 mg/kg和74.92 mg/kg，但在CJP中僅分別是53.16 mg/kg和41.15 mg/kg。這些結(jié)果證實了窖泥菌群顯著影響酒醅的風(fēng)味輪廓，尤其顯著提高了風(fēng)味骨架成分己酸乙酯的含量[24]。

圖3 發(fā)酵過程中對照組和窖泥組酒醅中風(fēng)味代謝物的比較分析Fig.3 Comparison of flavor metabolites in fermented grains between the control and pit mud group during fermentation

酒醅中共檢出了109 種揮發(fā)性代謝物，包括酯類60 種、醇類20 種、酸類9 種、醛類4 種、酮類5 種和其他類11 種。在發(fā)酵過程中，JJP揮發(fā)性代謝物的含量持續(xù)增高，且高于CJP。這些結(jié)果表明，窖泥菌群與酒醅揮發(fā)性代謝物的組成和輪廓密切相關(guān)[25]。PLS-DA的結(jié)果也顯示，窖泥主要有益于提高酒醅中酯類、醇類和酸類的含量（圖4A）?；赩IP＞1.0，共鑒定出了24 種差異代謝物（圖4B），主要包括己酸、己酸乙酯、乙醇、亞油酸甲酯和乳酸乙酯等[8]。差異代謝物的熱圖分析結(jié)果也表明，JJP中差異代謝物的含量高于CJP，尤其是在發(fā)酵45 d后更明顯（圖4C）。發(fā)酵至15 d時，CJP下層揮發(fā)性代謝物的含量高于上層，30 d時則相反，JJP亦呈現(xiàn)類似變化規(guī)律。但發(fā)酵45 d后，上層酒醅代謝物的含量高于下層，包括賦予其花果香、甜味和酸味的己酸、丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯和2,3-丁二醇等濃香型白酒的特征風(fēng)味代謝物[26]。這些結(jié)果揭示了窖泥對酒醅特征風(fēng)味的貢獻特點[27]。

圖4 對照組和窖泥組酒醅揮發(fā)性代謝物的差異分析Fig.4 Differential analysis of volatile metabolites in fermented grains between the control and pit mud groups

2.3 微生物群落特征差異分析

2.3.1 群落多樣性差異

擴增子測序技術(shù)檢測發(fā)酵過程中酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的結(jié)果如表1所示。發(fā)酵結(jié)束時，各酒醅細菌群落的α多樣性指數(shù)低于初始酒醅F(xiàn)G0，但真菌群落的豐富度和多樣性增加。JJP下層酒醅細菌群落的Chao1和Shannon指數(shù)都高于上層酒醅。類似Wang Shilei等[28]報道的結(jié)果，窖泥顯著提高了酒醅微生物群落的豐富度和多樣性。在發(fā)酵過程中，酒醅細菌群落的豐富度先增后減，在30～45 d都增至穩(wěn)態(tài)，而JJP的增量大于CJP。真菌群落的多樣性和豐富度指數(shù)顯著低于細菌群落，真菌群落的豐富度在整個發(fā)酵過程中持續(xù)增大，45 d時多樣性達到峰值后，穩(wěn)定至60 d后略有降低。

表1 酒醅中微生物群落的豐富度和多樣性Table 1 Abundance and diversity indexes of microbial communities in fermented grains

2.3.2 群落結(jié)構(gòu)和組成差異

發(fā)酵過程酒醅細菌群落優(yōu)勢菌的豐度及結(jié)構(gòu)差異如圖5A所示。樣品間屬水平的差異因發(fā)酵周期而異。FG0中，優(yōu)勢細菌包括Lactobacillus（11.51%）、Delftia（20.77%）、Kroppenstedtia（22.88%）、Staphylococcus（14.63%）和Bacillus（10.73%）。經(jīng)15 d發(fā)酵后，Lactobacillus成為絕對優(yōu)勢菌，曾有研究報道發(fā)酵5 d時，Lactobacillaceae的相對豐度己高達98.0%[20]。主要代謝物乳酸和乙醇能抑制酸、醇敏感菌的生長，但過量則會導(dǎo)致酒醅微生物群落的失衡，降低基酒的品質(zhì)和產(chǎn)率[29]。發(fā)酵至60 d時，CJP中Lactobacillus的相對豐度降低，分別是95.88%（上層）和97.42%（下層）。Bacillus、Rhodococcus、Thermoactinomyces、Ralstonia和Pseudomonas的相對豐度增高，且上層高于下層。但在45 d時，JJP中Lactobacillus的相對豐度已經(jīng)開始降低，下層（91.48%）降幅高于上層（96.85%）。窖泥降低了酒醅中Lactobacillus的相對豐度[30]，多種細菌的相對豐度增高，下層的增幅高于上層，主要包括Kroppenstedtia、Bacillus、Clostridium_sensu_stricto_12、Thermoactinomyces、Acetobacter、Ralstonia和Pseudomonas，且產(chǎn)己酸、丁酸及酯類化合物的重要功能菌Clostridium_sensu_stricto_12僅在JJP中檢出[31]。發(fā)酵結(jié)束時，Bacillus、Rhodococcus、Thermoactinomyces和Acetobacter的相對豐度增高。整個發(fā)酵過程中，JJP中分泌淀粉酶和纖維素酶等水解酶的Kroppenstedtia的相對豐度顯著高于CJP[32]。

圖5 窖泥對酒醅細菌（A）和真菌（B）分布和組成的影響Fig.5 Effects of pit mud on the distribution and composition of bacterial (A) and fungal communities (B) at the genus level in fermented grains

如圖5B所示，F(xiàn)G0中優(yōu)勢真菌包括Thermoascus（43.11%）、Rhizomucor（23.36%）、Thermomyces（16.97%）和Pichia（3.35%）。發(fā)酵前45 d，Thermoascus的相對豐度在兩種酒醅中無顯著變化，發(fā)酵結(jié)束時，CJP和JJP上、下層豐度分別降至1.30%和2.26%及6.75%和6.30%，表明CJP中嗜熱酶類的活力可能被降低[33]。發(fā)酵至45d時，Rhizomucor逐漸增高至峰值，在CJP與JJP上、下層的相對豐度分別是29.13%和27.30%及24.91%和36.72%，后期則顯著降低。Thermomyces的變化趨勢類似Rhizomucor。在發(fā)酵前15 d，JJP的Kazachstania從0.05%增至22.26%（上層）和41.36%（下層），直至45 d時相對豐度一直較高，且高于CJP的20.29%和5.47%。Kazachstania參與多種白酒風(fēng)味成分的合成，尤其是醇類（苯乙醇）及酯類化合物，賦予基酒獨特的花果香[34-35]。類似地，濃香型白酒重要功能真菌之一的Pichia豐度也逐漸增高[36]。由此可見，窖泥的貢獻主要是提高酒醅中部分功能菌的豐度及降低Lactobacillus的豐度。

2.4 微生物群落與揮發(fā)性代謝物的相關(guān)性分析

本實驗計算了CJP和JJP中優(yōu)勢屬和揮發(fā)性代謝物之間的Spearman相關(guān)系數(shù)[37]，選擇系數(shù)|ρ|＞0.6和顯著性P＜0.05作為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的強相關(guān)性[38]。CJP有13 個細菌屬和11 個真菌屬與20 種揮發(fā)性代謝物顯著相關(guān)（圖6A）。JJP中有11 個細菌屬和9 個真菌屬與23 種揮發(fā)性代謝物顯著相關(guān)（圖6B）。初步確定這些屬是合成揮發(fā)性代謝物的功能菌，且JJP微生物群落和揮發(fā)性代謝物的相關(guān)性比CJP的更強[38]。CJP中Bacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora和Rhodococcus與20 種揮發(fā)性代謝物呈強正相關(guān)，對酒醅的風(fēng)味特征貢獻顯著。Bacillus和Kroppenstedtia分泌多種耐熱酶，且生產(chǎn)多種重要風(fēng)味代謝物[32,39]。Thermoactinomyces和Saccharopolyspora與乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯和乳酸乙酯等酯類化合物顯著正相關(guān)，相關(guān)研究也表明Saccharopolyspora有利于酯類化合物的產(chǎn)生[32]。JJP中乙醇和2,3-丁二醇與絕大多數(shù)微生物呈顯著正相關(guān)。己酸是Clostridium_sensu_stricto_12的主要代謝成分，且與乙醇、3-甲基丁醇、己酸和己酸乙酯呈顯著正相關(guān)，而與乙酸乙酯呈負相關(guān)[40]。對于真菌群落，Kazachstania在CJP中與乙酸乙酯呈負相關(guān)，但在JJP中與己酸和己酸異戊酯呈顯著正相關(guān)。Thermoascus在CJP和JJP中與多種揮發(fā)性代謝物呈負相關(guān)，類似Zhang Yuandi等[32]報道的結(jié)果。此外，在CJP中Rhizopus、Rhizomucor和Monascus與乙醇、2,3-丁二醇和3-甲基丁醇的含量呈顯著正相關(guān)，可能與這些曲霉菌的還原酶活性有關(guān)[41]。JJP中Pichia與己酸和己酸乙酯呈顯著正相關(guān)[6]。

2.5 代謝通路分析

基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）以及差異揮發(fā)性代謝物代謝通路分析結(jié)果，構(gòu)建了酒醅揮發(fā)性代謝物，相關(guān)酶的代謝網(wǎng)絡(luò)如圖7A所示，PICRUSt2預(yù)測了發(fā)酵過程中細菌群落編碼相關(guān)酶的豐度（圖7B）。揭示了CJP和JJP中參與淀粉代謝和主要風(fēng)味成分代謝酶的組成和豐度差異，尤其糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途徑和脂肪酸合成途徑[42]。JJP的EMP途徑大部分酶的豐度高于CJP，意味著窖泥菌群促進了葡萄糖的轉(zhuǎn)化。JJP中脂肪酸合成途徑的多數(shù)酶，如己酸合成酶（EC 1.3.1.38、EC 2.3.1.16、EC 6.2.1.1），丁酸合成酶（EC 2.3.1.9、EC 2.8.3.8）的豐度也顯著高于CJP，且下層顯著高于上層，解釋了JJP下層己酸和己酸乙酯含量顯著高的原因。作為多種酯類化合物前體的脂肪酸，即可經(jīng)氧化反應(yīng)生成醇、酮等，亦可經(jīng)酯酶（EC 3.1.1.1和EC 3.1.1.3）催化合成酯類[43]，兩種酶在細菌群落中的差異表達與CJP和JJP中酯類物質(zhì)的含量差異吻合。淀粉是白酒釀造所需的主要碳源，酒醅中的淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖等還原糖，可被微生物直接利用，并通過EMP途徑產(chǎn)生丙酮酸，然后經(jīng)乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27）轉(zhuǎn)化為乙醇[23]，乳酸脫氫酶是催化乳酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，再經(jīng)鏈延長途徑合成己酸的關(guān)鍵酶[44]，JJP中與乳酸相關(guān)的酶在30 d時豐度高于CJP，且下層高于上層，解釋了乳酸減少和己酸增加的原因。丙酮酸發(fā)酵生成乙酸和乳酸是酒醅細菌代謝的重要特征[45]。由于JJP中EC 1.2.5.1和EC 2.8.3.18上調(diào)，乙酸的代謝量增加。乙偶姻作為2,3-丁二醇的前體，在乙酰乳酸合成酶（EC 2.2.1.6）和乙酰乳酸脫氫酶（EC 4.1.1.5）的催化下由丙酮酸衍生而來，且這兩種酶在JJP發(fā)酵的第15天表達量最高。乙偶姻轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇過程所參與的丁二醇脫氫酶（EC 1.1.1.4）在JJP的第60天表達量最高，研究結(jié)果也顯示JJP中2,3-丁二醇的含量高于CJP。

圖7 重要揮發(fā)性化合物和酶的綜合代謝途徑（A）以及相應(yīng)酶的豐度變化（B）Fig.7 Comprehensive metabolic pathways of important volatiles (A) and enzymes and changes in the abundance of corresponding enzymes (B)

3 結(jié)論

窖泥在濃香型白酒發(fā)酵過程中具有重要作用，顯著影響了酒醅的微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，以及揮發(fā)性風(fēng)味代謝物的含量。揭示了窖泥對酒醅中細菌群落的影響，尤其是Lactobacillus的豐度，且影響了真菌群落，驅(qū)動了酒醅功能菌群的富集。窖泥顯著提高了酒醅風(fēng)味代謝物的含量，尤其是特征風(fēng)味代謝物己酸乙酯的含量。窖泥的貢獻具有空間屬性，下層酒醅己酸增加量和乳酸降低量高于上層酒醅。研究結(jié)果為濃香型白酒發(fā)酵體系中風(fēng)味代謝物的調(diào)控提供理論依據(jù)。