典型抗生素沖擊對黃鐵礦/硫基質(zhì)反硝化修復(fù)體系的影響

曹惜霜,信 欣,2*,楊雯鈺,劉 鑫,潘先兵 (.成都信息工程大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,四川 成都 60225；2.北京師范大學(xué),地下水污染控制與修復(fù)教育部工程研究中心,北京 00875)

目前地下水中的硝酸鹽(NO3--N)污染已成為一個嚴(yán)重的全球環(huán)境問題[1].許多國家和地區(qū)的地下水是重要的飲用水源之一,若人們過量攝入NO3--N容易引起消化系統(tǒng)疾病、高鐵血紅蛋白血癥(藍(lán)嬰病)等疾病[2].去除地下水中NO3--N 的技術(shù)包括反滲透、離子交換、電化學(xué)還原、活性炭吸附等[3],但是這些方法存在運(yùn)行成本高、易產(chǎn)生二次污染等實(shí)際問題.而生物反硝化技術(shù)因其成本低、效果好、無二次污染等優(yōu)勢受到越來越多的關(guān)注[4-5].地下水含水層中反硝化的過程主要包括異養(yǎng)和自養(yǎng)反硝化[6].由于含水層大多為低營養(yǎng),自養(yǎng)反硝化已被確定為主要的硝酸鹽還原過程[7].黃鐵礦(FeS2)分布廣泛,成本低,能作為電子供體促進(jìn)硫自養(yǎng)反硝化過程.如Torrento 等[8]在模擬地下水環(huán)境流動實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)FeS2通過提高自養(yǎng)反硝化細(xì)菌的種群豐度,加速了硝酸鹽的去除.周婭等[9]采用黃鐵礦/硫復(fù)合基質(zhì)(FeS2/S0)進(jìn)行自養(yǎng)反硝化對低碳氮比(C/N)水體進(jìn)行脫氮,結(jié)果表明脫氮效果良好,TN 去除率可達(dá)72.2%.基于黃鐵礦(FeS2)、單質(zhì)硫(S0)或二者復(fù)合基質(zhì)(FeS2/S0)驅(qū)動的反硝化作用被認(rèn)為是低C/N 類水體中去除硝酸鹽的主要途徑[10-11].

近年來,抗生素作為一類新興污染物常常在地下水體、土壤和沉積物中被檢出[12],部分地下水區(qū)域特別是畜牧養(yǎng)殖、再生水利用以及污水排放地區(qū)存在抗生素與硝酸鹽復(fù)合污染的現(xiàn)象[13-14].然而,各種抗生素由于其較高的生物活性,在不同條件下如不同種類、濃度和接觸時(shí)長,會對反硝化作用產(chǎn)生不同程度的影響.張玉葉等[15]選取了5 種典型喹諾酮類抗生素藥物,研究異養(yǎng)反硝化細(xì)菌對上述藥物的敏感性,發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)反硝化菌對這5 種抗生素的敏感程度會隨喹諾酮類種類的變化而改變.鄒華[16]研究發(fā)現(xiàn)以恩諾沙星(ENR)為代表的氟喹諾酮類抗生素對假單胞菌屬類反硝化菌的敏感性具有高-低濃度效應(yīng),其效應(yīng)臨界值約為100 μg/L.鄧璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)隨著洛美沙星(LOM)濃度升高,硝酸鹽還原酶活性受到抑制程度越大.Guo 等[18]通過血清瓶批次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶(SDZ)通過降低核黃素含量和反硝化酶活性來抑制反硝化電子傳遞活性(ETSA),而Chen等[19]發(fā)現(xiàn)NOR 對ETSA 有明顯抑制作用,隨著NOR濃度增加到100mg/L,電子傳遞系統(tǒng)的活性下降了43.3%,從而降低NO3--N 的還原效率.

然而,目前關(guān)于抗生素對生物脫氮過程的影響研究多集中于傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化脫氮過程,且大多數(shù)抗生素濃度水平為μg/L ～ mg/L.而地下水中抗生素濃度多為ng/L ～ μg/L 低濃度水平[20],現(xiàn)有研究結(jié)果很難對低濃度抗生素短期脅迫下鐵硫基(FeS2/S0)自養(yǎng)反硝化為主的修復(fù)體系的影響危害效應(yīng)做出正確評估.因此,本文選擇了地下水中檢出率較高的恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺嘧啶(SDZ)、四環(huán)素(TCY)、土霉素(OTC)、紅霉素(ERY)、螺旋霉素(SPM)作為典型抗生素,分別研究其對FeS2/S0體系反硝化效能的影響,獲得了各抗生素對反硝化過程中氮素轉(zhuǎn)化、關(guān)鍵反硝化酶活性和電子傳遞活性(ETSA)的影響規(guī)律,篩選出最為敏感的抗生素,旨在為評估各抗生素對地下水FeS2/S0修復(fù)系統(tǒng)的潛在危害和風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)提供參考.

1 材料與方法

1.1 抗生素選擇及實(shí)驗(yàn)水體

各類抗生素均購自中國上海阿拉丁公司(純度>98%).實(shí)驗(yàn)用水取自四川省德陽地區(qū)典型紅層地下水樣品,過2mm 篩后外加(55±2)mg/L NO3--N 配置而成.

1.2 黃鐵礦預(yù)處理及S0

單質(zhì)硫?yàn)樯A硫,購買自西安三浦化學(xué)試劑有限公司;天然黃鐵礦購買自廣西桂林松泉化工有限責(zé)任公司,使用前先將其在10% HCl 溶液中浸泡2h 以去除表面氧化物,再用去離子水清洗至中性,置于低溫烘箱中過夜至干燥,然后用粉碎機(jī)粉碎過100 目篩備用.

1.3 FeS2/S0微宇宙實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建與抗生素脅迫實(shí)驗(yàn)

模擬地下水生態(tài)微環(huán)境實(shí)驗(yàn)體系:反應(yīng)模擬體系為500mL 的厭氧血清瓶,瓶口塞有丁基橡膠塞、補(bǔ)料瓶蓋接頭(雙通蓋)加黑色橡膠塞密封,瓶蓋內(nèi)插入適量長度氣管用于取樣(如圖1(a)).其中,FeS2與S0質(zhì)量比4:1(總填充量為5g/L),并接種40mL 本課題組前期培養(yǎng)得到的自養(yǎng)反硝化污泥[21],顆粒污泥接種前,重新富集培養(yǎng) 60d,確保自養(yǎng)反硝化菌(Thiobacillus)為主導(dǎo)反硝化種群(相對豐度36%;如圖1(b)).富集配方(g/L):Na2S2O3·5H2O 0.64,NH4Cl 0.2,NaNO30.25,NaHCO30.15.

圖1 微宇宙實(shí)驗(yàn)體系組成Fig.1 The composition of microcosmic experimental system

厭氧批次實(shí)驗(yàn):基于FeS2/S0各個反應(yīng)體系,每批次分別加入硝酸鹽污染的模擬地下水400mL,每個反應(yīng)體系分別加入100ng/L～500μg/L的典型抗生素,通純N210min 以排除O2后放置于30℃、120r/min氣浴震蕩箱中避光反應(yīng)7d.每隔24h 取15mL 水樣,對水中NO3--N、NO2--N、SO42--S、TFe、Fe2+、pH值、ETSA、NAR、NIR 等進(jìn)行檢測.每批次連續(xù)監(jiān)測7d,以研究分析典型抗生素對FeS2/S0反硝化過程的短期影響效應(yīng).

1.4 測試與計(jì)算方法

1.4.1 常規(guī)指標(biāo)測定方法 本實(shí)驗(yàn)水體中的NO3--N、NO2--N、SO42--S、TFe、Fe2+的測定均參照國家標(biāo)準(zhǔn)方法[22].

1.4.2 污泥蛋白含量、ETSA 及反硝化相關(guān)酶活的測定 采用Folin-酚法測定細(xì)菌蛋白質(zhì)含量:取1mL 樣品溶液加入5mL 試劑甲混勻,于20～25℃放置10min,再加0.5mL 試劑乙(Folin-酚),立即搖勻,在20～25℃保溫30min,然后于500nm 處比色,以1mL水代替樣品作空白對照.試劑甲的制備如下:將1g Na2CO3溶于50mL 0.2moL/L NaOH 中,再將0.5g 硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶于100mL 1%的酒石酸鉀鈉溶液,然后將前者50mL 與后者1mL 混合,現(xiàn)用現(xiàn)配.采用碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)還原法[12]測定ETSA,硝酸鹽還原酶(NAR)和亞硝酸鹽還原酶(NIR)根據(jù)文獻(xiàn)[23]測試分析.其中,ETSA 計(jì)算公式見式(1):

式中:ETSA 單位為μgO2/(g protein·min);15.9 為INT-formazan 特定吸收率;V1為甲醇體積,mL;V0為初始菌液體積,mL;t為培養(yǎng)時(shí)間,min;m為每mg 細(xì)菌的蛋白含量.

1.4.3 NO3--N 還原動力學(xué)及抑制率 NO3--N 還原動力學(xué)和抑制率計(jì)算均參照Zou 等[24]的方法進(jìn)行.其中,NO3--N 還原的反應(yīng)速率通過一級動力學(xué)模型模擬獲得,擬合公式如式(2).

式中:Ct,NO3--N為t時(shí)刻擬合所得的反應(yīng)體系NO3--N濃度,mg/L;C0為初始時(shí)刻擬合所得的反應(yīng)體系NO3--N 濃度,mg/L;k1為NO3--N 還原的一級速率常數(shù),d-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 典型抗生素對FeS2/S0 反硝化體系中氮素轉(zhuǎn)化的影響

典型抗生素脅迫對 FeS2/S0反硝化過程中NO3--N 轉(zhuǎn)化的影響如圖2(a)所示.由于各體系中NO3--N濃度3d后趨于平穩(wěn),各體系中硝酸鹽還原的抑制率按前3d 統(tǒng)計(jì)(表1).不同濃度的各類抗生素均對反應(yīng)體系有抑制作用,抑制程度與抗生素介入濃度呈正相關(guān).各抗生素對NO3--N 去除抑制強(qiáng)弱依次為OFL (5.81%～27.73%) > ENR (3.06%～14.17%)?OTC (1.95%～14.25%) > SMZ(2.54%～11.75%)、SDZ(1.87% ～ 10.90%) > TCY (1.98%～9.44%)、SPM(2.45% ～ 9.43%) > ERY (2.13%～8.47%).當(dāng)抗生素介入濃度為100 和500ng/L 時(shí),OFL 實(shí)驗(yàn)組的NO3--N去除抑制率分別為5.81%與7.77%,均高于其他類型抗生素的實(shí)驗(yàn)組,反應(yīng)體系表現(xiàn)出了對低濃度OFL明顯的敏感性.當(dāng)抗生素介入濃度分別為10 和100μg/L 時(shí),OFL 實(shí)驗(yàn)組的NO3--N 去除抑制率分別達(dá)到11.61%和17.75%(而其他同濃度的反應(yīng)體系NO3--N 去除抑制率均<10%).當(dāng)抗生素介入濃度繼續(xù)增加為500μg/L 時(shí),OFL 實(shí)驗(yàn)組的抑制率高達(dá)27.73%,同時(shí),OTC、ENR 和SMZ 實(shí)驗(yàn)組也表現(xiàn)除了較高的抑制率,其值分別為 14.25%,14.17%和11.75%,而其他類型抗生素實(shí)驗(yàn)組的抑制率均低于10%.

表1 不同種類抗生素脅迫對FeS2/S0反硝化過程N(yùn)O3--N去除抑制率(%)Table 1 Inhibition of NO3--N removal during denitrification by FeS2/S0under different species of antibiotic stress (%)

圖2 不同抗生素脅迫體系中氮素變化Fig.2 Nitrogen changes in different antibiotic stress systems

同時(shí),各體系NO2--N 積累量呈現(xiàn)先增加(1～3d)后降低(4～7d)的趨勢,至反應(yīng)第7d 保持在較低濃度(圖2(b)).其中ENR、OFL 與OTC 實(shí)驗(yàn)組隨抗生素濃度提升,NO2--N 最大積累量表現(xiàn)出下降的趨勢,OTC 實(shí)驗(yàn)組NO2--N 最大積累量最低且達(dá)到最大積累量的時(shí)間點(diǎn)滯后.空白組在反應(yīng)第 3d NO2--N 達(dá)最大積累量,為(5.60±0.05) mg/L,ENR 與OFL 實(shí)驗(yàn)組5 個梯度濃度(100ng/L～500μg/L)下NO2--N 最大積累量分別為(5.25±0.13)與(4.02±0.03) mg/L、(4.88±0.15)與(3.88±0.18) mg/L、(3.50±0.01)與(3.43±0.05) mg/L、(2.90±0.00)與(3.38±0.02)mg/L、(5.18±0.10)與(4.49±0.03) mg/L;OTC 實(shí)驗(yàn)組則在反應(yīng)第4d 達(dá)NO2--N 最大積累量,分別為(3.80±0.05) mg/L、(3.80±0.03) mg/L、(3.79±0.04)mg/L、(3.67±0.04) mg/L 與(3.39±0.08) mg/L,但經(jīng)7d 反硝化后NO2--N 積累濃度下降,與其他典型抗生素實(shí)驗(yàn)組差異不大,而ENR 與OFL 實(shí)驗(yàn)組則NO2--N 積累濃度略高于其他抗生素實(shí)驗(yàn)組.值得注意的是,抗生素介入后,各反硝化體系中NO2--N的生成速率與去除速率差別較為明顯,普遍表現(xiàn)出NO2--N 去除速率低于NO2--N 生成速率(圖2c).有研究表明,反應(yīng)體系中NO3--N 對NO2--N 還原酶基因表達(dá)具有顯著的抑制作用,是NO2--N 積累的關(guān)鍵因素[25].本實(shí)驗(yàn)中,隨著介入反應(yīng)體系中的抗生素濃度升高,各反應(yīng)系統(tǒng)中NO3--N 去除率下降促進(jìn)了NO2--N 的積累,導(dǎo)致各體系中NO2--N 濃度呈現(xiàn)單峰規(guī)律變化,反應(yīng)7d后,其濃度均降到1.0mg/L以下.

2.2 各反應(yīng)體系中TFe、Fe2+及SO42--S 變化

批次實(shí)驗(yàn)過程中,各反應(yīng)體系均檢測到TFe、Fe2+,且7d 內(nèi)各反應(yīng)體系中TFe、Fe2+濃度呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(圖3),各批次空白組均在反應(yīng)第1d 達(dá)最高濃度,分別(0.775±0.01)與(0.485±0.01)mg/L,第7d 降低至(0.235±0.01)與(0.165±0.01) mg/L,而抗生素實(shí)驗(yàn)組則隨脅迫濃度的增加,TFe 與Fe2+達(dá)到濃度峰值的時(shí)間節(jié)點(diǎn)表現(xiàn)出滯后或提前.如100～500ng/L 水平脅迫下,TCY、OTC、ERY 和SPM 實(shí)驗(yàn)組TFe 濃度變化節(jié)點(diǎn)與空白組之間無明顯差異;ENR、SMZ 與SDZ 實(shí)驗(yàn)組于第2d 達(dá)到最大TFe濃度,而OFL實(shí)驗(yàn)組于第3d達(dá)到最高濃度,表現(xiàn)出滯后性.而10～500μg/L 脅迫下,ENR、OFL 與SMZ 實(shí)驗(yàn)組達(dá)到最高濃度的時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出1～2d 滯后,其中ENR 與OFL 實(shí)驗(yàn)組在100 與500μg/L 時(shí),均于第2d達(dá)到最高濃度,分別為(0.925±0.02)、(0.885±0.01)mg/L (100μg/L)與(0.795±0.01)、(0.775±0.01) mg/L(500μg/L),高于空白組,隨后濃度逐漸降低,至第7d 低于空白組濃度.典型抗生素脅迫實(shí)驗(yàn)組中Fe2+濃度變化趨勢不一,且這種趨勢與抗生素類型及濃度無相關(guān)性.隨抗生素濃度由ng/L 提升至μg/L 水平,實(shí)驗(yàn)組Fe2+濃度逐漸降低,各實(shí)驗(yàn)組與空白組間Fe2+濃度變化差異更加明顯,但至反硝化第7d 均降低至較低濃度,與空白組無顯著差異.由此可以看出,抗生素的介入,對FeS2/S0反硝化體系Fe2+的釋放有一定的影響,并且μg/L 體系的抑制效果明顯大于ng/L 體系.

圖3 典型抗生素脅迫下體系TFe、Fe2+濃度變化Fig.3 Concentration variations of TFe and Fe2+ under the stress of typical antibiotics

另外,隨著各反應(yīng)體系中NO3--N 逐步降低,各反應(yīng)體系中SO42--S 濃度呈現(xiàn)先增加后保持穩(wěn)定的變化趨勢(圖4).空白組運(yùn)行至第7d 時(shí)SO42--S 濃度為(223.34±13.47) mg/L,高于各實(shí)驗(yàn)組體系.同時(shí),各實(shí)驗(yàn)組體系中產(chǎn)生的SO42--S 濃度與介入抗生素濃度密切相關(guān),一般表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系.當(dāng)抗生素濃度分別為10、100 和500μg/L 脅迫下,反應(yīng)7d 后的各實(shí)驗(yàn)組中SO42--S 濃度與空白組間的差異愈發(fā)明顯,尤其是OFL 實(shí)驗(yàn)組.如各μg/L 濃度水平抗生素脅迫下,OFL 反應(yīng)體系中SO42--S 濃度分別為(178.10±3.37) mg/L、(173.34±10.10) mg/L 和(149.53±23.57)mg/L,明顯低于空白組和理論值[26].由此可推測,隨著抗生素濃度的提高,各反應(yīng)體系中反硝化細(xì)菌受抑制性增強(qiáng),鐵硫基自養(yǎng)反硝化引導(dǎo)的硝酸鹽還原過程受到明顯抑制,最終導(dǎo)致體系中硫酸鹽的生成量降低.

圖4 不同抗生素不同濃度脅迫下SO42--S 濃度變化Fig.4 Changes of SO42--S concentration under different antibiotic stresses

2.3 NO3--N 還原動力

采用一級動力學(xué)方程對抗生素介入實(shí)驗(yàn)體系中NO3--N 還原的過程進(jìn)行擬合(3d 后硝酸鹽去除趨于穩(wěn)定,反應(yīng)速率≈0,舍棄該段過程),結(jié)果如圖5 所示.

圖5 不同抗生素脅迫下NO3--N 去除一級反應(yīng)動力學(xué)擬合Fig.5 Fitting results of first-order reaction kinetics of nitrate removal under different antibiotic stress

當(dāng)抗生素介入濃度為100ng/L 和500ng/L 水平時(shí),各反應(yīng)體系中的k值差別不大,說明ng/L 濃度水平的各抗生素短期沖擊對硝酸鹽還原沒有實(shí)質(zhì)的抑制性差異.隨著抗生素介入濃度升至為10μg/L 時(shí),各反應(yīng)體系中k值差距變大,尤其是OFL 反應(yīng)體系的k值下降為(36.10 ± 2.62)×10-2d-1,開始明顯低于其他反應(yīng)體系,說明該FeS2/S0自養(yǎng)為主的反硝化體系對OFL 比較敏感.當(dāng)抗生素介入濃度升至為100μg/L 和500μg/L 時(shí),OFL 反應(yīng)體系的k值進(jìn)一步下降為(26.87±1.45)×10-2d-1和(26.52±1.46)×10-2d-1,說明OFL 對FeS2/S0反硝化體系硝酸鹽還原抑制作用具有明顯的濃度效應(yīng).此外,隨著抗生素介入濃度不斷提高,反應(yīng)體系的k值下降明顯的還有ENR 和OTC 反應(yīng)體系.當(dāng)抗生素濃度由100ng/L逐漸上升到500μg/L,ENR 和OTC 實(shí)驗(yàn)組中NO3-的還原速率常數(shù)分別由(55.74±4.74)×10-2d-1和(51.73±2.17)×10-2d-1下降到(30.97±4.24)×10-2d-1和(36.36±3.08)×10-2d-1.有研究表明,速率常數(shù)k值可以反映由抗生素種類與濃度影響的NAR 活性,間接反映硝酸鹽還原過程受阻程度[27].因此,各反應(yīng)體系NO3-還原動力學(xué)速率常數(shù)變化表明,μg/L水平的OFL對FeS2/S0反硝化體系硝酸鹽還原抑制作用顯著.

2.4 NAR、NIR 酶活、ETSA 變化及影響機(jī)制討論

各反應(yīng)體系中NAR 和NIR 酶活性變化如圖6所示.空白組和各實(shí)驗(yàn)組反硝化酶活性變化趨勢一致,呈先增后降的單峰變化.反應(yīng)前3d 各體系中NAR 活性逐漸增強(qiáng),至第3d達(dá)到最大值,這與NO3--N的快速去除和NO2--N 的快速積累一致,隨后其活性不斷下降直至第7d 反應(yīng)結(jié)束時(shí)降到較低水平.各反應(yīng)體系中NAR 的峰值略有不同,對OFL、ENR 和OTC 脅迫的反應(yīng)體系,第3d 時(shí)其NAR 活性(6.202～7.946,6.302～7.664,6.519～7.865nmol/(mg·min))明顯低于其他實(shí)驗(yàn)組和空白組(8.191nmol/(mg·min)),這也表明反硝化體系中NAR 酶活性對OFL、ENR 和OTC較為敏感.研究表明,氟喹諾酮類抗生素由于其穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu),生物可降解性更弱,且毒性更強(qiáng)[28],這與ENR 和OFL 介入體系中更低的NAR 酶活性一致.NAR催化反應(yīng)體系中 NO3--N還原轉(zhuǎn)化為NO2--N,是微生物厭氧反硝化的第一個關(guān)鍵環(huán)節(jié).本實(shí)驗(yàn)中,OFL、ENR 和OTC 介入的反應(yīng)體系NAR酶活性低于其他實(shí)驗(yàn)組,是導(dǎo)致其硝酸鹽還原速率較其他組低的主要原因.其他抗生素脅迫下NAR 受到的抑制情況則并未隨著濃度提高而有顯著差異,但與空白組相比,也略有下降.與此同時(shí),空白組與各實(shí)驗(yàn)組NIR 活性變化趨勢一致,在反應(yīng)的1～4d 內(nèi)不斷增強(qiáng),于第5d 達(dá)到最大值,隨后開始下降.介入抗生素濃度較低時(shí)(<100ug/L),各實(shí)驗(yàn)組NIR 活性相差不大,但當(dāng)各實(shí)驗(yàn)組的抗生素濃度高于100ug/L 后,相對于空白組6.880nmol/(mg·min),其NIR 活性抑制開始明顯,其中以O(shè)FL、TCY 和ENR 反應(yīng)體系受抑制程度最大,第5d 時(shí)三者的NIR 活性分別為5.082,5.092,5.154nmol/(mg·min).整個實(shí)驗(yàn)過程中,NIR 活性變化相較于亞硝酸鹽濃度變化存在滯后現(xiàn)象,這可能是由于硝酸鹽得電子能力強(qiáng)于亞硝酸鹽,體系優(yōu)先利用NAR 將NO3--N 還原為NO2--N,導(dǎo)致反應(yīng)體系中亞硝酸鹽的短暫積累[9].

圖6 典型抗生素脅迫下NAR、NIR 活性變化Fig.6 Changes of nitrate reductase and nitrite reductase activities under different antibiotic stress

反硝化過程需要消耗電子將NO3--N 還原為氣態(tài)氮,電子的產(chǎn)生和傳遞在反硝化過程中起著重要的作用.各典型抗生素介入后反應(yīng)體系ETSA 的變化情況如圖7 所示.抗生素介入后各反應(yīng)體系的ETSA 均受到明顯的抑制,且受抑制程度隨抗生素濃度升高而加劇.反應(yīng)7d 后,與空白組相比(0.095±0.01)μgO2/(g protein·min)),各濃度抗生素介入反應(yīng)體系的ETSA 數(shù)值均有不同程度的下降,尤其是OFL 脅迫體系的ETSA 數(shù)值下降幅度最大.抗生素脅迫濃度分別為100 和500ng/L 水平時(shí),OFL 實(shí)驗(yàn)組的 ETSA 相較于空白組分別下降了 36.84%與47.37%,下降幅度明顯高于其他類型抗生素脅迫組.其中,對于TCY 和SPM 抗生素介入的體系而言,其ETSA 活性的受抑制程度最小,下降幅度在10.53% ～15.79%和15.79% ～ 26.32%范圍內(nèi),而其他反應(yīng)體系在100 和500ng/L 水平抗生素的脅迫下,ETSA 活性分別下降了15.79% ～ 21.05%與15.79% ～ 36.84%.當(dāng)抗生素介入濃度升至10, 100 和500 μg/L 時(shí),OFL實(shí)驗(yàn)組的ETSA 分別下降了47.37%、57.89%與57.89%,而其他典型抗生素則下降了 21.05% ～36.84%、26.32% ～ 47.37%與42.11% ～ 52.63%.抗生素的介入阻礙了反硝化體系的電子傳遞,從而降低了反硝化能力,其中以O(shè)FL 抑制電子傳遞活性的能力最強(qiáng),佐證了ug/L 水平的OFL 對FeS2/S0反硝化體系硝酸鹽還原抑制作用最為顯著.

圖7 不同抗生素脅迫下電子傳遞活性(ETSA)Fig.7 Changes of ETSA under different antibiotics stress

綜上,抗生素的介入會抑制FeS2/S0反硝化過程的NAR、NIR 酶活及電子傳遞,從而影響反硝化效果.Guo 等[29]通過血清瓶批次試驗(yàn),探究了磺胺嘧啶(SDZ)在電子轉(zhuǎn)移和消耗水平上對反硝化的抑制作用,表明SDZ 通過降低核黃素含量和反硝化酶活性來抑制反硝化ETSA.也有研究表明,ETSA 值不僅依賴于體系的電子轉(zhuǎn)移性能,還很大程度上取決于反硝化酶的電子消耗能力[30].反硝化反應(yīng)中每步均存在電子競爭的問題,相應(yīng)的還原酶活性越強(qiáng),其電子競爭能力就越強(qiáng),對應(yīng)的電子傳遞活性ETSA 則越強(qiáng)[31].本實(shí)驗(yàn)中,一方面,通過對各反硝化過程中NAR、NIR關(guān)鍵反硝化酶活性動態(tài)變化與ETSA 分析發(fā)現(xiàn),隨反應(yīng)體系中抗生素濃度增高,尤其是大于100μg/L 時(shí),各反應(yīng)體系的NAR、NIR 活性的降低較為明顯,從而進(jìn)一步導(dǎo)致ETSA 值的降低,NAR、NIR 酶活和ETSA的降低是導(dǎo)致硝酸鹽還原過程受到抑制的關(guān)鍵原因.另一方面,在FeS2/S0自養(yǎng)反硝化過程中,Fe2+的存在增強(qiáng)了電子轉(zhuǎn)移的能力,降低了電子轉(zhuǎn)移電阻,進(jìn)而加速了自養(yǎng)反硝化速率.Li 等[32]研究表明,Fe2+可刺激自養(yǎng)反硝化菌分泌更特異的化學(xué)信號分子,進(jìn)而改善微生物通信,故Fe2+的存在能夠加速自養(yǎng)反硝化過程中TN 的去除.因此,若Fe2+在TFe 含量中所占比例越大,則體系反硝化效能越好.本實(shí)驗(yàn)中,由于典型抗生素的介入,產(chǎn)生Fe2+含量低于空白組,影響了反應(yīng)體系的ETSA 的值,使得各體系反硝化過程進(jìn)行不徹底.硝酸鹽還原的動力學(xué)系數(shù)k值進(jìn)一步表明,ng/L 濃度水平的各抗生素短期沖擊對硝酸鹽還原沒有實(shí)質(zhì)的抑制性差異,而抗生素介入濃度升至μg/L 水平時(shí)(10～500μg/L),各反應(yīng)體系中k值差別開始明顯,尤其是OFL 反應(yīng)體系的k值下降幅度最大,明顯低于其他反應(yīng)體系,且硝酸鹽還原速率k值和反應(yīng)體系中的NAR、NIR 和ETSA 活性密切相關(guān).

3 結(jié)論

3.1 100ng/L～500μg/L 典型抗生素短期脅迫對FeS2/S0自養(yǎng)反硝化體系NO3--N 的還原作用均表現(xiàn)出抑制作用,且抑制作用與濃度呈正相關(guān);與此同時(shí),各反硝化體系普遍表現(xiàn)出NO2--N 去除速率低于NO2--N 生成速率;反應(yīng)結(jié)束后體系中SO42--S、TFe和Fe2+濃度與NO3--N 去除率呈正相關(guān),各濃度水平下OFL 實(shí)驗(yàn)組對反硝化效能抑制最為顯著.

3.2 100ng/L～500μg/L 濃度脅迫的FeS2/S0體系硝酸鹽還原過程符合一級動力學(xué)反應(yīng).ng/L 水平不同抗生素脅迫不會引起組間k值較大差異,但當(dāng)濃度升至為10～500μg/L 時(shí),各反應(yīng)體系中k值差值逐漸增大,且OFL 反應(yīng)體系的k值明顯低于其他反應(yīng)體系.

3.3100ng/L～500ug/L 濃度抗生素脅迫時(shí),反硝化體系中NAR 活性對OFL、ENR 和OTC 較為敏感,其NAR 酶活性低于其他實(shí)驗(yàn)組;當(dāng)抗生素濃度高于100ug/L 后,各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)體系的NIR 活性出現(xiàn)明顯抑制,NIR 活性變化相較于NO2--N 濃度變化存在滯后現(xiàn)象,出現(xiàn)NO2--N 短暫積累.

3.4 各抗生素介入均能降低體系的ETSA,下降幅度與抗生素濃度呈正相關(guān),其中以O(shè)FL 脅迫體系的ETSA 數(shù)值下降幅度最大:當(dāng)OFL 介入濃度為100ng/L～500μg/L,其 ETSA 數(shù)值下降 36.84%～57.89%,進(jìn)而導(dǎo)致整體反硝化速率顯著降低.