特效菌群構(gòu)建及其處理蘭炭廢水試驗研究

晉銀佳， 劉繼明， 劉彥東， 郭棟， 徐展， 尤良洲， 衡世權(quán)

（1.華電電力科學(xué)研究院有限公司， 杭州 310030； 2.神木職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 榆林 719300；3.河北華電石家莊鹿華熱電有限公司， 石家莊 050200）

蘭炭是一種重要的生產(chǎn)原料， 在蘭炭生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生蘭炭廢水［1］。 蘭炭廢水含有高濃度的單環(huán)及多環(huán)芳香族化合物， 主要為二元酚和三元酚［2］，具有較高的生物毒性， 使得蘭炭廢水的生化處理效果極為有限。 近年來， 隨著國家環(huán)保要求的日益提升， 蘭炭廢水的達標排放面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。 高級氧化技術(shù)能夠?qū)μm炭廢水中的有機物分子進行有效分解， 顯著降低蘭炭廢水的COD［2－4］； 電化學(xué)氧化技術(shù)可有效降低廢水COD 和氨氮［5］； 光催化與電化學(xué)氧化結(jié)合的工藝處理蘭炭廢水， COD 去除率達到60.63%［6］； 在添加NaCl 的情況下， 電化學(xué)處理技術(shù)可以將蘭炭廢水中COD 和氨氮去除率提升至84.31% 和95.77%［7］。 高級氧化技術(shù)和電化學(xué)處理技術(shù)對蘭炭廢水的COD 和氨氮有較好的去除效果，然而運行成本較高， 并且處理出水難以確保達到排放標準。

采用臭氧氧化提升蘭炭廢水的可生化性， 通過生物法進一步去除廢水的COD， 處理效果顯著提升［8］。 然而， 由于蘭炭廢水中的酚類分子能夠破壞微生物菌群的活性和氧化功能， 從而使得其生化處理效果受到限制［9－11］。 因此， 降低蘭炭廢水的生物毒性、 提高蘭炭廢水的可生化性對于提升生化處理工藝的處理效果具有重要意義。

醫(yī)藥廢水中含有抗生素等對微生物具有抑制作用的物質(zhì)以及高濃度的COD、 有機氮， 因此， 本研究利用某醫(yī)藥廢水處理系統(tǒng)的活性污泥， 通過在蘭炭廢水中進行適應(yīng)性馴化后得到特效菌群， 并將其用于蘭炭廢水的處理， 考察該特效菌群對蘭炭廢水毒性、 COD、 氨氮的去除效果， 為蘭炭廢水的解毒預(yù)處理提供新的思路和方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器及試劑

5B－3A 型COD 分析儀， SHP－160 型生化培養(yǎng)箱， PHSJ－3F 型pH 計， BT600－2J 型蠕動泵，F(xiàn)A1004E 型電子天平， 501A 型恒溫水浴器， JPBJ－607A 型溶解氧測定儀。

重鉻酸鉀， 濃硫酸， 硫酸銀， 氫氧化鈉， 酒石酸鉀鈉， 過硫酸鉀， 氯化銨， 硫代硫酸鈉， 碳酸鈉， 氯化鈉等， 均為分析純； 牛肉膏， 蛋白胨， 水溶性淀粉， 葡萄糖， 均為化學(xué)純。

1.2 試驗用水

無菌水： 通過將去離子水在高壓滅菌鍋內(nèi)進行滅菌處理制備獲得。

蘭炭廢水取自陜西榆林某焦化廠， 水質(zhì)分析結(jié)果如表1 所示。

表1 蘭炭廢水水質(zhì)Tab.1 Semi－coke wastewater quality

蘭炭廢水呈灰黑色， 通常含有高濃度酚類等對細菌活性具有抑制毒性的有機物， 使得蘭炭廢水的生物處理效果受到限制［12－14］。 通過測試分析特效菌群處理前后蘭炭廢水毒性的變化， 分析特效菌群對蘭炭廢水解毒處理效果。 廢水毒性測試分為綜合生物毒性測試和硝化菌抑制性測試。 綜合生物毒性測試采用最小抑菌濃度（MIC）法， 以對人體安全無害的植物乳酸桿菌（lactobacillus plantarum ATCC 14917）為標準被試菌種， 以抑制菌種ATCC 14917生長所需最低廢水濃度比例表征被測水樣的微生物毒性， MIC 值越高， 表示毒性越低； 硝化菌抑制性測試采用半數(shù)最大效應(yīng)濃度（N－EC50）法， 以市售硝化菌劑為被試菌種， 與空白對照組相比， 將24 h氨氧化抑制率達到50% 的最低水樣濃度定義為NEC50 值， N－EC50 值越高， 表示毒性越低。 將蘭炭廢水的原水進行了MIC 和N－EC50 毒性分析，檢測結(jié)果如表2 所示。

表2 蘭炭廢水MIC 和N－EC50 毒性分析結(jié)果Tab.2 MIC and N－EC50 toxicity analysis of semi－coke wastewater

蘭炭廢水的毒性測試結(jié)果表明， 廢水對于微生物具有較強的毒性， 3% 的蘭炭廢水（相當(dāng)于稀釋33.3 倍）對微生物即顯示出明顯的抑制作用， 0.3%的蘭炭廢水（相當(dāng)于稀釋333.3 倍）即可對硝化菌產(chǎn)生明顯的抑制作用。 因此， 蘭炭廢水采用常規(guī)的生化處理工藝難以達到預(yù)期的效果［15－16］， 其原因主要為毒性較強， 對微生物具有顯著的抑制作用， 限制了微生物對廢水中有機污染物的降解。 通過采用特效菌群對蘭炭廢水進行預(yù)處理， 分解廢水中含有的酚類等有機物， 可以降低蘭炭廢水對細菌的毒性。

1.3 特效菌群馴化、 培養(yǎng)

菌群取自某醫(yī)藥廢水生化處理系統(tǒng)的活性污泥。 取10 mL 活性污泥， 加入到盛有200 mL 蘭炭廢水的錐形瓶中， 用鹽酸將蘭炭廢水pH 值調(diào)整至7 左右， 將錐形瓶放在恒溫水浴器中， 設(shè)定溫度為35 ℃； 用空氣泵向錐形瓶中鼓入空氣， 空氣流量設(shè)置為300 mL／min； 用滴管向蘭炭廢水中加入水溶性淀粉和葡萄糖的混合物水溶液， 水溶性淀粉和葡萄糖質(zhì)量分數(shù)均為5%， 添加量為5mL， 每8 h添加1 次。 活性污泥在蘭炭廢水中適應(yīng)馴化10 d后， 存活的菌群即為特效菌群。 將含有特效菌群的蘭炭廢水通過離心機將特效菌群分離出來， 用無菌水將分離出的菌團清洗3 次， 然后加入100 mL 滅菌處理后的生理鹽水將菌團混勻， 封口后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

特效菌群可以采用滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3 g、 蛋白胨10 g、 NaCl 5 g、 瓊脂20 g、 水1 000 mL、 pH值7.0 ～8.0。 將馴化后的特效菌群用滅菌后的接種環(huán)蘸取保存在生理鹽水中的菌液， 將菌液接種在培養(yǎng)基上， 并將接種菌液后的培養(yǎng)基置于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)30 h。 培養(yǎng)基上長出菌斑后將培養(yǎng)皿取出， 用生料帶密封后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗方法

（1） 特效菌群定性分析。 對經(jīng)篩選、 分離、 馴化所得到的特效菌群進行16S rDNA 鑒定， 選擇通用引物對細菌基因進行PCR 擴增， 產(chǎn)物克隆到pMD 18－T 載體中。 經(jīng)16S rDNA 鑒定， 將序列與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST 比對，并將結(jié)果上傳到NCBI 進行同源性分析， 從而確定特效菌群中的細菌種屬。

取特效菌群的菌液進行微生物多樣性分析檢測。 DNA 提取采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 試劑盒，使用Nanodrop 2000 對DNA 的質(zhì)量和濃度進行檢測， 所有提取的DNA 樣本存儲在－20 ℃待進一步分析。 16S rDNA 基因的高通量測序使用Illumina MiSeq PE300 測序平臺。 細菌基因的PCR 擴增引物采用2 7 F（5′－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－CGGYTACCTTGTTACGACTT－3′）， PCR擴增反應(yīng)條件參考文獻［17］。

（2） 特效菌群處理蘭炭廢水靜態(tài)試驗。 在靜態(tài)試驗中， 為了探究特效菌群對不同濃度蘭炭廢水的處理效果， 分別將蘭炭廢水稀釋5 倍和10 倍進行靜態(tài)試驗。 靜態(tài)試驗的操作方法如下： 取20 mL 蘭炭廢水加入250 mL 錐形瓶， 向錐形瓶中加入79 mL 無菌水， 再接種1 mL 特效菌群的菌液， pH 值調(diào)節(jié)為7.0， 此時蘭炭廢水被稀釋了5 倍， 記為體系A(chǔ)； 取10 mL 蘭炭廢水加入250 mL 錐形瓶， 向錐形瓶中加入89 mL 無菌水， 再接種1 mL 特效菌群的菌液， pH 值調(diào)節(jié)為7.0， 此時蘭炭廢水被稀釋了10 倍， 記為體系B。 將A、 B 2 個錐形瓶的瓶口用紗布密封后置于恒溫搖床中， 溫度設(shè)置為35 ℃。用空氣泵向A、 B 2 個錐形瓶中鼓入空氣， 空氣流量設(shè)置為150 mL／min。 每隔24 h 取廢水水樣， 分析廢水COD、 總氮、 氨氮含量。 靜態(tài)試驗持續(xù)18 d。

（3） 特效菌群處理蘭炭廢水動態(tài)試驗。 取250 mL 蘭炭廢水加入1 000 mL 錐形瓶， 向錐形瓶中加入220 mL 無菌水， 再接種10 mL 特種菌群的菌液，調(diào)節(jié)pH 值為7.0 后用無菌水定容至500 mL（蘭炭廢水稀釋2 倍）， 向錐形瓶中投加部分填料， 便于菌群附著生長。 將錐形瓶的瓶口用紗布密封后置于恒溫搖床中， 溫度設(shè)置為35 ℃。 用空氣泵向錐形瓶中鼓入空氣， 空氣流量設(shè)置為1 500 mL／min。 將廢水進行循環(huán)， 蠕動泵流量控制在100 mL／min。每隔24 h 取廢水水樣， 分析廢水COD、 總氮、 氨氮含量， 并在試驗結(jié)束時測定廢水的MIC 和NEC50 毒性。 動態(tài)試驗持續(xù)18 d。

1.5 分析方法

COD 采用重鉻酸鹽法［18］， 總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法［19］， 氨氮采用納氏試劑分光光度法［20］。

2 結(jié)果與討論

2.1 特效菌群定性分析

通過同源性比對分析， 發(fā)現(xiàn)特效菌群中DNA序列與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、 副球菌菌屬（Paracoccus sp.）和紅球菌菌屬（Rhodococcus sp.）相似性較高， 相似度都達到99%。 16S rDNA 鑒定結(jié)果與Biolog 生理生化鑒定結(jié)果的細菌菌屬相一致。

本研究分離的特效菌群中含有的芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）和紅球菌菌屬（Rhodococcus sp.）， 對苯酚、 喹啉等具有明顯的分解效果。 芽孢桿菌和紅球菌能利用喹啉、 苯酚作為碳源和氮源， 將喹啉降解為2－羥基喹啉和8－羥基香豆素［21－22］， 將苯酚降解為羧酸類分子、 乙醛等。 蘭炭廢水中含有高濃度的苯酚、 喹啉等有機物［10］， 因此， 分離馴化得到的特效菌群對蘭炭廢水中的有機物分子具有較好的降解去除潛力。

2.2 靜態(tài)試驗結(jié)果分析

由于蘭炭廢水的微生物毒性極強， 直接采用特效菌群處理蘭炭廢水效果較差， 因此， 為了解特效菌群對蘭炭廢水COD、 氨氮、 總氮的去除效果，在靜態(tài)試驗中對蘭炭廢水進行了一定程度的稀釋，然后再采用特效菌群進行處理。

靜態(tài)試驗中， 將蘭炭廢水分別稀釋5 倍和10倍（A 體系和B 體系）， 試驗持續(xù)時間為18 d。 通過靜態(tài)試驗考察了特效菌群對蘭炭廢水的處理效果，主要分析了COD、 氨氮和總氮3 個指標的下降情況， 結(jié)果如圖1 所示。

圖1 靜態(tài)試驗結(jié)果Fig.1 Static experiment results

對于A 體系， 經(jīng)過18 d 的處理， 蘭炭廢水COD 的質(zhì)量濃度明顯下降， 從10 896 mg／L 下降到5 726 mg／L， 去除率達到47.43%； 總氮的質(zhì)量濃度略有下降， 從804 mg／L 降低到733 mg／L， 去除率約為8.83%； 氨氮的質(zhì)量濃度也略有下降， 從534 mg／L 降低到408 mg／L， 去除率約為23.60%。A 體系靜態(tài)試驗結(jié)果表明， 特效菌群對蘭炭廢水的COD 具有明顯的去除效果， 對總氮和氨氮有一定的去除效果， 表明在A 體系工況下， 特效菌群能夠存活并具有一定的降解能力。 相較于總氮， 特效菌群對廢水中COD 和氨氮的去除速度更快， 而生化反應(yīng)過程中反硝化速度較慢， 導(dǎo)致總氮去除速度較慢［22］。 因此， 蘭炭廢水經(jīng)過特效菌群進行預(yù)處理后， 后續(xù)的生化處理過程應(yīng)強化反硝化反應(yīng)， 提升蘭炭廢水的總氮去除效果。

對于B 體系， 經(jīng)過18 d 的處理， 蘭炭廢水COD 的質(zhì)量濃度明顯下降， 從5 289 mg／L 下降到3 148 mg／L， 去除率達到40.48%； 總氮的質(zhì)量濃度略有下降， 從398 mg／L 降低到347 mg／L， 去除率約為12.81%； 氨氮的質(zhì)量濃度也略有下降， 從269 mg／L 降低到190 mg／L， 去除率約為29.37%。B 體系靜態(tài)試驗結(jié)果表明， 特效菌群對蘭炭廢水的COD 具有明顯的去除效果， 對總氮和氨氮的去除效果相對于A 體系更好， 特效菌群對蘭炭廢水中總氮和氨氮的去除效果受廢水中污染物濃度的影響較大。 通過稀釋雖然能夠提高特效菌群對蘭炭廢水的處理效果， 但是稀釋也將導(dǎo)致需要處理的廢水量增加， 使得廢水處理系統(tǒng)的規(guī)模增加， 廢水處理系統(tǒng)的占地和投資運行成本顯著提升， 因此， 在實際工程應(yīng)用中需要合理確定廢水稀釋倍數(shù)［23］。

2.3 動態(tài)試驗結(jié)果分析

靜態(tài)試驗結(jié)果表明， 特效菌種對蘭炭廢水有一定的耐受能力， 并能夠降低廢水的COD、 總氮和氨氮指標。 為模擬實際工程項目運行工況， 優(yōu)化靜態(tài)試驗處理效果， 探究特效菌群的最優(yōu)處理能力，采用連續(xù)進出水動態(tài)試驗， 模擬工程運行條件開展蘭炭廢水處理的動態(tài)試驗研究， 將蘭炭廢水稀釋2倍， 試驗持續(xù)18 d， 結(jié)果如圖2 所示。

蘭炭廢水COD 的質(zhì)量濃度從27 240 mg／L 降低到9 827 mg／L， 去除率達到65.20%； 總氮的質(zhì)量濃度也有明顯下降， 從2 010 mg／L 降低到1 452 mg／L， 去除率約為27.76%； 氨氮的質(zhì)量濃度有顯著下降， 從1 335 mg／L 降低到545 mg／L， 去除率約為59.17%。 動態(tài)試驗結(jié)果表明， 在動態(tài)工況下特效菌群對蘭炭廢水有良好的處理效果， 對COD、氨氮均有大幅度的去除； 廢水的B／C 值從0.12 提升至0.43， 可生化性顯著提升。 在動態(tài)試驗工況下， 蘭炭廢水與特效菌群的混合更為均勻， 菌群與污染物分子反應(yīng)過程的傳質(zhì)速率相較于靜態(tài)工況更高， 因此具有更好的廢水處理效果［24］。 經(jīng)過特效菌群處理后， 廢水中的難降解有機物分子被分解， 可生化性顯著提高， 顯著降低了后續(xù)生化處理系統(tǒng)的運行負荷， 有助于提升蘭炭廢水的生化處理出水水質(zhì)［25］。

2.4 蘭炭廢水生物毒性變化

在動態(tài)試驗結(jié)束后， 對處理后蘭炭廢水的MIC和N－EC50 毒性進行了檢測， 結(jié)果如表3 所示。

表3 動態(tài)試驗后蘭炭廢水MIC 和N－EC50 毒性分析結(jié)果Tab.3 MIC and N－EC50 toxicity analysis of semi－coke wastewater after dynamic experiment

經(jīng)過特效菌群的處理， 蘭炭廢水的MIC 和NEC50 毒性顯著降低。 MIC 值從3% 升高到30%，基本上實現(xiàn)了綜合生物毒性的去除， 菌群的生物活性顯著提升， 加速了廢水中有機物的降解去除；N－EC50 值從0.3% 升高到5%， 廢水的硝化菌抑制毒性顯著降低， 硝化菌的活性顯著提升， 氨氮的去除效果得到提高。 動態(tài)試驗結(jié)果表明， 利用特效菌群對蘭炭廢水進行預(yù)處理， 蘭炭廢水的綜合生物毒性和硝化菌抑制毒性均顯著降低， 該特效菌群對蘭炭廢水COD 和氨氮均表現(xiàn)出良好的去除效果， 顯著改善了蘭炭廢水的可生化性， 為后續(xù)的蘭炭廢水生化處理奠定了較好的基礎(chǔ)。 將特效菌群加入蘭炭廢水生化處理系統(tǒng)能夠增加反應(yīng)體系的微生物群落多樣性， 提高對有毒難降解污染物的去除能力［26－27］。

3 結(jié)論

（1） 醫(yī)藥廢水生化處理系統(tǒng)中分離出的菌群經(jīng)過適應(yīng)性馴化后， 對蘭炭廢水COD、 氨氮、 總氮均具有較好的處理效果。

（2） 特效菌群對蘭炭廢水有較好的解毒效果，動態(tài)試驗中， 處理后蘭炭廢水的MIC 值從3%升高到30%， N－EC50 值從0.3% 升高到5%， B／C 值從0.12 提升至0.43， 經(jīng)過特效菌群處理后能夠顯著降低蘭炭廢水的生物毒性， 并提升蘭炭廢水的可生化性。

（3） 特效菌群對蘭炭廢水中的COD 和氨氮有較好的去除效果， 將蘭炭廢水稀釋2 倍， 開展動態(tài)試驗研究， 結(jié)果表明經(jīng)過處理后的COD 和氨氮的去除率分別達到65.20% 和59.17%， 顯著降低后續(xù)生化處理的負荷。