m6A甲基化在消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生與進展中的作用

梁銳煌, 朱南星, 侯 欽, 吳靈飛

梁銳煌, 朱南星, 侯欽, 吳靈飛, 汕頭大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化內科 廣東省汕頭市 515041

0 引言

近年來, 隨著人們飲食結構和生活方式的改變, 消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢. 消化道作為人類惡性腫瘤的好發(fā)部位之一, 腫瘤發(fā)生的機制十分復雜, 多條通路參與其中, 其中表觀遺傳學相關機制受到廣泛關注. 表觀遺傳修飾是指在不改變DNA核苷酸序列的前提下引起基因表達的可遺傳性改變, 其內容不但涉及DNA甲基化、組蛋白修飾, 還包括染色質重構等. 早期的研究主要集中于DNA和蛋白質水平, 隨著基因測序和生物信息學技術的進步, RNA 水平的化學修飾逐漸成為生命科學領域的研究熱點. 其中, N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)尤其引人注目. 目前已證實, m6A受多種因子的調節(jié), 在細胞增殖、侵襲、轉移等一系列惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用. 本文就m6A相關蛋白的功能及其與消化系腫瘤的研究進展作一述評.

1 RNA m6A的發(fā)現(xiàn)及其生物學特性

RNA 修飾是一個新興的領域, 常見的RNA甲基化包括5-甲基胞嘧啶(m5C)、N1-甲基腺苷(m1A)[1,2]和m6A[3]等. 目前, 在生物體內已發(fā)現(xiàn)有163種化學修飾[4], 分布在各種RNA上, 其中信使RNA(mRNA)的修飾尤其重要, 因為它具有將DNA的遺傳信息轉錄到蛋白質的功能. m6A甲基化修飾最早在酵母tRNA中發(fā)現(xiàn), tRNA發(fā)生m6A修飾后有助于維持其三葉草結構的穩(wěn)定性, 提高翻譯效率[5]. 1974年密歇根州立大學Desrosiers首次明確m6A甲基化是真核生物mRNA與長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA,lncRNA)之間最常見的內部修飾. m6A甲基轉移酶復合物利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)為甲基供體, 將腺嘌呤第6位氮原子上的氫甲基化而形成m6A. 這是mRNA轉錄后最豐富和保守的轉錄后表觀遺傳修飾.據(jù)統(tǒng)計, m6A甲基化大約占mRNA化學修飾的50%, 在生命起源及生物生長發(fā)育過程中起重要作用[6,7].m6A雖然發(fā)現(xiàn)較早, 但限于當時的實驗技術和條件, 較長時間并未取得進展. 由于mRNA半衰期較短, 其修飾的作用時間非常有限而在過去常被認為是靜態(tài)的. 隨著免疫共沉淀等生物技術的進步, m6A甲基化位點被識別,m6A修飾的作用重新引起了人們的關注. 2011年, Jia等[8]發(fā)現(xiàn)高度保守的脂肪質量與肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)參與了m6A的去甲基化調控. m6A這一可逆的動態(tài)過程極大拓展了人們對其生理功能的認識. 目前基于anti-m6A抗體的meRIP技術、miCLIP技術以及新近報道的不依賴抗體的MAZTERseq和DART-seq技術的研究結果表明, 哺乳動物RNA中約0.1%-0.4%的腺苷存在m6A甲基化修飾[6]. 這種修飾并非隨機分布在成熟轉錄本中, 而是在特定的位點如終止密碼子周圍、3?UTR和內部長外顯子內富集, 具有一致的motif, 即RRACH序列(R: A/G, H: A/C/U)[7,9,10]. 隨著m6A甲基轉移酶(Writers), 去甲基化酶(Erasers)和甲基識別蛋白(Readers)的不斷發(fā)現(xiàn), m6A與mRNA之間的關系被不斷揭示. m6A可逆、動態(tài)的修飾不僅參與了mRNA轉運出核、翻譯及降解等生理過程, 而且與腫瘤生長、轉移及化療耐藥密切相關[11-13]. 下面對新近取得的進展進行述評.

2 RNA m6A三類相關蛋白及其功能

2.1 m6A“Writers” 第一類蛋白質是m6A甲基轉移酶.它們編碼的基因被稱為m6A“writers”. Knuckles等[14]在小鼠胚胎干細胞中過表達METTL3, 通過TAP-LC-MS技術篩選鑒定與METTL3相互作用的蛋白. 將在高鹽條件下洗脫獲得的復合物命名為m6A-METTL復合物(m6A methyltransferase complex, MAC). 將在低鹽條件下洗脫獲得的復合物命名為m6A-METTL相關蛋白復合物(m6A methyltransferase associated complex, MACOM). 其中, MAC主要包括甲基轉移酶樣蛋白3 (methyltransferaselike 3, METTL3)和METTL14蛋白, 兩者以1:1比例形成穩(wěn)定的復合物并共定位于細胞核內[15]. METTL3作為主要的甲基化催化中心, 催化m6A合成, 它與METTL14、Wilm’s腫瘤1相關蛋白(Wilm’s tumor 1-associating protein,WATP)形成復合物. METTL14本身并無催化活性[16], 但可提高METTL3催化酶的活性[17]. WTAP對甲基化修飾亦無直接催化作用, 它通過招募METTL3-METTL14二聚體定位于核散斑中, 參與RNA的選擇性剪切并保持MAC酶活性. MACOM主要是由接頭蛋白WTAP、VIRMA/KIAA1429、RBM15、Zc3h13和CBLL1/HAKAI相互結合而形成復合物, 與MAC共同參與m6A甲基化修飾.WTAP作為接頭蛋白招募MAC定位到核散斑中[18]. 接頭蛋白KIAA1429、RBM15、HAKAI、Zc3h13等能夠與WTAP結合, 決定MAC的正確定位[19,20]. 此外, METTL16被鑒定為單獨存在的具有催化活性的m6A甲基轉移酶[21].它與METTL3同源, 可結合U6 snRNA, 導致U6第43位腺嘌呤m6A甲基化, 影響U6 剪切因子對mRNA前體的剪接[21]. Pendleton等[22]證實METTL16通過誘導甲硫氨酸腺苷轉移酶2A (MAT2A)合成參與snRNA甲基化調控.MAT2A編碼大部分細胞的SAM, 我們既往的研究表明,SAM與腺苷的代謝過程密切相關[23]. 細胞內甲硫氨酸水平下降可導致MAT2A表達增加. METTL16通過調控MAT2A mRNA腺苷的甲基化水平而影響MAT2A生成,進而調控snRNA的活性及其生物學功能.

2.2 m6A“Erasers” 第二類蛋白質是m6A去甲基化酶,其編碼基因稱為m6A“Erasers”, 它的功能是將RNA分子中已進行m6A修飾的甲基去除. 目前已證實參與m6A去甲基化修飾過程的有FTO和AlkB同源蛋白5 (AlkB homolog 5, ALKBH5). FTO定位于核散斑及細胞質, 對RNA上的m6A具有較強的去甲基活性. FTO與核斑點的部分共域化實驗結果表明mRNA中的m6A是FTO的作用底物[8]. Su等[24]分析了FTO催化m6A和N6, 2’-O-二甲基腺苷(m6Am)修飾的親和力, 結果證實FTO與其底物的結合與FTO蛋白的定位有關. 在細胞核中FTO只催化m6A去甲基化, 而在細胞質中FTO既可以介導m6A又可以催化m6Am的去甲基化. 有趣的是, Mauer等[25]研究表明FTO對m6Am的去甲基化酶活性大約是m6A的100倍, 顯示FTO的作用底物更可能是m6Am, 這與Jia等人的研究結果有所不同[8]. 目前多數(shù)學者認為, FTO在細胞核中對m6A親和力較高, 而在細胞質中對m6Am親和力更強[26,27].ALKBH5主要定位在核散斑, 影響mRNA的出核轉運[28].FTO與ALKBH5對m6A修飾的去甲基化作用是相互獨立的. ALKBH5可直接將m6A氧化為普通的腺苷, 而FTO則是分級代謝, 依次將m6A氧化為N6-羥甲基腺苷(hm6A)和N6-甲酰腺苷(f6A), 最后水解為腺嘌呤. 此外, 二者對底物的選擇性和序列的親和力也存在差別, 即m6A的“Erasers”可能因底物的“構象標記”不同而作用相異. 如FTO在小鼠大腦中表達水平高, 而ALKBH5在小鼠睪丸中表達較高. 這種在不同組織間的表達差異及其對底物的選擇性差別顯示了去甲基化酶生理作用的復雜性.

2.3 m6A“Readers” 第三類與m6A甲基化位點結合并讀取其信息的蛋白質被稱為m6A“Readers”, 即m6A識別蛋白.它們能夠選擇性識別靶RNA上的m6A并參與RNA的多種代謝過程. Readers包括YTHs家族蛋白、HNRNPs超家族蛋白和IGFBPs家族蛋白三組成員. 人具有5個含有YTH結構域的蛋白: 如定位于細胞質中的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2和定位于細胞核的YTHDC1. YTHDF蛋白雖然結構相似, 但功能不完全相同. YTHDF2在細胞質中促進mRNA的降解[29-31].YTHDF1結合m6A后促進mRNA的翻譯[32]. YTHDF2和YTHDF1的不同功能可能在維持mRNA降解和翻譯的平衡中發(fā)揮重要作用. YTHDF3與YTHDF1協(xié)同促進蛋白合成, 并通過YTHDF2介導mRNA降解[33]. YTHDC1促進外顯子的剪切以及控制其靶標的出核過程[34].YTHDC2能夠與RNA解旋酶相互作用, 調節(jié)mRNA翻譯延伸[35]. 總之, YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2可以促進mRNA降解; YTHDF1、YTHDF3、YTHDC2可以促進靶mRNA的翻譯; YTHDC1則影響mRNA的剪接及其核輸出過程. HNRNPs超家族蛋白包括三個成員:HNRNPA2B1、HNRNPC和HNRNPG. 這3個蛋白均在核內發(fā)揮作用. 其中HNRNPC和HNRNPG影響mRNA定位和可變剪切[36]. HNRNPA2B1促進miRNA初級轉錄本的剪接加工[37]. IGF2BPs包括IGF2BP1-3. 這類蛋白通過常見的RNA結合域識別具有m6A的RNA. IGF2BPs識別結合m6A修飾位點后, 增加mRNA的穩(wěn)定性, 避免其降解并促進其翻譯[38]. 此外, 真核起始因子eIF3能夠直接和mRNA 5?UTR的m6A修飾位點結合, 招募43S核糖體復合物并促進蛋白翻譯[39]. 有趣的是, 細胞質中METTL3也可作為識別蛋白并促進某些特定類型細胞mRNA翻譯[40].總之, m6A甲基化是一個動態(tài)、可逆的過程,MAC、MACOM及METTL16均能催化m6A形成, 而FTO和ALKBH5可使其去甲基化. 已甲基化的RNA被相應的Readers識別后才進入下一步代謝過程以保證其有效發(fā)揮生物學功能, 包括維持RNA穩(wěn)定、促進mRNA翻譯、或加速其剪切和降解等. 具體見圖1.

圖1 m6A RNA甲基化的基本機制. m6A RNA甲基化修飾是一個動態(tài)、可逆的過程. 此過程由甲基轉移酶“Writers”、去甲基化酶“Erasers”和甲基化識別蛋白“Readers”共同參與. “Writers” 由METTL3、METTL14、WTAP及KIAA1429、Zc3h13、RBM15、HAKAI和METTL16組成; “Erasers” 包括FTO和ALKBH5; “Readers”由YTHDC1-2、YTHDF1-3、HNRNPs和IGF2BP1-3組成. 其中甲基轉移酶的作用是催化mRNA上腺苷酸發(fā)生m6A修飾. 去甲基化酶是對已發(fā)生m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾. 識別蛋白的作用則是通過識別發(fā)生了m6A修飾的堿基而參與RNA的剪接、加工、翻譯和降解等過程.

3 m6A甲基化在不同消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進展

m6A既是mRNA加工和代謝的重要分子標志, 又在細胞分化進程中具有改變細胞狀態(tài)的功能[41], 如與細胞異型增生有關的mRNA可變剪切常受m6A調控[42], 表明m6A與腫瘤發(fā)生有關. 研究證實m6A相關的蛋白在乳腺癌[43]、肺癌[40]、急性髓細胞白血病[44]、宮頸癌[45]存在過表達或者低表達, 并通過多種機制促進相應腫瘤進展. 下面總結m6A在消化系腫瘤中的作用.

3.1 食管鱗狀細胞癌 Wu等[46]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過香煙煙霧冷凝物染毒后, 食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)中ALKBH5表達升高. ALKBH5高表達介導LINC00278的去甲基化, 抑制LINC00278-sORF1翻譯YY1BM. 而YY1BM可阻斷YY1與雄激素受體(AR)相互作用, YY1BM表達降低可促進AR信號通路介導的eEF2K上調, 使腫瘤細胞適應缺乏營養(yǎng)的環(huán)境而減少凋亡.這項研究從m6A去甲基化角度探索了吸煙促進ESCC進展的分子機制. Liu等[47]研究發(fā)現(xiàn)FTO在ESCC組織中的表達亦高于鄰近的正常組織, 并且與患者不良預后有關. FTO高表達正向調控癌基因MMP13, MMP13上調促進了ESCC轉移. Yang等[48]研究證實與癌旁正常組織相比, ESCC組織中YTHDC2的表達下調, 低表達YTHDC2有助于ESCC擴散, 表明m6A去甲基化酶及個別識別蛋白參與了ESCC的發(fā)生及發(fā)展過程, 但仍缺乏全面挖掘.m6A甲基化酶是否參與食管癌的發(fā)病尚不清楚.

3.2 胃癌 Ge等[49]收集100例胃癌(gastric carcinoma, GC)患者、30例良性胃病患者和75例健康對照的外周血液,通過比色法檢查發(fā)現(xiàn)GC組患者外周血RNA中m6A水平明顯高于胃病和健康對照組. 隨著GC的進展m6A水平升高, 手術后則下降. 受試者工作特性(receiver operating characteristic, ROC)曲線評估顯示, GC組m6A的曲線下面積明顯大于癌胚抗原(CEA)和糖類抗原199(CA19-9)的面積, 表明外周血總RNA的m6A檢測對GC診斷及預后有一定參考價值, 其作用優(yōu)于常規(guī)的癌胚抗原, 顯示出m6A作為GC診斷標記物有較好的臨床應用前景, 但其特異性和敏感性仍需擴大病例數(shù)進行臨床大樣本、多中心驗證.

Yue等[50]發(fā)現(xiàn)METTL3在GC細胞中表達上調,METTL3表達水平升高提示預后不良. 進一步研究發(fā)現(xiàn), ZMYM1是METTL3的m6A修飾靶標. METTL3通過對ZMYM1進行m6A修飾而增強ZMYM1 mRNA的穩(wěn)定性. 另外, ZMYM1通過形成CtBP/LSD1/CoREST復合物與上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)基因啟動子結合并抑制其表達, 從而促進上皮細胞-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)和癌細胞轉移. Liu等[51]同樣發(fā)現(xiàn)METTL3在GC細胞中表達上調, 其表達水平隨著腫瘤分期和分級的進展而逐漸升高. 敲低METTL3顯著抑制了GC細胞的總體RNA的m6A水平, 也顯著降低了與GFI-1和α-平滑肌肌動蛋白的表達, 從而抑制GC細胞的遷移.

METTL14與METTL3雖同屬于m6A“Writers”, 但Zhang等[52]研究發(fā)現(xiàn)敲降METTL14激活了Wnt和PI3KAkt信號傳導通路, 促進GC細胞的增殖和侵襲, 反而顯示出METTL14的抑癌作用. METTL3與METTL14在GCm6A甲基化過程中的不同結果顯示出“Writers” 調控機制的復雜性. Xu等[53]證實與癌旁非腫瘤組織相比,GC組織中FTO在蛋白水平和mRNA水平的表達均上調.FTO表達水平與細胞低分化、淋巴結轉移、患者的不良預后密切相關. 進一步研究發(fā)現(xiàn), FTO的表達與GC的TNM分期正相關, FTO表達下調可顯著抑制GC細胞的增殖、遷移和侵襲. 然而, Li等[54]發(fā)現(xiàn), FTO蛋白在印戒細胞癌和GC組織中表達水平顯著下調. FTO在GC中的作用有待進一步研究.

3.3 結直腸癌 Wu等[55]發(fā)現(xiàn)lncRNA RP11 (RP11-138 J23.1)在結直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)組織中高表達, 其表達水平隨著CRC分期的上升而增加. RP11有正向調節(jié)CRC細胞的遷移、EMT、促進CRC細胞肝轉移的功能.作者發(fā)現(xiàn)在HCT-15和HCT-8細胞中, 過表達的METTL3可提高RP11表達水平, 增加RP11和hnRNPA2B1之間的結合, 促進RP11/hnRNPA2B1/mRNA復合物的形成. Zeb1作為EMT轉錄因子之一, 其上調促進了細胞遷移. 研究發(fā)現(xiàn), 兩種泛素E3連接酶(Siah1和Fbxo45)通過泛素-蛋白酶體途徑誘導Zeb1降解, 而RP11/hnRNPA2B1/mRNA復合物可促進Siah1和Fbxo45的降解, 使Zeb1水平增高, 從而有助于CRC細胞EMT及遷移, 表明METTL3具有促癌作用. Peng等[56]發(fā)現(xiàn)METTL3在CRC細胞表達上調, 其高表達與CRC轉移呈正相關. METTL3通過甲基化primiR-1246使其成熟為miR-1246. miR-1246可抑制抑癌基因SPRED2的表達, 降低其在Raf/MEK/ERK通路中發(fā)揮的抑癌作用, 從而促進CRC細胞遷移、侵襲, 并誘導EMT.

多項研究證實, METTL3通過穩(wěn)定mRNA的方式, 促進CRC進展. Li等[57]通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫, 發(fā)現(xiàn)METTL3在多數(shù)惡性腫瘤中表達水平增加. 高表達METTL3的CRC患者總生存期和無病生存期縮短. 他們發(fā)現(xiàn)Y染色體性別決定區(qū)-box 2 (SOX2)是METTL3的下游基因, METTL3通過維持SOX2在CRC中的表達以促進CRC細胞的干性. 進一步研究發(fā)現(xiàn), METTL3提高了SOX2轉錄本的甲基化水平, 阻止其被降解[58,59]. Zhang等[60]通過qRT-PCR和IHC發(fā)現(xiàn)在化療耐藥的結腸癌組織中CBX8明顯過表達. CBX8將KMT2b招募到LGR5啟動子上, 使其維持H3K4me3狀態(tài)以促進LGR5的表達, 增加腫瘤細胞的干性, 并降低其化療敏感性. 進一步研究發(fā)現(xiàn), METTL3的甲基化修飾和IGF2BP1的結合有助于維持CBX8 mRNA的穩(wěn)定性. 另外, Zhu等[61]發(fā)現(xiàn)METTL3以m6A依賴的方式穩(wěn)定CCNE1的mRNA, 從而促進CRC細胞的增殖. 與上述研究結果不同的是, Deng等[62]發(fā)現(xiàn)METTL3的下調導致p-p38和p-ERK的激活, 促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲. Chen等[63]發(fā)現(xiàn)同樣作為“Writer”的METTL14在CRC組織和細胞系中表達下調, 并與患者總生存期密切相關. METTL14基因的敲低顯著降低總RNA中的m6A水平, 促進CRC細胞生長. 相反, METTL14過表達則增加總RNA中m6A水平, 抑制CRC細胞生長和轉移. 上述研究表明, 在CRC中METTL14發(fā)揮抑癌作用, 這與GC的結果相一致[52].

Wang等[64]研究證實與IGF2BP2穩(wěn)定性有關的lincRNA LINRIS在CRC組織中上調. LINRIS通過自噬-溶酶體途徑阻斷IGF2BP2的K139泛素化, 抑制IGF2BP2降解, 促進IGF2BP2的下游效應, 尤其是MYC介導的糖酵解過程, 使CRC耐藥性增強[65]. YTHDF已被多項研究證明與CRC的發(fā)生和進展有關. Bai等[66]證實YTHDF1在CRC中高表達, 且與腫瘤TNM分期、遠處轉移和腫瘤組織學分型有關. 研究表明, 癌基因c-Myc可與YTHDF1的5?UTR結合, 促進YTHDF1的表達. 而敲除YTHDF1則可抑制Wnt/β-catenin信號通路, 表明YTHDF1通過調控Wnt/β-catenin通路促進腫瘤進展[67]. Ni等[68]報道,lncRNA GAS5促進內源性YAP從細胞核到胞漿的移位和磷酸化而加速YAP降解, 進而在體內外抑制CRC進展,而YTHDF3通過促進lncRNA GAS5降解而阻遏YAP降解, 促進CRC的增殖及轉移. 上述研究表明“Readers”在CRC中發(fā)揮促癌作用. 然而, 是否存在起抑癌作用的m6A識別蛋白以及METTL3在CRC中究竟扮演何種角色尚有待進一步研究.

3.4 肝癌 Chen等[69]發(fā)現(xiàn), METTL3在肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中表達上調, 降低了SOCS2 mRNA穩(wěn)定性, 從而下調抑癌基因SOCS2的表達, 促進HHC病變進展并縮短患者的生存期. Zuo等[70]報道METTL3表達上調可通過METTL3 -LINC00958-HDGF軸促進HCC的發(fā)展.Cui等[71]發(fā)現(xiàn), 在肝母細胞瘤組織中METTL3與miR186的表達顯著負相關, METTL3表達上調通過Wnt/β-catenin途徑促進肝母細胞瘤進展. Ma等[72]證明METTL14可通過與抑癌因子pri-miR-126 DGCR8結合, 抑制HCC細胞轉移, METTL14低表達則增強HCC的侵襲和轉移能力. Chen等[73]發(fā)現(xiàn)WTAP在HCC中高表達, 通過Hur-EtS1 -P21/P27通路促進HCC的發(fā)生和發(fā)展. Lan等[74]證實KIAA1429在HCC組織中表達上調. GATA3是KIAA1429介導的m6A修飾的下游靶點. KIAA1429在HCC中高表達促進了GATA3 pre-mRNA的3?UTR發(fā)生m6A修飾, 導致RNA結合蛋白HuR的分離和GATA3 pre-mRNA的降解,從而加速腫瘤的增殖和轉移. 此外, KIAA1429通過上調ID2 mRNA上m6A修飾而抑制ID2的表達, 促進HCC細胞的遷移和侵襲[75].

Zhao等[76]報道, YTHDF1在HCC患者中表達明顯上調并與病理分期呈正相關. 作者通過對YTHDF1共表達基因的GO和KEGG通路分析, 發(fā)現(xiàn)YTHDF1在調節(jié)HCC細胞周期和代謝方面起著重要作用. 有趣的是, Zhou等[77]發(fā)現(xiàn), METTL3與YTHDF1共過表達的患者預后差. KEGG分析表明, 兩者介導HCC不良預后的機制與DNA復制、RNA的剪切和降解有關, METTL3和YTHDF1聯(lián)合檢測具有判斷HCC惡性程度和評估預后的價值.

Yang等[78]發(fā)現(xiàn)YTHDF2在HCC中表達上調, 并受到miR145負性調節(jié). Zhang等[79]的研究表明, 敲除YTHDF2后, Hep3B和Huh7兩種HCC細胞株的干細胞特性受損,而YTHDF2過表達會增加腫瘤干細胞(CSC)的表型. 在HCC中YTHDF2過表達通過調控OCT4 mRNA的m6A甲基化使OCT4表達上調, 促進CSC生長, 維持CSC表型, 從而促進HCC轉移. 與上述結果相反, Hou等[80]發(fā)現(xiàn)在YTHDF2缺陷的HCC中, STAT3的磷酸化以及IL-11和SERPINE2的表達上調, 而缺氧可以增強這種作用. 缺氧條件下誘導的YTHDF2下調加劇了HCC組織中的炎癥反應, 促進了HCC組織中的細胞增殖及血管異?；? 促進HCC細胞生長和病灶轉移, 表明YTHDF2發(fā)揮了抑癌作用. 有趣的是, Zhong等[81]的研究表明同樣在缺氧環(huán)境下, 下調YTHDF2誘導ERK磷酸化, 激活ERK/MAPK通路, 從而促進癌細胞的增殖. YTHDF2在HCC組織中直接結合EGFR 3’UTR的m6A修飾位點, 促進EGFR mRNA的降解, 進而抑制ERK/MAPK信號通路發(fā)揮抑癌作用. 多項研究表明IGF2BPs 與HCC細胞的增殖、轉移、侵襲能力和集落形成能力呈正相關[82,83], 但一些相互矛盾的結果顯示m6A相關蛋白在HCC中的作用機制仍需進一步研究.

Li等[84]發(fā)現(xiàn)低m6A水平的HCC中FTO表達明顯升高. 丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2, PKM2)在腫瘤細胞供能、EMT及侵襲轉移方面有重要作用, 是FTO的靶蛋白之一. 敲除FTO后, HCC組織增殖與克隆能力減弱, 同時可減少PKM2 mRNA表達及其蛋白生成, 而過表達PKM2可逆轉敲除FTO的表型改變, 表明FTO誘導的PKM2 mRNA的去甲基化具有促癌作用. 有趣的是, Rong[85]等發(fā)現(xiàn)FTO在肝內膽管細胞癌(ICC)細胞中的表達下調, 且FTO的表達與CA19-9的表達呈負相關,Kaplan-Meier生存分析顯示, FTO低表達預示ICC預后不良, 這表明FTO可能有抑制ICC進程的作用. 體外實驗發(fā)現(xiàn)FTO還可抑制ICC細胞生長和遷移. 另外, 裸鼠體內過表達FTO抑制了ICC腫瘤的生長. 這可能與FTO提高了TEAD2mRNA的穩(wěn)定性有關. 結合上述研究結果,METTL14在GC、CRC、HCC三種腫瘤中均起抑癌作用[52,63,72], 而METTL3主要發(fā)揮促癌作用[50,57,69]. FTO在多種腫瘤中出現(xiàn)異常表達, 但其作用及機制均有待進一步明確.

3.5 胰腺癌 Xia等[86]發(fā)現(xiàn)與正常細胞相比, 胰腺癌(pancreatic carcinoma, PC)組織中METTL3和mRNA水平顯著升高, 敲除METTL3后, RNA m6A修飾減少, 抑制了腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移, 表明METTL3具有促癌作用. 此外, Taketo等[87]發(fā)現(xiàn)m6A修飾與PC化療藥物的敏感度有關, METTL3缺失的細胞對抗癌藥如吉西他濱、5-氟尿嘧啶、順鉑和輻射顯示出更高的敏感性. 進一步研究表明, 包括MAPK級聯(lián)反應、泛素化過程、RNA剪接等多條關鍵途徑可能均是METTL3的作用靶點. 這些信號通路的改變直接導致了腫瘤進展和化療耐藥, 表明METTL3參與了PC放療及化療耐藥的調控. 此外, 他們還發(fā)現(xiàn)METTL3的下調加速了PC細胞凋亡. m6A還可以通過影響miRNA或lncRNA調節(jié)PC的發(fā)生. Zhang等[88]發(fā)現(xiàn)胰管上皮細胞中, 香煙煙霧冷凝物促使有致癌作用的miR-25成熟依賴于METTL3過表達介導的m6A甲基化.METTL3在PC中的促癌作用, 與其在GC、CRC及HCC中所起的作用一致[50,57,69].

Tang等[89]發(fā)現(xiàn)ALKBH5在基于吉西他濱治療患者的異種移植瘤模型中下調, 其過表達增加PC對化療的敏感性. 在體外和體內, 沉默ALKBH5顯著增加PC增殖、遷移和侵襲, 而過表達ALKBH5導致完全相反的效果. 進一步研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過降低Wnt抑制因子1的m6A水平及阻礙Wnt信號通路來抑制PC的發(fā)生. He等[90]的研究發(fā)現(xiàn), ALKBH5過表達后, KCNK15-AS表達隨之增加, 而PC細胞的EMT受到了抑制, 提示KCNK 15-AS1對PC細胞遷移和侵襲具有抑制作用, 也間接證實ALKBH5可抑制EMT進程. Cho等[91]證實ALKBH5是PC患者的獨立預后因素. ALKBH5表達與患者預后顯著正相關. Chen等[92]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比, PC組織中YTHDF2的表達在基因和蛋白質水平上均上調. 高表達的YTHDF2在PC組織中顯示出雙重作用: 一方面促進癌細胞增殖; 另一方面YTHDF2通過YAP信號調控EMT,抑制PC細胞的轉移和侵襲. 此外, Tang[93]等研究亦表明,FTO在PC中高表達. 敲除FTO后可抑制腫瘤的形成和進展, 增加PC細胞凋亡, 表明FTO具有促癌作用.

RNA m6A甲基化修飾相關蛋白在消化系統(tǒng)食管、胃、肝臟、胰腺及結直腸惡性腫瘤發(fā)病中的作用如圖2所示.

圖2 消化系惡性腫瘤中常見m6A修飾相關蛋白的作用. 黑色表示該蛋白發(fā)揮癌基因的作用. 藍色表示該蛋白發(fā)揮抑癌基因的作用. 紅色表示該蛋白在該部位腫瘤發(fā)病中的作用仍有爭論. 目前比較明確的是去甲基化酶FTO在食管癌、胰腺癌中是促癌基因; 甲基化識別蛋白YTHDF1在肝癌及結腸癌中亦是促癌基因; 甲基轉移酶METTL3在胃癌、肝癌及胰腺癌中多發(fā)揮促癌作用; 而METTL14在胃癌、肝癌及結直腸癌中具有抑癌效應.

4 小結與展望

m6A甲基化修飾的發(fā)現(xiàn)豐富了表觀遺傳學的內容. m6A甲基轉移酶、去甲基化酶和識別蛋白各司其職, 共同調節(jié)靶基因上的m6A含量, 進而影響腫瘤的發(fā)生. 以m6A修飾為核心的靶向治療已經(jīng)成為臨床研究的新熱點. 其中包括: FTO抑制劑、METTL3-14/WTAP激活劑及其聯(lián)合用藥. 目前m6A相關蛋白抑制劑或激活劑存在活性低、特異性差、在細胞內確切作用機制不清等問題,其開發(fā)尚處于起步階段. 許多問題仍未解決: (1)未知的m6A修飾相關蛋白有待進一步鑒定; (2)新的m6A修飾機制有待進一步闡明; (3)鑒于甲基化酶和去甲基化酶在m6A修飾中起相反的作用, 如果去甲基化酶在某種癌癥中發(fā)揮癌基因的作用, 是否甲基轉移酶一定扮演抑癌基因的角色? (4)有些m6A修飾蛋白具有雙重身份, 既可促癌又能抑癌, 這種“雙刃刀”作用的觸發(fā)機制又是什么? (5)“Readers”是如何選擇識別并結合靶RNA? 不同“Reader”之間是相互競爭還是具有協(xié)同作用? 哪些m6A甲基化蛋白具有早癌篩查和/或腫瘤預后判斷的臨床價值? 相信隨著m6A甲基化研究的不斷深入, 終將揭開這些謎團, 最終為腫瘤患者帶來福音.