多光譜法和分子對(duì)接模擬法研究茶堿和胃蛋白酶的相互作用

王曉霞, 馬力通, 孫吉盛, 聶智華, 賽華征, 成建國(guó), 段建國(guó)

1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院, 內(nèi)蒙古 包頭 014010

2. 生物煤化工綜合利用內(nèi)蒙古內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心, 內(nèi)蒙古 包頭 014010

3. 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100084

引 言

茶堿(Theophyline, TPL)是黃嘌呤類衍生的化合物, 具有利尿、 強(qiáng)心和松弛支氣管平滑肌等功效。 胃蛋白酶(Pepsin, PEP)是一種促進(jìn)食物中蛋白質(zhì)消化的酶類, 將蛋白質(zhì)分解為小的肽片段, 方便食物消化, 是人體內(nèi)重要的消化類蛋白酶[1]。 研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制及結(jié)合模式, 對(duì)于闡明藥物的代謝與運(yùn)輸方式、 了解蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和作用都有著重要意義。 藥物被攝入人體后, 極大可能會(huì)與PEP發(fā)生反應(yīng), 因此探究藥物中的化學(xué)分子與PEP的作用機(jī)制, 對(duì)于藥物的發(fā)現(xiàn)、 藥物的設(shè)計(jì)、 提升藥物療效以及降低藥物副作用奠定了一定的理論基礎(chǔ), 讓藥物設(shè)計(jì)更加高效、 可控。 為了更全面了解蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的形式與代謝過(guò)程以及藥物與蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)性質(zhì), 通過(guò)多光譜法和分子對(duì)接模擬技術(shù)探究TPL與PEP的相互作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(L6S, 上海儀電分析儀器有限公司); 傅里葉變換紅外光譜儀(SPECTRUM 3, 鉑金埃爾默企業(yè)管理有限公司); 熒光分光光度計(jì)(F-7100, 日本日立); 圓二色光譜儀(Chirascan plus, 英國(guó)應(yīng)用光物理公司)。

茶堿(TPL, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%, 內(nèi)蒙古佳合藥業(yè)有限公司); 胃蛋白酶(PEP, 純度≥99%, 合肥千盛生物有限公司); 檸檬酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%, 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司); 檸檬酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%, 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司); 氯化鈉(NaCl, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.4%, 天津化學(xué)試劑三廠)。

配制pH為2.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液, 1×10-4mol·L-1的TPL溶液和含有0.5 mol·L-1NaCl且pH 2.0的5×10-4mol·L-1的PEP溶液。

實(shí)驗(yàn)室所有用到的試劑全部為分析純, 實(shí)驗(yàn)所用的水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜的測(cè)定

取9支10 mL比色管, 分別加入1 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 再分別加入0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5和4.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 用蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min。 恒溫水浴鍋水浴20 min, 分別在298、 303和308 K用熒光光度計(jì)測(cè)定熒光光譜。 在熒光激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)在290～550 nm, 狹縫寬度均為5 nm, 掃描速度為1 200 nm·min-1條件下, 測(cè)量三個(gè)溫度下PEP的熒光光譜。

1.2.2 同步熒光光譜的測(cè)定

取9支10 mL比色管, 分別加入1 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 向其分別加入0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5和4.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 用蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min放入298 K下的恒溫水浴鍋水浴20 min, 待測(cè)。 參數(shù)設(shè)置Δλ=15 nm和Δλ=60 nm, 激發(fā)波長(zhǎng)λex掃描范圍250～550 nm, 狹縫設(shè)置為5, 掃描速度1 200 nm·min-1, 測(cè)量并記錄PEP的熒光光譜。

1.2.3 三維熒光光譜的測(cè)定

取2支10 mL比色管, 一支加入1 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 用蒸餾水定容至刻度線; 另一支比色管加入1.0 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 2.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min。 放入298 K下的恒溫振蕩器下加熱20 min, 待測(cè)。 參數(shù)設(shè)置為激發(fā)波長(zhǎng)λex范圍200～500 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)λem范圍200～500 nm, 狹縫設(shè)置為5, 掃描速度2 400 nm·min-1, 測(cè)量三維熒光光譜。

1.2.4 紫外光譜的測(cè)定

取9支10 mL比色管, 分別加入2 mL濃度為1×10-3mol·L-1的PEP溶液, 在分別加入0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5和4.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 用蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min后。 放入298 K下的恒溫振蕩器下加熱20 min, 待測(cè)。 設(shè)置紫外光譜儀參數(shù), 掃描范圍200～400 nm, 使用石英比色皿, 在298 K時(shí)進(jìn)行紫外光譜測(cè)量。

1.2.5 結(jié)合距離的測(cè)定

在三支比色管, 分別配制成PEP溶液、 TPL溶液與PEP-TPL混合溶液, 濃度全部為1.0×10-5mol·L-1, 第三個(gè)混合體系中TPL與PEP濃度比1∶1。 298 K恒溫水浴鍋靜置20 min。 對(duì)TPL溶液進(jìn)行紫外測(cè)定, PEP溶液與PEP-TPL溶液進(jìn)行熒光測(cè)定。 熒光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置為激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)λem范圍290～550 nm, 狹縫設(shè)置為5, 掃描速度1 200 nm·min-1。 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)置為掃描200～500 nm波長(zhǎng)范圍。

1.2.6 紅外光譜的測(cè)定

稱取一定質(zhì)量的PEP及TPL固體干燥粉末, 按照PEP與TPL的質(zhì)量比為1∶0及2∶1混合, 放入研缽中充分混合并研磨5 min, 準(zhǔn)確稱量0.100 0 g KBr后加入研缽充分研磨, 壓片處理, 設(shè)定掃描范圍4 500～500 cm-1, 進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.7 圓二色光譜的測(cè)定

取兩支比色管, 一支取一定濃度的PEP溶液; 另一支取同樣濃度的PEP與一定濃度的TPL混合液, 得到PEP與TPL濃度比為1∶3的溶液待測(cè)。 設(shè)置圓二色譜儀器參數(shù), 設(shè)定帶寬Bandwidth為1.0 nm, 設(shè)定光譜掃描范圍180～260 nm, 設(shè)置單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的采樣時(shí)間Time-per-point為0.5 s, 以配制好的pH 2.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液為參比液, 分別記錄PEP與TPL-PEP體系的圓二色光譜數(shù)據(jù)。

1.2.8 分子對(duì)接模擬技術(shù)

運(yùn)用ChemDraw 18.0軟件作TPL結(jié)構(gòu)圖, 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中RCSB Protein Data Bank中找到PEP的晶體結(jié)構(gòu), 利用網(wǎng)頁(yè)程序Z-Dock(http：//zdock.umassmed.edu)進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)的選擇和綁定點(diǎn)殘留的選擇, 利用分子對(duì)接軟件Accelrys Discovery Studio3.5采用CDOCKER模塊進(jìn)行分子對(duì)接模擬。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPL與PEP的熒光猝滅光譜

PEP中具有三種可以發(fā)射熒光的芳香氨基酸, 分別是色氨酸、 苯丙氨酸與酪氨酸。 其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度可以用于檢測(cè)PEP與藥物作用的相關(guān)研究[2]。 圖1(a—c)分別是298、 303和308 K溫度時(shí), 相同濃度的PEP隨著TPL濃度增大熒光強(qiáng)度的變化情況。 由圖1(a)可知, 在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為342 nm時(shí)PEP產(chǎn)生了熒光發(fā)射峰。 從圖1可以看出, 隨著TPL濃度逐漸增大, PEP的熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性下降趨勢(shì), 其發(fā)射峰位置沒(méi)有明顯變化, 由此可見(jiàn), 兩者發(fā)生了反應(yīng), TPL對(duì)PEP的熒光產(chǎn)生猝滅作用。

圖1 三個(gè)溫度下TPL-PEP體系熒光光譜

本實(shí)驗(yàn)采用Stern-Volmer方程[3]判斷TPL對(duì)PEP的猝滅作用類型, 方程如式(1)

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式(1)中,F0為未加入猝滅劑(TPL)時(shí)PEP的熒光強(qiáng)度,F為加入猝滅劑(TPL)后TPL-PEP體系的熒光強(qiáng)度,Ksv為Stern-Volmer動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù), [Q]是猝滅劑(TPL)的實(shí)際濃度,Kq是動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù), 各類熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L·(mol·s)-1,τ0為沒(méi)有猝滅劑下生物大分子的平均壽命為10-8s。

對(duì)所研究TPL在298、 303和308 K溫度下對(duì)PEP熒光強(qiáng)度的影響, 以F0/F值為縱坐標(biāo), [Q]為橫坐標(biāo)作圖, 得到Stern-Volmer曲線, 見(jiàn)圖2。 由圖2得到動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv與動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)Kq于表1。 由表1得知Stern-Volmer動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·(mol·s)-1, 證明TPL通過(guò)靜態(tài)猝滅的方式猝滅PEP的熒光。 通過(guò)表1可知不同溫度下的猝滅常數(shù)Ksv(L·mol-1)： 2.221×104(298 K), 2.057×104(303 K), 2.018×104(308 K)。 隨著溫度升高, TPL-PEP體系中熒光猝滅常數(shù)Ksv數(shù)值減小, 進(jìn)一步證明TPL是通過(guò)靜態(tài)猝滅方式減弱PEP的熒光強(qiáng)度[4]。

表1 Stern-Volmer線性方程和相關(guān)系數(shù)

圖2 三個(gè)溫度下TPL-PEP的熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

2.2 TPL與PEP的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

由于TPL是通過(guò)靜態(tài)猝滅的形式猝滅PEP的熒光, 可通過(guò)運(yùn)算靜態(tài)猝滅雙對(duì)數(shù)公式[5]得到TPL與PEP的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與結(jié)合常數(shù)。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中,KA是TPL與PEP的結(jié)合常數(shù),n是TPL與PEP的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。 以lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo), lg[Q]為橫坐標(biāo)作圖(見(jiàn)圖3), 對(duì)所得直線進(jìn)行擬合, 得到的斜率與截距分別為TPL與PEP的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù), 見(jiàn)表1。 由表1可知, 在298 K時(shí)TPL-PEP體系的結(jié)合常數(shù)KA=3.627×104L·mol-1; 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.051。 在303 K時(shí),KA=2.220×104L·mol-1;n=1.044。 在308 K時(shí),KA=1.321×104L·mol-1;n=1.300, 結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級(jí)都在104, 說(shuō)明TPL與PEP形成的復(fù)合物較穩(wěn)定; 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)都接近1, 說(shuō)明結(jié)合產(chǎn)生的復(fù)合物為1∶1型。KA(298 K)>KA(303 K)>KA(308K), TPL-PEP體系結(jié)合常數(shù)KA與溫度負(fù)相關(guān), 與猝滅常數(shù)Ksv的規(guī)律一致, 進(jìn)一步證明TPL通過(guò)靜態(tài)猝滅方式減弱PEP的熒光強(qiáng)度。

圖3 三個(gè)溫度下lg[(F0-F)/F]-lg[Q]圖

2.3 TPL與PEP的結(jié)合距離

根據(jù)F?rster’s偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論, 能量供體PEP與能量受體TPL之間的最大結(jié)合距離小于7 nm, 并且PEP的熒光發(fā)射光譜與TPL的紫外吸收光譜有重疊部分時(shí), PEP分子與TPL分子必然會(huì)產(chǎn)生非輻射能量轉(zhuǎn)移, 從而使TPL猝滅了PEP的熒光。

(3)

(4)

(5)

式(3)—式(5)中,r為PEP與TPL的結(jié)合距離;R0為能量轉(zhuǎn)移效率E為50%時(shí)的臨界距離;k2為空間取向因子, 取供能體與受能體各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值2/3;φ為PEP的熒光量子產(chǎn)率一般取蛋白質(zhì)中色氨酸量子產(chǎn)率的0.15[6];n為介質(zhì)折射指數(shù), 通常取有機(jī)物和水的平均值1.36;J為PEP的熒光光譜和TPL的紫外光譜的重疊積分;FD(λ)為PEP在把波長(zhǎng)為λ時(shí)的熒光強(qiáng)度;εA(λ)為TPL在波長(zhǎng)為λ時(shí)的摩爾吸收系數(shù)。

圖4為PEP和TPL在濃度比為1∶1時(shí)298 K下PEP的熒光曲線與TPL的紫外吸收曲線重疊圖, 由式(3)—式(5)求得PEP與YPL重疊積分J=2.144×10-13cm3·(mol·L-1)-1,E=45.54%,R0=4.203 nm,r=4.330 nm。 0.5R0

圖4 PEP的熒光光譜(a)與TPL的紫外吸收光譜(b)重疊圖

2.4 TPL與PEP相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和主要作用力

TPL與PEP結(jié)合反應(yīng)的作用力可以通過(guò)Ross理論[7]判斷： 當(dāng)ΔH>0, ΔS>0時(shí), 作用力為疏水作用力; ΔH<0, ΔS<0時(shí)作用力為氫鍵與范德華力; ΔH<0, ΔS>0時(shí), 作用力為靜電作用力。

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(6)

lnK=-ΔH/RT+ΔS/R

(7)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKA

(8)

式(6)—式(8)中,K為TPL與PEP的結(jié)合常數(shù); ΔH為TPL與PEP的焓變; ΔS為TPL與PEP的熵變; ΔG為TPL與PEP的吉布斯自由能;T為TPL與PEP反應(yīng)溫度;R為氣體常數(shù), 取8.314 J·(mol·K)-1。 根據(jù)Van’t Hoff公式, 可以計(jì)算出298、 303和308 K下的熱力學(xué)參數(shù)。 焓變?chǔ)=-81.59 kJ·mol-1, 熵變?chǔ)=-186 J·(mol·K)-1, 吉布斯自由能ΔG=-26.17 kJ·mol-1(298 K)、 ΔG=-25.24 kJ·mol-1(303 K)、 ΔG=-24.31 kJ·mol-1(308 K)。 可知ΔH<0, ΔS<0, 可推測(cè)TPL和PEP主要的作用力為氫鍵和范德華力, ΔG<0說(shuō)明TPL和PEP的靜態(tài)猝滅為自發(fā)、 放熱(ΔH<0)的過(guò)程。

2.5 TPL與PEP的分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接技術(shù)可使蛋白質(zhì)受體與藥物配體間快速對(duì)接并研究?jī)烧咧g的相互作用力。 采用分子對(duì)接模擬技術(shù)探究TPL配體與PEP受體的作用力類型、 作用距離以及對(duì)接模式, 通過(guò)網(wǎng)頁(yè)程序Z-DOCK3.0.2模擬出TPL與PEP的分子對(duì)接模擬圖, 在運(yùn)用Discovery Studio 2016 Client軟件分析出兩者結(jié)合的相關(guān)數(shù)據(jù)。 見(jiàn)圖5(a)、 (b)和(c)。

圖5 TPL和PEP結(jié)合的分子對(duì)接結(jié)構(gòu)模型圖

由圖5(a)、 (b)可知, PEP的三維結(jié)構(gòu)呈心形, TPL分子位于PEP的表面活性口袋中, 為了更加簡(jiǎn)單、 清晰地觀察到TPL與PEP的結(jié)合部位所處的微環(huán)境, 作出TPL周圍氨基酸殘基2D/3D示意圖, 見(jiàn)圖5(c)。 由圖5(c)可知TPL周圍氨基酸殘基有GLU13、 VAL30、 TRP39、 TYR75、 GLY76、 THR77、 GLY78、 PHE111、 LEU112、 PHE117、 ILE120、 GLY217。 TPL與其中的氨基酸殘基THR77、 GLY217形成氫鍵(Conventional hydrogen bond), 鍵長(zhǎng)為4.58和4.51 ?, 與氨基酸殘基GLY217形成碳?xì)滏I(Carbon hydrogen bond); 與氨基酸殘基GLU13、 VAL30、 TRP39、 GLY76、 GLY78、 PHE117之間的作用力為范德華力(Van der Waals); 與氨基酸殘基TYR75、 LEU112、 ILE120、 PHE111之間存在疏水作用力, 鍵長(zhǎng)為3.85、 5.98、 5.63和6.22 ?, 以Pi-Alkyl、 Pi-Sigma、 Pi-Pi T-shaped形式存在[8]。 表明TPL與PEP間結(jié)合作用力較多且結(jié)合穩(wěn)定, 兩者之間的作用力主要是氫鍵與范德華力, 進(jìn)一步證明TPL使PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.6 TPL對(duì)PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.6.1 TPL與PEP作用的紫外光譜分析

紫外吸收測(cè)量是探索結(jié)構(gòu)變化和理解復(fù)合物的形成的一種容易操作而可觀的表征, 可以探究藥物小分子對(duì)蛋白質(zhì)大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 本實(shí)驗(yàn)做了TPL-PEP混合體系的紫外光譜, 見(jiàn)圖6。 由圖6可知, PEP在274 nm附近有最大吸收峰, 隨著TPL加入且濃度逐漸的增大, PEP吸收峰的峰值明顯增大, 最大吸收波長(zhǎng)從274 nm移動(dòng)至272 nm, 發(fā)生藍(lán)移, 藍(lán)移了2 nm。 表明兩者之間能量躍遷方式為n—π*躍遷, 證明TPL與PEP之間發(fā)生了反應(yīng), TPL影響了PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 假設(shè)TPL通過(guò)動(dòng)態(tài)猝滅的機(jī)制來(lái)猝滅PEP的熒光強(qiáng)度, 那么TPL不會(huì)改變PEP的吸收光譜, 但是圖6中PEP峰值變化明顯, 進(jìn)一步證明TPL對(duì)PEP猝滅機(jī)制不是動(dòng)態(tài)猝滅, 而是靜態(tài)猝滅[9]。

圖6 TPL與PEP相互作用的紫外光譜圖

2.6.2 TPL與PEP體系同步熒光圖譜分析

同步熒光可以提供蛋白質(zhì)與藥物結(jié)合后發(fā)色團(tuán)附近微環(huán)境的變化情況, 最大發(fā)射波長(zhǎng)的所有變化都對(duì)應(yīng)著發(fā)色團(tuán)附近極性的改變。 通常情況下, Δλ=15 nm和Δλ=60 nm同步熒光光譜能夠分別呈現(xiàn)蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基和色氨酸殘基特征熒光, 可用于研究藥物分子對(duì)PEP微環(huán)境和構(gòu)象的影響。 TPL-PEP體系的同步熒光光譜見(jiàn)圖7(a)、 (b), 由圖7可知, 隨著TPL濃度的升高, PEP的同步熒光峰值有下降趨勢(shì)。 圖7(a)中的發(fā)射峰位置基本不變, 發(fā)射峰的峰型基本不變, 并且TPL對(duì)PEP中酪氨酸的熒光猝滅程度小; 圖7(b)中發(fā)射峰峰型呈現(xiàn)規(guī)律性變化, TPL對(duì)PEP中色氨酸的熒光猝滅程度大, 發(fā)射峰峰位從279.6 nm移動(dòng)到284.8 nm, 紅移了5.2 nm, 猝滅程度大。 表明TPL與PEP間形成了復(fù)合物, PEP構(gòu)象產(chǎn)生改變, 使酪氨酸殘基與色氨酸殘基附近微環(huán)境改變, 極性增大, 親水性增強(qiáng), 疏水性減弱; 色氨酸殘基的熒光猝滅程度強(qiáng)于酪氨酸殘基, 表明TPL與PEP結(jié)合時(shí)主要集中在色氨酸的殘基上。

圖7 TPL-PEP溶液同步熒光光譜圖

2.6.3 TPL與PEP構(gòu)象變化影響的三維熒光光圖譜分析

三維熒光光譜立體圖可以詳細(xì)展現(xiàn)出被測(cè)藥品多肽骨架結(jié)構(gòu)的變化情況, 為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與組分分布變化提供了依據(jù)。 通過(guò)三維熒光光譜法運(yùn)用光譜儀對(duì)PEP加入TPL前后的數(shù)據(jù), 以處理出的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)F為Z軸; 激發(fā)波長(zhǎng)λex為X軸; 發(fā)射波長(zhǎng)λem為Y軸, 作PEP、 TPL-PEP混合體系的三維熒光光譜圖及等高線圖, 見(jiàn)圖8(a)、 (b)。 三維熒光光譜圖有兩類峰, 一種是“駝峰”狀的熒光峰(如PEAK 1、 PEAK 2), 峰1代表了色氨酸殘基與酪氨酸殘基的熒光光譜特征, 峰2代表了肽鏈骨架結(jié)構(gòu), 峰值強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密; 另一種是“山脊”狀的瑞利散射峰： PEAK a(λex=λem)、 PEAK b(2λex=λem)。

圖8 PEP、 TPL-PEP溶液的三維熒光光譜圖及等高線圖

加入TPL后, PEP熒光峰與瑞利散射峰的位置與峰形基本沒(méi)有變化。 由表2可知, 加入TPL前后, PEP的瑞利散射峰PEAK a、 PEAK b的熒光強(qiáng)度減弱趨勢(shì)較明顯。 PEAK 1的熒光強(qiáng)度峰值(λex/λem,F)從(280/341, 408.4)改變到(280/343, 296.4), PEAK 2的熒光強(qiáng)度峰值(λex/λem,F)從(225/340, 396.3)改變到(225/343, 329.7), PEAK 1的最大發(fā)射波長(zhǎng)從341 nm移動(dòng)至343nm, 峰位紅移了2 nm, 說(shuō)明TPL使PEP中的色氨酸殘基與酪氨酸殘基周圍微環(huán)境發(fā)生改變, 極性增大, 親水性增強(qiáng), 疏水性減弱; PEAK 2的最大發(fā)射波長(zhǎng)從340 nm移動(dòng)至343 nm, 峰位紅移了3 nm, 說(shuō)明TPL改變了PEP的肽鏈骨架結(jié)構(gòu)。 通過(guò)以上數(shù)據(jù)及分析結(jié)果可知, TPL與PEP表面結(jié)合后產(chǎn)生解聚反應(yīng), 使蛋白酶的分布更加分散, 蛋白質(zhì)粒徑變小, 從而使PEP熒光強(qiáng)度降低, 進(jìn)一步說(shuō)明TPL對(duì)PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。

表2 三維熒光光譜特征參數(shù)

2.6.4 TPL與PEP作用的圓二色譜圖分析

通過(guò)掃描PEP與TPL-PEP混合體系的圓二色譜可以更加深入地研究TPL對(duì)PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[10-11], 見(jiàn)圖9, 通過(guò)圖9可知, PEP在190 nm附近有一個(gè)負(fù)峰, 這是β-折疊(β-sheet)的特征吸收峰, 這個(gè)負(fù)峰強(qiáng)度的變化可以反映PEP中β-折疊數(shù)量的變化, 將所測(cè)的圓二色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入CDNN軟件可得到PEP與TPL-PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量數(shù)據(jù), 由數(shù)據(jù)可知PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊, 隨著TPL的加入且當(dāng)PEP與TPL的濃度比為1∶3時(shí), PEP中β-折疊的占比從50.2%下降至48.8%; α-螺旋(α-Helix)結(jié)構(gòu)的占比從8.1%上升到8.4%; β-轉(zhuǎn)角(β-turn)的占比從18.3%上升到18.7%; 無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)的占比從29.1%上升到29.2%。 上述數(shù)據(jù)表明TPL在與PEP反應(yīng)的過(guò)程中改變了PEP周圍的環(huán)境造成了PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)改變。

圖9 TPL與PEP作用的圓二色譜圖

3.6.5 TPL與PEP作用的傅里葉紅外光譜分析

圖10 TPL與PEP的紅外光譜圖

3 結(jié) 論

在模擬生理?xiàng)l件時(shí), 298、 303和308 K三種溫度下TPL對(duì)PEP具有熒光猝滅作用, 形式為靜態(tài)猝滅。 根據(jù)F?rster’s偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論得知結(jié)合距離r=4.330 nm<7 nm, 表明PEP與TPL間會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。 分子對(duì)接模擬表明TPL分子位于PEP的表面活性口袋中, 兩者之間結(jié)合作用力較多且結(jié)合穩(wěn)定, 作用力主要是氫鍵與范德華力, 進(jìn)一步證明TPL使PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 三維熒光光譜、 同步熒光圖譜、 紫外吸收光譜、 圓二色譜、 紅外光譜表明TPL使PEP中的色氨酸殘基周圍微環(huán)境發(fā)生改變, 極性增大, 親水性增強(qiáng), 疏水性減弱, 說(shuō)明TPL對(duì)PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。