珍稀瀕危飄帶兜蘭葉綠體全基因組種內(nèi)變異研究

高鑫禎 唐露 汪雨 邵士成 羅艷

摘 要： ???飄帶兜蘭 （Paphiopedilum parishii） 分布范圍狹窄，僅在中國、緬甸、泰國以及老撾有少量分布。近年來，因生境破壞和人為濫采而導(dǎo)致飄帶兜蘭野生種群極度縮減。為開發(fā)種內(nèi)多態(tài)性的分子標(biāo)記用于保護(hù)生物學(xué)研究，該研究對(duì)飄帶兜蘭4個(gè)野生個(gè)體經(jīng)測序、組裝、注釋獲得的葉綠體基因組序列，與已公布的飄帶兜蘭2個(gè)個(gè)體的葉綠體全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析飄帶兜蘭葉綠體基因組的種內(nèi)差異。結(jié)果表明：（1） 飄帶兜蘭葉綠體基因組具有典型被子植物葉綠體基因組環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，基因組長度為154 403～154 809 bp，共編碼129個(gè)基因，包括78個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、39個(gè)tRNA基因、8個(gè)rRNA基因，以及4個(gè)假基因。（2） 在飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體葉綠體基因組中檢測到103～107個(gè)簡單重復(fù)序列 （simple sequence repeats，SSRs） 位點(diǎn)，其中21個(gè)SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性。此外，在6個(gè)個(gè)體葉綠體基因組中還檢測到60個(gè)長序列重復(fù)，包括17～21個(gè)正向重復(fù)、18～29個(gè)反向重復(fù)、9～16個(gè)回文重復(fù)、4～9個(gè)互補(bǔ)重復(fù)。（3） 通過比較6個(gè)個(gè)體葉綠體基因組序列的核苷酸多樣性，共發(fā)現(xiàn)70處變異，包括10個(gè)單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNPs） 、60個(gè)插入缺失 （InDels）。其中，有3個(gè)SNP位點(diǎn)發(fā)生了非同義替換，導(dǎo)致編碼功能基因的氨基酸發(fā)生改變；19個(gè)插入缺失多態(tài)性較高，具有開發(fā)為分子標(biāo)記的潛力。（4） 通過計(jì)算核苷酸多樣性值 （Pi） 共發(fā)現(xiàn)8個(gè)有變異的區(qū)域，Pi值為0～0.006 32，其中變異度較大的是rps3-rpl22、trnL-UAC-rpl32、rpoB-trnC-GCA以及ycf4，這些高變區(qū)可開發(fā)為分子標(biāo)記用于評(píng)估飄帶兜蘭遺傳多樣性。（5） 系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體葉綠體基因組序列聚在一起，與長瓣兜蘭互為姐妹群。綜上表明，飄帶兜蘭葉綠體基因組的SSRs、長序列重復(fù)、SNPs、[JP2]InDels以及核苷酸序列呈現(xiàn)了足夠的種內(nèi)多樣性，可開發(fā)成分子標(biāo)記用于該種的系統(tǒng)演化及保護(hù)生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞： ?葉綠體全基因組， 飄帶兜蘭， 序列差異， 多態(tài)性分子標(biāo)記， 插入缺失， 微衛(wèi)星

中圖分類號(hào)： ??Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ???A

文章編號(hào)： ??1000-3142（2024）01-0001-14

Intraspecific genetic variation within chloroplast

genome of a rare and endangered species

Paphiopedilum parishii （Orchidaceae）

GAO Xinzhen1，2， TANG Lu1， WANG Yu1，3， SHAO Shicheng1， LUO Yan1*

（ 1. Xishuangbanna Tropical Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Mengla 666303， Yunnan， China; 2. University of Chinese Academy

of Sciences， Beijing 100049， China; 3. School of Landscape Architecture， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract： ??Paphiopedilum parishii is a rare and endangered species with few localities and fragmented populations found in China， Myanmar， Thailand and Laos. Environmental changes and over-harvesting have led to a decrease in its wild populations. It is important to protect endangered species genetic diversity since it provides the species with the ability to adapt and survive. However， little is known about the genetic information of this species. This study aims to detect intraspecific variation and develop polymorphic genetic markers of P. parishii. The complete chloroplast genome of four individuals of wild P. parishii was obtained by sequencing， assembling and annotating， then compared with the existing genomic data of two individuals available from GenBank to detect the intraspecific variation. Further， simple sequence repeats （SSRs）， single nucleotide polymorphisms （SNPs）， and insertions and deletions （InDels） were identified. The results were as follows： （1） The four new sequencing chloroplast genomes were quadripartite， with a length between 154 403 bp and 154 809 bp， with 129 genes （78 protein coding genes， 39 tRNAs， 8 rRNAs and four pseudogenes）. （2） As a result of comparison of six individuals， 103-107 SSR loci were identified in the chloroplast genome of six individuals of P. parishii， and 21 SSRs were polymorphic. And 60 long repeats were found， including 17-21 forward repeats， 18-29 reverse repeats， 9-16 palindromic repeats， and 4-9 complement repeats. （3） In addition， a total of 10 SNPs and 60 InDels were uncovered across the plastome. Three of the non-synonymous mutations caused amino acid changes in functional domains. 19 InDels might be selected for possible chloroplast DNA markers to determine intraspecific variation. （4） The value of nucleotide diversity （Pi） was calculated ranging from 0-0.006 32 suggesting sequences with low variation. Hyper-polymorphic regions， e.g. intergenic spacers rps3-rpl22， trnL-UAC-rpl32， rpoB-trnC-GCA and ycf4 gene were identified as potential barcoding regions. （5） The phylogenetic analyses based on the complete chloroplast genome supported three lineages in Paphiopedilum， and six individuals of P. parishii form a monophyletic group. SSRs， long repeats， InDels， SNPs and nucleotide sequences showed sufficient intraspecific genetic variation in P. parishii. The molecular markers developed here will contribute to further evolutionary studies and conservation of P. parishii.

Key words： ?chloroplast genome， Paphiopedilum parishii， sequence divergence， polymorphic DNA markers， InDels， SSRs

遺傳多樣性代表著物種適應(yīng)環(huán)境和生存發(fā)展的能力，保存珍稀瀕危物種的遺傳多樣性是物種保護(hù)的重要目標(biāo) （Guerrant & Pavlik， 1998; 黃宏文， 2018）。葉綠體是植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行光合固碳和脅迫應(yīng)答的重要半自主遺傳細(xì)胞器，植物葉綠體基因組為環(huán)狀DNA分子，單親遺傳，基因組大小為107～218 kb，基因結(jié)構(gòu)和組成穩(wěn)定 （張韻潔和李德銖， 2011; Ivanova et al.， 2017）。葉綠體基因組通常為四分體結(jié)構(gòu)，包括兩個(gè)反向重復(fù)序列（inverted repeat， IR）、一個(gè)大單拷貝區(qū) （large single copy region， LSC） 和一個(gè)小單拷貝區(qū) （small single copy region， SSC） （Wolfe et al.， 1987; 田欣和李德銖， 2002; Jansen et al.， 2005; 張韻潔和李德銖， 2011; He et al.， 2019）。葉綠體基因組編碼110～130個(gè)基因，主要包括光合作用相關(guān)和葉綠體基因表達(dá)相關(guān)的基因等 （張韻潔和李德銖， 2011）。葉綠體基因組雖然較小，但包含有大量遺傳信息，在核苷酸序列水平和結(jié)構(gòu)重排上呈現(xiàn)出進(jìn)化與保守性，編碼區(qū)和非編碼區(qū)有不同進(jìn)化速率，在分子水平上有明顯差異，可用于區(qū)分種間關(guān)系、評(píng)估種間變異性等，被廣泛用于群體遺傳多樣性、系統(tǒng)演化等研究領(lǐng)域 （Wolfe et al.， 1987; 張韻潔和李德銖， 2011; He et al.， 2019; 黎若竹等， 2022）。近年來，利用種內(nèi)不同個(gè)體葉綠體基因組的種內(nèi)變異，為物種進(jìn)化研究、種質(zhì)資源利用以及瀕危植物保護(hù)提供了基礎(chǔ)遺傳信息（Ishizuka et al.， 2017; Muraguri et al.， 2020; Zhang RS et al.， 2020）。

兜蘭屬 （Paphiopedilum） 為蘭科（Orchi-daceae）杓蘭亞科 （subfamily Cypripedioideae）植物，有80余種，主要分布于亞洲至太平洋島嶼的熱帶亞熱帶地區(qū)的石灰?guī)r山地 （Cribb， 1998; 劉仲健等， 2009）。兜蘭的唇瓣因形似拖鞋而被稱為“拖鞋蘭”，具有極高的觀賞價(jià)值 （楊穎婕等， 2021）。近年來，兜蘭屬植物的自然生境局限于生態(tài)環(huán)境脆弱的喀斯特地區(qū)，加上過度采挖等人類活動(dòng)導(dǎo)致的生態(tài)退化和生境嚴(yán)重破壞，使得兜蘭屬植物野生種群數(shù)量急劇減少，部分兜蘭屬植物面臨野外滅絕的風(fēng)險(xiǎn) （羅毅波等， 2003; 楊穎婕等， 2021）。目前，所有野生兜蘭種類均列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》 （Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora， CITES），同時(shí)我國分布的野生兜蘭屬植物也全部列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（2021年9月頒布實(shí)施）。因此，我國野生兜蘭屬物種的瀕危機(jī)制與保護(hù)工作急需開展。

飄帶兜蘭 （Paphiopedilum parishii ）為附生蘭科植物，生于海拔1 000～1 100 m的樹干或石頭上，為我國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。飄帶兜蘭被世界自然保護(hù)聯(lián)盟 （International Union for Conservation of Nature， IUCN） 評(píng)估為瀕危等級(jí) （Endangered， ER），僅在中國云南南部、泰國、緬甸和老撾分布有少數(shù)的野生種群 （Rankou & Averyanov， 2015）。飄帶兜蘭具有極高的觀賞價(jià)值，在各植物園均有引種，但野生種群已極為罕見。Chen等 （2012） 在云南南部進(jìn)行了飄帶兜蘭繁殖生物學(xué)的觀察，發(fā)現(xiàn)該種具有獨(dú)特的自動(dòng)授粉機(jī)制。基于葉綠體全基因組發(fā)育基因組學(xué)的研究，飄帶兜蘭屬于兜蘭亞屬 （subgenus Paphiopedilum） （Guo et al.， 2021）。但是，有關(guān)飄帶兜蘭的遺傳信息仍不完善，缺乏評(píng)估遺傳多樣性及種內(nèi)多樣性的分子標(biāo)記，不利于對(duì)其開展綜合保護(hù)。

本研究選取飄帶兜蘭的4個(gè)野生個(gè)體進(jìn)行淺層基因組測序、組裝獲得葉綠體全基因組，并與已公開的該種2個(gè)個(gè)體葉綠體基因組 （Guo et al.， 2021; Kao et al.， 2021） 進(jìn)行基因組比較，分析飄帶兜蘭葉綠體基因組的種內(nèi)變異，理解其基因進(jìn)化水平和遺傳多樣性，以期開發(fā)種內(nèi)多態(tài)性的分子標(biāo)記用于保護(hù)生物學(xué)研究，為開展飄帶兜蘭的瀕危機(jī)制及物種保護(hù)研究提供遺傳信息基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 研究材料及DNA提取、測序

飄帶兜蘭4個(gè)個(gè)體分別采自云南省勐臘縣 （P. parishii_1 和P. parishii_2） 及瀾滄縣 （P. parishii_3 和P. parishii_4） 兩個(gè)野生居群 （圖1），取新鮮葉片放入硅膠中干燥。采用植物基因組DNA提取試劑盒 （TIANGEN， 中國北京） 提取葉片總DNA，使用IlluminaTruSeq文庫建立試劑盒 （San Diego， CA， USA） 構(gòu)建測序文庫，利用Illumina Hiseq 2500測序平臺(tái) （上海派森諾生物科技有限公司） 進(jìn)行淺層基因組測序。同時(shí)，在GenBank上下載已公開的另外2個(gè)飄帶兜蘭個(gè)體的葉綠體基因組序列 （P. parishii_5， MW528213和P. parishii_6， MN587822）進(jìn)行比較基因組分析。

1.2 葉綠體基因組的組裝和注釋

采用Fastp軟件對(duì)下機(jī)后的原始數(shù)據(jù) （raw data） 進(jìn)行過濾，獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù) （clean data） 后，用GetOrganelle v1.6.3程序?qū)y序后得到的數(shù)據(jù)組裝成葉綠體基因組 （Jin et al.， 2018）。組裝完成后的葉綠體基因組數(shù)據(jù)用Geneious Prime v2021.2.2的MAFFT工具進(jìn)行比對(duì)后，使用在線工具CPGAVAS2 （http：//47.90.241.85：16019/analyzer/annotate2） （Shi et al.， 2019），GeSeq （https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html） （Tillich et al.， 2017） 和tRNA-scan-SE v2.0.3 （Lowe & Chan， 2016） 對(duì)葉綠體基因組的蛋白質(zhì)編碼區(qū)、核糖體RNA （rRNA） 和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA （tRNA） 進(jìn)行注釋，參考已發(fā)表的兜蘭屬葉綠體基因組對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行校正。通過OGDRAW （https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw. html） 在線網(wǎng)站繪制飄帶兜蘭葉綠體基因組圖譜 （Lohse et al.， 2007）。使用Geneious Prime 2021.2.2軟件分析6個(gè)飄帶兜蘭葉綠體基因組的基本結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)LSC、SSC、IR的長度以及GC含量、蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA基因、rRNA基因的數(shù)目。

1.3 葉綠體基因組重復(fù)序列和SSR分析

通過MISA在線網(wǎng)站 （https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa） （Beier et al.， 2017） 測算葉綠體基因組中簡單重復(fù)序列 （simple sequence repeats， SSR） 的分布，將核苷酸最小重復(fù)數(shù)分別設(shè)置為10 （單核苷酸重復(fù)mononucleotide repeats）、5 （二核苷酸重復(fù)dinucleotide ?repeats）、4 （三核苷酸重復(fù)trinucleotide repeats）、3 （四核苷酸重復(fù)tetranucleotide ?repeats）、3 （五核苷酸重復(fù)pentanucleotide repeats）、3 （六核苷酸重復(fù)hexanucleotide ?repeats）。

通過REPuter （https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer） （Kurtz et al.， 2001） 在線網(wǎng)站測算葉綠體基因組中其他重復(fù)序列的分布，參數(shù)設(shè)置為最小重復(fù)序列30 bp，漢明距離（Hamming distance） 設(shè)置為3 （Liang et al.， 2019）。

1.4 種間葉綠體基因組的比較分析

通過mVISTA （https：//genome.lbl.gov/vista） 在線網(wǎng)站 （Frazer et al.， 2004），以P. parishii_1的葉綠體基因組作為參考，將其余5條飄帶兜蘭的葉綠體基因組的編碼區(qū)、基因間隔區(qū)、內(nèi)含子區(qū)進(jìn)行比對(duì)分析，評(píng)估各基因組序列之間的相似性和差異。使用R v4.0.2軟件運(yùn)行IRscope （Amiryousefi et al.， 2018） 腳本，對(duì)6個(gè)個(gè)體的葉綠體基因組序列的相鄰邊界區(qū)域進(jìn)行繪制，比較分析邊界區(qū)域的擴(kuò)張和收縮情況。使用DnaSP v5.10.0.1軟件，統(tǒng)計(jì)飄帶兜蘭不同個(gè)體間序列的單核苷酸多態(tài)性 （SNPs） 和插入缺失 （InDels） 情況，計(jì)算各序列間核苷酸多樣性 （Pi）。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank上下載15種兜蘭屬葉綠體全基因組序列，與本研究新測序拼裝的4個(gè)個(gè)體以及已發(fā)表的2條飄帶兜蘭葉綠體基因組序列，以3種杓蘭屬植物為外類群來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 （物種的基因登錄號(hào)見圖5）。使用PhyloSuite v1.2.2軟件，利用ModelFinder計(jì)算最佳堿基替換模型 （Zhang et al.， 2020a），使用葉綠體基因組全序列，經(jīng)MAFFT進(jìn)行多序列比對(duì)后，采用IQ-TREE構(gòu)建最大似然法 （maximum likelihood， ML） 系統(tǒng)發(fā)育樹 （Trifinopoulos et al.， 2016），系統(tǒng)發(fā)育樹分支的支持率基于bootstrap自展法檢測，將bootstrap值設(shè)置為5 000、重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 飄帶兜蘭葉綠體基因組基本特征

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，飄帶兜蘭4個(gè)樣品分別獲得2.4～3.1 G的高質(zhì)量clean data。組裝和注釋的葉綠體全基因組序列已登錄至GenBank （登錄號(hào)為OP 604356～OP 604359）。將本研究獲得的飄帶兜蘭4個(gè)個(gè)體和已公布的2個(gè)飄帶兜蘭葉綠體基因組一起比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)6條序列的葉綠體基因組均為環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，包括LSC區(qū)、SSC區(qū)和2個(gè)IR區(qū) （圖2）。葉綠體基因組序列全長為154 403～154 809 bp，其中LSC的長度為86 581～86 983 bp，SSC的長度為2 436～2 446 bp，IR的長度為32 690～32 693 bp。總GC含量為35.9%，LSC的GC含量為33.4%，SSC的GC含量為29.1%～29.2%，IR的GC含量為39.5% （表1）。

飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體葉綠體基因組的基因總數(shù)均為129個(gè)，包括78個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、39個(gè)tRNA基因、8個(gè)rRNA基因，以及4個(gè)假基因 （ndhJ、ndhD、2個(gè)ycf15） （附表1）。22個(gè)基因在IR區(qū)重復(fù)，具有2個(gè)拷貝，包括9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因 （psaC、ndhB、rps7、rps15、rps19、rpl2、rpl23、ycf1、ycf2）、9個(gè)tRNA基因 （trnA-UGC、trnH-GUG、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnL-UAG、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC） 和4個(gè)rRNA基因 （rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5）。18個(gè)基因有內(nèi)含子，其中15個(gè)基因含有1個(gè)內(nèi)含子，包括9個(gè)蛋白編碼基因 （petB、petD、atpF、ndhB、rpoC1、rps16、rpl2、rpl16、accD） 和6個(gè)tRNA基因 （trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC）；2個(gè)基因含有2個(gè)內(nèi)含子 （clpP、ycf3）；rps12為反剪接基因 （附表1）。

2.2 SSR位點(diǎn)分析

利用MISA軟件在飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體的葉綠體基因組中分別檢測到103～107個(gè)SSR位點(diǎn)，包括47～51個(gè)單核苷酸重復(fù) （主要以A、T堿基重復(fù)為主）、20個(gè)二核苷酸重復(fù)、15個(gè)三核苷酸重復(fù)、14個(gè)四核苷酸重復(fù)、2個(gè)五核苷酸重復(fù)和5個(gè)六核苷酸重復(fù)類型 （圖3： A；附表2）。SSR位點(diǎn)大部分位于LSC區(qū) （84～88個(gè)），其次分布于IR區(qū)（18～19個(gè)），SSC區(qū)無SSR位點(diǎn) （圖3： B）。另外，SSR位點(diǎn)主要分布于葉綠體基因組非編碼區(qū)的基因間隔區(qū) （intergenic spacer， IGS），為72～76個(gè)；位于基因內(nèi)含子區(qū) （intron） 的有17個(gè)；位于編碼區(qū)的有14個(gè)（圖3： C， D）。

將飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體同源區(qū)域的SSR位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的比對(duì)，篩選出具有相同類型且重復(fù)數(shù)目不同的SSR位點(diǎn)，可作為種內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)21個(gè)SSR位點(diǎn)在6個(gè)個(gè)體中有差異 （表2）。

2.3 重復(fù)序列分析

利用REPuter對(duì)6條飄帶兜蘭葉綠體基因組序列進(jìn)行重復(fù)序列分析。在6個(gè)葉綠體基因組中均鑒定到60個(gè)重復(fù)序列，包括17～21個(gè)正向重復(fù)（forward repeats）、18～29個(gè)反向重復(fù)（reverse repeats）、4～9個(gè)互補(bǔ)重復(fù) （complement repeats）、9～16個(gè)回文重復(fù) （palindromic repeats） （圖4： A）。6條葉綠體基因組重復(fù)序列的長度范圍雖然跨度較大，但都集中在30～40 bp之間 （圖4： B）。

2.4 飄帶兜蘭種間葉綠體基因組序列的多樣性

以P. parishii_1為參考序列，利用mVISTA軟件對(duì)6條飄帶兜蘭序列進(jìn)行序列多樣性比較 （附圖1）。6條飄帶兜蘭序列相似性較高，LSC區(qū)的多樣性相對(duì)較高，略高于IR區(qū)和SSC區(qū)。多樣性水平較高的片段主要在非編碼區(qū)，如atpH-atpI、psaA-ycf3、atpB-rbcL、accD-psaI、trnP-UGG-psaJ。編碼區(qū)變異度較低，ycf1基因的變異度稍高，tRNA和rRNA基因在飄帶兜蘭中極為保守。

6條序列邊界比較圖（附圖2）顯示，rpl22、trnL-UAG、rps19以及psbA分別位于6條序列的LSC/IRb、IR/SSC、IRa/LSC邊界或邊界附近。rpl22位于LSC/IRb邊界上，有58 bp的片段位于IRb區(qū)域；重復(fù)基因trnL-UAG位于IR區(qū)域內(nèi)，離IR/SSC邊界相距176～186 bp；重復(fù)基因rps19位于IR區(qū)，離IR/LSC邊界282 bp；psbA位于LSC區(qū)，離IRa/LSC邊界96 bp ?（附圖2），6條序列邊界基因較為保守，擴(kuò)張收縮現(xiàn)象不顯著，僅P. parishii_4的IR區(qū)有微小擴(kuò)張。

2.5 飄帶兜蘭種間葉綠體基因組核苷酸多樣性

通過對(duì)6條飄帶兜蘭葉綠體基因組核苷酸多樣性的分析，發(fā)現(xiàn)6條葉綠體基因組序列中共存在10個(gè)SNPs和60個(gè)InDels，其中基因間隔區(qū)有4個(gè)SNPs和43個(gè)InDels，內(nèi)含子區(qū)有1個(gè)SNP和13個(gè)InDels，編碼區(qū)有5個(gè)SNPs和4個(gè)InDels （表3）。在10個(gè)SNPs中有3個(gè)發(fā)生了非同義替換，導(dǎo)致密碼子改變，分別是在rpoC1基因中堿基A替換為堿基C，使編碼的氨基酸由異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸；在rpoB基因中堿基C替換為堿基T，使編碼的甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?；在ycf4基因中堿基G替換為堿基C，使編碼的蛋氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?。此外，還有2個(gè)SNPs發(fā)生同義替換，密碼子未改變，其余SNPs均位于非編碼區(qū)。對(duì)大于3 bp的InDels進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)共有19個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)了種內(nèi)的多態(tài)性 （表4），如基因間隔區(qū)pasA-ycf3分別在P. parishii_1、3、4中發(fā)生插入，在P. parishii_2、5、6中缺失；而在accD基因的編碼區(qū)及內(nèi)含子分別存在的2個(gè)InDels在個(gè)體間具有多態(tài)性。

利用DnaSP分別計(jì)算了飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體的葉綠體基因組基因和基因間隔區(qū)的核苷酸多樣性值 （Pi），發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的Pi值為0～0.000 61，僅有5個(gè)基因的核苷酸多樣性值大于0，其中ycf4基因的Pi值最高；基因間隔區(qū)的Pi值為0～0.006 32，僅有3個(gè)基因間隔區(qū)的核苷酸多樣性值大于0，其中rps3-rpl22的Pi值最高 （附圖3），表明飄帶兜蘭種內(nèi)表現(xiàn)了較低水平的核苷酸多樣性，基因間隔區(qū)的核苷酸多樣性相對(duì)較高。此外，還發(fā)現(xiàn)變異程度較高的位點(diǎn)主要位于LSC區(qū)，而IR區(qū)和SSC區(qū)相對(duì)保守。

2.6 飄帶兜蘭的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

通過PhyloSuite計(jì)算出最佳堿基替換模型為TVM+F+R2，采用此模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。16種兜蘭屬植物構(gòu)成了支持率很高 （支持率均為100%） 的3個(gè)分支，其中德氏兜蘭 （P. delenatii）、杏黃兜蘭 （P. armeniacum）、白花兜蘭 （P. emersonii）和硬葉兜蘭 （P. micranthum） 構(gòu)成了基部分支，歸屬于小萼亞屬 （Subgenus Parvisepalum）；文山兜蘭 （P. wenshanense）、同色兜蘭 （P. concolor） 和巨瓣兜蘭 （P. bellatulum） 形成一個(gè)單系分支，歸屬于寬瓣亞屬 （Subgenus Brachypetalum），本研究中的飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體未分開，形成1個(gè)分支，與長瓣兜蘭形成姐妹群。

3 討論與結(jié)論

本研究利用二代高通量測序技術(shù)對(duì)飄帶兜蘭野生居群不同個(gè)體進(jìn)行淺層基因組測序，通過組裝和注釋得到飄帶兜蘭葉綠體全基因組。6個(gè)個(gè)體的葉綠體基因組的基因數(shù)量和順序一致，沒有發(fā)生基因組的重排或倒位事件。6個(gè)葉綠體基因組均為葉綠體基因組的典型四分體式結(jié)構(gòu)，由IR區(qū)、LSC區(qū)、SSC區(qū)組成 （Jansen et al.， 2005）。飄帶兜蘭葉綠體基因組長度為154 403～154 809 bp，符合此前報(bào)道的蘭科及兜蘭屬植物的葉綠體基因組大小 （Kim et al.， 2014; Guo et al.， 2021）。飄帶兜蘭不同個(gè)體間的葉綠體基因組長度變化主要在LSC區(qū)，為86 581～86 983 bp；而SSC區(qū)和IR區(qū)基本保持一致，分別為2 436～2 446 bp和32 690～32 693 bp。IR區(qū)較其他被子植物有顯著的擴(kuò)張，SSC區(qū)則有較大程度的收縮，僅包含rpl32和ccsA 2個(gè)基因，這些特點(diǎn)符合兜蘭屬葉綠體基因組特征 （Guo et al.， 2021）。與其他已報(bào)道的蘭科屬種的葉綠體全基因組的SSC區(qū)長度相比，如凌氏石豆蘭 （Bulbophyllum lingii， 18 244 bp）、王氏石斛 （Dendrobium wangliangii， 18 373 bp）、扇脈杓蘭 （Cypripedium japonicum， 21 911 bp） （Kim et al.， 2020; Shao et al.， 2020; Tang et al.， 2021），兜蘭屬的SSC區(qū)收縮嚴(yán)重，導(dǎo)致整個(gè)基因組的長度遠(yuǎn)低于蘭科植物其他物種。大量SSC區(qū)的基因轉(zhuǎn)移至IR區(qū)，使得SSC區(qū)的收縮在兜蘭屬極為常見，杏黃兜蘭中甚至一些典型的SSC區(qū)基因，如ycf1、psaC、ndhD轉(zhuǎn)移至IR區(qū) （Kim et al.， 2015; Lin et al.， 2015; Niu et al.， 2017）。有研究認(rèn)為，由于IR區(qū)的基因可以利用同源重組機(jī)制修復(fù)DNA損傷，較大的IR區(qū)域更有利于質(zhì)體基因組的穩(wěn)定性， 因此基因的轉(zhuǎn)移可能更利于該基因的表達(dá) （Palmer & Thompson， 1982; Wicke et al.， 2011）。這種基因轉(zhuǎn)移使得兜蘭屬SSC區(qū)具有極高多樣性，序列長度差異大，長度為524～5 913 bp，基因數(shù)目顯著不同，其種間多樣性和種內(nèi)的穩(wěn)定性使其具有開發(fā)成用于物種鑒定的分子標(biāo)記的潛力 （Guo et al.， 2021）。

飄帶兜蘭的葉綠體基因組共編碼129個(gè)基因，包括78個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、39個(gè)tRNA基因、8個(gè)rRNA基因，以及4個(gè)假基因，與Guo等（2021）報(bào)道的相同。4個(gè)假基因都是因大量基因片段缺失而造成功能喪失，其中ndhJ因片段缺失而導(dǎo)致基因缺少起始密碼子，而ndhD和ycf15的堿基缺失在50%以上。飄帶兜蘭葉綠體基因組中存在大量的ndh基因丟失，只保留了ndhB、ndhD和ndhJ，其中ndhD和ndhJ為假基因，這是SSC區(qū)收縮的原因之一。蘭科植物普遍存在ndh基因的丟失現(xiàn)象 （Yang et al.， 2013; Feng et al.， 2016; Niu et al.， 2017; Zavala-Páez et al.， 2020），但ndh基因的丟失程度不同，如石豆蘭屬葉綠體基因組中存在12個(gè)ndh基因 （Tang et al.， 2021），蘭屬植物葉綠體基因組中存在10個(gè)ndh基因 （胡國家， 2020），石斛屬的ndh基因丟失現(xiàn)象極為嚴(yán)重 （牛志韜， 2017）。葉綠體ndh基因與核基因組部分基因共同編碼NAD （P） H脫氫酶復(fù)合體，參與環(huán)式電子傳遞鏈 （CET） 途徑，在植物抗逆脅迫中起重要作用。除了蘭科植物外，在裸子植物松杉類和麻黃類中也發(fā)現(xiàn)ndh基因的丟失 （Braukmann et al.， 2009; Wu et al.， 2009）。Lin等（2017）研究認(rèn)為，ndh基因的缺失可能是植物由自養(yǎng)轉(zhuǎn)為異養(yǎng)的進(jìn)化過程。

本研究在飄帶兜蘭6個(gè)個(gè)體的基因組中共鑒定到103～107個(gè)SSR位點(diǎn)，其中數(shù)量最多的是單核苷酸重復(fù)序列，其次是二核苷酸重復(fù)序列，多以A、T堿基為基本重復(fù)單元，顯示了高度的A/T偏好，與Qin等（2015）、陳模舜和楊仲毅（2022）在被子植物葉綠體基因組中觀察到的情況一致。重復(fù)序列在植物基因組中扮演重要角色，因多態(tài)性較高而在群體遺傳和進(jìn)化研究中經(jīng)常被用來做分子標(biāo)記 （Muraguri et al.， 2020）。本研究共篩選到21個(gè)SSR位點(diǎn)具有多態(tài)性，這些位點(diǎn)可開發(fā)為分子標(biāo)記用于評(píng)估飄帶兜蘭種群的遺傳多樣性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)的SSR數(shù)量遠(yuǎn)多于編碼區(qū)，說明非編碼區(qū)比編碼區(qū)具有更高遺傳多樣性，這可能由于非編碼區(qū)面臨著更大的選擇壓力 （Shaw et al.， 2007）。正向重復(fù)、反向重復(fù)、互補(bǔ)重復(fù)和回文重復(fù)在6個(gè)個(gè)體的葉綠體基因中都表現(xiàn)了多樣性。同種植物長序列重復(fù)的不同可能因序列的插入缺失而導(dǎo)致重復(fù)序列的類型發(fā)生改變，可能與基因重組有關(guān) （Somaratne et al.， 2019）。

插入缺失和突變引起基因結(jié)構(gòu)的差異是遺傳變異的重要來源， 代表生物個(gè)體適應(yīng)環(huán)境變化的能力（Han & Xue， 2003）。種間或種內(nèi)的葉綠體基因結(jié)構(gòu)差異可用于近緣種間和種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及群體遺傳學(xué)研究 （McCauley， 1995; Kersten et al.， 2016）。本研究在飄帶兜蘭的6個(gè)個(gè)體的葉綠體基因組中鑒定到60個(gè)InDels和10個(gè)SNPs，主要分布在基因間隔區(qū)。與其他種內(nèi)葉綠體基因組比較分析相比，飄帶兜蘭的InDels和SNPs數(shù)量并不多。Muraguri等 （2020） 在蓖麻 （Ricinus communis） 12個(gè)個(gè)體的葉綠體基因組中共鑒定到162個(gè)SNPs和92個(gè)InDels；Zhang等 （2020b） 在麻櫟 （Quercus acutissima） 3個(gè)個(gè)體中共檢測到77個(gè)SNPs和255個(gè)InDels。Alexander等 （2014） 在紅槲櫟 （Quercus rubra） 4個(gè)個(gè)體中鑒定到8個(gè)SNPs和45個(gè)InDels。本研究共發(fā)現(xiàn)19個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)種內(nèi)多態(tài)性，通過mVISTA基因組比對(duì)和核苷酸多樣性 （Pi） 值的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)的核苷酸多樣性遠(yuǎn)高于編碼區(qū)，其中rps3-rpl22的Pi值最高 （0.006 32）。在飄帶兜蘭葉綠體基因組中存在的這些基因組的結(jié)構(gòu)變異可廣泛用于種間和種內(nèi)關(guān)系以及遺傳多樣性研究。

遺傳多樣性是評(píng)估物種對(duì)棲息地環(huán)境適應(yīng)能力以及抗逆能力的重要指標(biāo)，研究遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是制定物種保護(hù)措施的前提 （張亞紅等， 2019）。通過葉綠體全基因組的比較分析，本研究篩選出了一些多態(tài)性葉綠體基因組分子標(biāo)記，為評(píng)估飄帶兜蘭的遺傳多樣性，探討系統(tǒng)發(fā)生、進(jìn)化以及保護(hù)遺傳學(xué)研究提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

致謝 ?中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園Sven Landrein、楊國平協(xié)助野外調(diào)查，云南野蘭堂生物有限公司張澤提供照片，謹(jǐn)致謝意。

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（ 責(zé)任編輯 蔣巧媛 ）

收稿日期： ??2023-01-25

基金項(xiàng)目： ??國家自然科學(xué)基金 （31870183， 32270225）。

第一作者： ?高鑫禎 （1997-），碩士，研究方向?yàn)楸Ｗo(hù)生物學(xué)，（E-mail）gaoxinzhen@xtbg.ac.cn。

通信作者： ??羅艷，博士，研究員，研究方向?yàn)樘m科植物多樣性與保護(hù)，（E-mail）luoyan@xtbg.org.cn。