抑制長鏈非編碼RNA MALAT1對糖脂毒性誘導的內(nèi)皮細胞功能障礙的影響及可能機制

張志揚 劉芬 張雪鶴 房彬彬 張冀鑫 謝騫 楊毅寧 李曉梅

目的：探討糖脂毒性環(huán)境中抑制長鏈非編碼RNA（lnc RNA）人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）的表達水平對人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能影響的分子機制。

方法：用葡萄糖和棕櫚酸處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞，建立體外糖脂毒性內(nèi)皮細胞模型，并分為對照組、高糖高脂組、高糖高脂對照組以及小干擾RNA（si-RNA）干預的高糖高脂+si-MALAT1 組、高糖高脂+si-絲裂原活化蛋白激酶1（si-MAPK1）組。應用實時熒光定量PCR 檢測MALAT1、MAPK1 的mRNA 表達水平；蛋白免疫印跡法檢測自噬、線粒體融合分裂、凋亡、通路相關蛋白的表達水平；免疫熒光共聚焦定位檢測自噬及溶酶體相關蛋白的熒光共定位情況；透射電鏡觀察內(nèi)皮細胞中自噬溶酶體的數(shù)目；線粒體探針染色檢測線粒體形態(tài)；免疫熒光檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生；流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡；細胞增殖及劃痕實驗檢測不同時間點各組細胞的增殖及遷移能力；血管形成試驗檢測各組細胞中新生血管數(shù)量。

結(jié)果：與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組的MALAT1 mRNA、磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶1（p-MAPK1）的表達水平增加，磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表達水平下降，P 均<0.05。與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈3（LC3）、螯合體1（p62）、ROS、剪切后活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3）、BCL-2 相關X 蛋白（BAX）、p-MAPK1 的表達水平均下降，線粒體融合蛋白視神經(jīng)萎縮蛋白1（OPA1）、BCL-2、p-mTOR 的表達水平均增加，P 均<0.05；LC3 和溶酶體相關膜蛋白2（LAMP2）蛋白的熒光共定位陽性顆粒增加（P 均<0.01），溶酶體數(shù)目減少；細胞增殖、遷移、成管能力均增加（P均<0.01）。與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MAPK1 組內(nèi)皮細胞中p-MAPK1 的表達下降，p-mTOR 的表達上升（P均<0.01）。

結(jié)論：抑制MALAT1 表達，可降低糖脂毒性環(huán)境中線粒體的自噬水平，減少內(nèi)皮細胞的凋亡及改善內(nèi)皮細胞的功能，可能與調(diào)節(jié)MAPK1/mTOR 信號通路有關。

心血管疾病（CVD）是導致人群死亡和殘疾的主要原因[1]。高血糖、高血脂是動脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動因素[2]。高血糖會導致內(nèi)皮細胞凋亡和自噬[3]，抑制高血糖誘導的內(nèi)皮細胞自噬對內(nèi)皮細胞具有保護作用[4]。血脂過高可引起低密度脂蛋白在內(nèi)皮細胞下積聚，逐漸堆積成斑塊導致AS[5]?！疤侵拘浴钡母拍钭钤缡窃谝认佴?細胞損傷中提出[6]，目前研究發(fā)現(xiàn)，糖脂毒性可影響內(nèi)皮細胞功能，加速AS 的進程[7-8]。

長鏈非編碼RNA（lnc RNA）是長度至少為200 bp，具有高度保守序列的非蛋白質(zhì)編碼RNA，其可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能，影響AS 的進展[8]。人類肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）是一種保守的lnc RNA，在內(nèi)皮細胞中高度表達，與內(nèi)皮細胞的增殖和血管生成等功能密切相關[9]。然而，糖脂毒性環(huán)境中MALAT1 對內(nèi)皮細胞功能影響的具體機制很少研究。鑒于此，本研究探究了糖脂毒性環(huán)境中MALAT1 對內(nèi)皮功能的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）購于深圳豪地華拓生物科技有限公司；澳洲胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；活性氧（ROS）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；CCK8 試劑盒購于北京博奧森生物科技有限公司；E 偶聯(lián)膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）凋亡檢測試劑盒購于美國BD 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購于美國Thermo 公司；微管相關蛋白 1A/1B-輕鏈3（LC3）、螯合體1（p62）、芐氯素1（Beclin1）一抗購于武漢三鷹生物技術有限公司；BCL-2 相關X蛋白（BAX）、BCL-2 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）、線粒體融合蛋白視神經(jīng)萎縮蛋白1（OPA1）、動力相關蛋白（Drp1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、磷酸化MAPK1（p-MAPK1）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購于美國Cell Signaling Technology 公司。羊抗兔/羊抗鼠 IgG-HRP 二抗購于北京博奧森生物科技有限公司。

1.2 方法

細胞培養(yǎng)、細胞模型制作及分組：HUVEC 培養(yǎng)在含有5%胎牛血清、1%抗生素的DMEM 完全培養(yǎng)基中，每隔2 天換液1 次，在細胞密度達95%左右時，按照1:2 的比例進行細胞傳代處理。在細胞密度達80%左右時加入終濃度為30 mmol/L 葡萄糖、500 μmol/L 棕櫚酸培養(yǎng)24 h，制備體外高糖高脂處理細胞模型；在細胞密度達70%左右時提前給予小干擾RNA（si-RNA）處理，6 h 后更換為含抗生素的完全培養(yǎng)基，24 h 后加入高糖高脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h制備高糖高脂si-RNA 干預細胞模型。將不同處理的HUVEC 分為對照組、高糖高脂組、高糖高脂對照組以及經(jīng)si-RNA 干預的高糖高脂+si-MALAT1 組、高糖高脂+si-MAPK1 組。

細胞內(nèi)MALAT1 表達及活性氧（ROS）的測定：用TRIzol 試劑法提取細胞總RNA，測定其濃度和純度；逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA；嚴格按說明書配置逆轉(zhuǎn)錄聚合酶體系；實時熒光定量PCR（RT-qPCR）擴增體系相同[10]，每組3 個副孔。引物序列見表1。ROS 檢測[7]：在24 孔板中進行爬片后，嚴格按ROS試劑盒說明書測定各組ROS 含量并在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

表1 引物序列

自噬蛋白LC3、溶酶體相關膜蛋白2（LAMP2）共聚焦定位[7]：在24 孔板中根據(jù)不同分組進行細胞處理，每組3 個復孔。各組細胞干預結(jié)束后，多聚甲醛固定爬片；室溫封閉；孵育一抗（LC3、LAMP2）；孵育相應種屬熒光標記的熒光二抗，避光孵育，對標本進行染核；封片后在熒光顯微鏡下觀察；隨后進行激光共聚焦熒光檢測。透射電鏡觀察溶酶體數(shù)目[7]：收集細胞，固定保存。離心洗滌后加入1%瓊脂糖溶液，1%鋨酸避光室溫固定，脫水，包埋過夜，聚合，切片，染色過夜后在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

線粒體熒光探針法檢測線粒體動力學功能：在24 孔板中進行爬片計數(shù)，根據(jù)不同分組進行細胞處理，每組3 個復孔。各組細胞干預結(jié)束后，多聚甲醛固定爬片，孵育，染核，封片，然后在熒光顯微鏡/共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像[11]。

流式細胞術檢測細胞凋亡：收集處理后的各組細胞，嚴格按照E 偶聯(lián)Annexin-V 凋亡檢測試劑盒操作，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率[12]。

CCK-8 檢測細胞存活率[12]：將細胞接種到96孔板中，按照上述方法分別處理各組細胞，每組3個復孔；干預結(jié)束后，分別于0、24、48、72 h 進行轉(zhuǎn)染；每孔加入10 μl CCK-8 溶液，37℃孵箱孵育2 h，用紫外分光光度計測各組在540 nm 處的吸光度。

傷口愈合實驗檢測遷移能力[12]：細胞計數(shù)后6孔板鋪板，每組3 個復孔；24 h 后細胞劃痕，按照上述方法分別處理各組細胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于0 、24、48 h 在高倍顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

血管化實驗檢測成管能力[12]：細胞計數(shù)后6 孔板鋪板，每組3 個復孔；處理各組細胞，在血管生成載玻片每個孔中加入10 μl 基質(zhì)膠后放入培養(yǎng)箱中使膠凝固；每孔加入50 μl 細胞懸液；培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后開始觀察，并在適當時間點拍照記錄實驗結(jié)果。

蛋白免疫印跡法檢測自噬、線粒體融合分裂、凋亡、通路相關蛋白的表達水平：各組細胞干預結(jié)束后，使用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。配制蛋白上樣體系；配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠，蛋白上樣20 μg，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，Tris 緩沖鹽溶液+0.1% Tween 20（pH7.4，TBST）溶液洗膜3 遍，5%脫脂牛奶封閉2 h，再次洗膜3遍后，裁剪PVDF膜，分別放置在相應稀釋好的一抗中，4℃孵育過夜，洗膜3 遍后，二抗孵育1 h，漂洗3 遍后，進行電化學發(fā)光法（ECL）顯影。利用Image J 軟件進行灰度分析，以GAPDH 作為內(nèi)參照計算各組蛋白的相對表達量。

統(tǒng)計學方法：所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 22.0 軟件進行。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用SNK 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制MALAT1 表達后糖脂毒性環(huán)境下內(nèi)皮細胞中的線粒體自噬情況（圖1）

圖1 抑制MALAT1 表達后糖脂毒性環(huán)境下內(nèi)皮細胞中的線粒體自噬情況（x±s,n=3）

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組MALAT1 mRNA 表達水平升高（P均<0.001）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組MALAT1 mRNA 的表達水平明顯降低（P<0.001），見圖1A。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組自噬激活的特異性標志物LC3、p62 表達增加（P均<0.05），Beclin1 表達下降（P均<0.01），見圖1B。熒光共定位情況結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組中LC3 和LAMP2 蛋白的熒光共定位陽性顆粒增加（P均<0.01）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組中LC3、LAMP2 陽性顆粒減少（P均<0.01），見圖1C。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組內(nèi)皮細胞中溶酶體數(shù)目增加；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組中溶酶體數(shù)目減少，見圖1D。

2.2 抑制MALAT1 表達對糖脂毒性引起的內(nèi)皮細胞氧化應激與線粒體動力學功能障礙的影響（圖2）

ROS 熒光探針檢測與蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖高脂組、高糖高脂對照組ROS、線粒體分裂蛋白Drp1 的表達水平均增加（P均<0.05），細胞內(nèi)線粒體裂變增多，表現(xiàn)為線粒體碎片化，抑制MALAT1 表達后細胞內(nèi)的線粒體裂變減少，融合增多。與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組細胞ROS 表達下降，線粒體融合蛋白OPA1 表達水平增高（P均<0.05）。

2.3 抑制MALAT1對糖脂毒性導致的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡水平的影響（圖3）

與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組中細胞凋亡率，剪切后活化的caspase-3、BAX 表達均增加，BCL-2 表達減少（P均<0.01）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組凋亡率，剪切后活化的caspase-3、BAX 表達均下降，BCL-2表達增加（P均<0.05），見圖3A、3B。

2.4 抑制MALAT1 表達對糖脂毒性導致的人臍靜脈內(nèi)細胞增殖、遷移、成管功能障礙的影響（圖4）

圖4 抑制MALAT1 表達對糖脂毒性導致的人臍靜脈內(nèi)細胞增殖、遷移、成管功能障礙的影響（x±s,n=3）

與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管能力均下降（P均<0.01）；與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組細胞增殖、遷移、成管功能均上升（P均<0.01），見圖4A～C。

2.5 糖脂毒性條件下MALAT1 對內(nèi)皮細胞中MAPK1/mTOR 信號通路相關蛋白的mRNA 及蛋白表達水平的影響（圖5）

圖5 糖脂毒性條件下MALAT1 對內(nèi)皮細胞中MAPK1/mTOR 信號通路相關蛋白的mRNA 及蛋白表達水平的影響（x±s,n=3）

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖高脂組、高糖高脂對照組內(nèi)皮細胞中MAPK1 mRNA 表達水平升高（P<0.001），見圖5A；蛋白免疫印跡法顯示，與高糖高脂對照組相比，高糖高脂+si-MALAT1 組p-MAPK1 表達水平降低（P<0.05），p-mTOR 表達水平上升（P<0.01），見圖5B；高糖高脂+si-MAPK1 組p-MAPK1 表達水平降低（P<0.01），p-mTOR 的表達水平升高（P<0.01），見圖5C。

3 討論

AS 是一種慢性炎癥疾病，其主要特征是斑塊的形成。斑塊表面由內(nèi)皮細胞、纖維細胞等組成的“纖維帽”成分覆蓋，內(nèi)部含有脂質(zhì)和（或）壞死核心[13]。內(nèi)皮細胞的自噬、凋亡和損傷均會導致內(nèi)皮屏障減弱、脂質(zhì)積累和粘附蛋白積累，這些都是AS的早期事件。因此，內(nèi)皮細胞功能受損在AS 的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[14]。

自噬可利用溶酶體自我消化降解那些功能受損的細胞器和蛋白質(zhì)[15]，為細胞生存提供能量代謝前體并維持細胞穩(wěn)態(tài)，因此自噬的啟動與溶酶體活性的變化密切相關[16]。細胞氧化應激時會積累受損或有毒的蛋白質(zhì)和細胞器，從而激活自噬以維持細胞穩(wěn)態(tài)[17]。然而，細胞內(nèi)自噬的過度激活會導致自噬流受損，并誘導細胞凋亡[18]和功能受損。

線粒體自噬（mitophagy）是細胞內(nèi)一種重要的選擇性自噬，在細胞受到有害因子刺激后可維持細胞正常的功能狀態(tài)，減少內(nèi)皮細胞中ROS 的產(chǎn)生，從而緩解AS 的進展[19]。據(jù)報道，線粒體自噬的活化是在ROS 生成增加的條件下被激活的[20]，這說明ROS 的增加不僅能誘導線粒體自噬的活化，且線粒體自噬活性被上調(diào)的程度與ROS 含量呈正相關[21]。且有研究表明，線粒體動力學可調(diào)節(jié)線粒體自噬[22]。本研究結(jié)果顯示，在高糖高脂環(huán)境下，內(nèi)皮細胞中ROS 含量增加，線粒體動力學功能障礙，自噬相關蛋白Beclin1、p62、LC3 表達結(jié)果，免疫熒光線粒體自噬特異性蛋白LC3、LAMP2 共聚焦結(jié)果、透射電鏡采集內(nèi)皮細胞中溶酶體數(shù)目結(jié)果均顯示內(nèi)皮細胞自噬被激活。其中作為自噬的底物，p62 被運送到溶酶體進行降解，而暴露于糖脂毒性后p62 的表達增加可能與自噬體的不連續(xù)更新有關[23]。所有這些證據(jù)表明，干預內(nèi)皮細胞自噬是治療冠心病的一種有前途的新策略。

研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1 在冠心病血液樣品中的表達顯著上調(diào)[24]。這表明，MALAT1 可能作為AS 的潛在生物標志物，加速了冠心病進展[25]。MAPK1也稱為ERK2、p42MAPK，在細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育中起著至關重要的作用[26]。據(jù)報道，MAPK1 與MALAT1 的表達正相關[27]，MALATI 可以激活MAPK1 信號通路[28]。本研究RT-qPCR 的結(jié)果顯示，MALAT1 和MAPK1 在高糖高脂環(huán)境下的內(nèi)皮細胞中表達顯著上調(diào)，在給予si-MALAT1 后MAPK1 的表達下降，與上述研究結(jié)果相符。

mTOR 作為在自噬中發(fā)揮作用的關鍵調(diào)節(jié)因子，被抑制后可激活自噬[29]。研究顯示，在冠心病中mTOR 信號通路被激活[24]，其調(diào)節(jié)自噬的過程中受MAPK 的調(diào)節(jié)[30]。因此，研究MAPK1/mTOR 信號通路調(diào)控自噬對AS 治療具有重要意義。本研究蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，內(nèi)皮細胞中MAPK1 表達顯著增高，mTOR 表達顯著下降，與上述研究結(jié)果相符。

為了確定MALAT1 是否可以激活mTOR 信號，首先通過RT-qPCR 在不同分組中檢測MALAT1 和MAPK1 的表達水平，發(fā)現(xiàn)MALAT1 和MAPK1 的表達在高糖高脂環(huán)境下的內(nèi)皮細胞中高表達且呈正相關，再通過蛋白質(zhì)免疫印跡在不同條件下檢測上游調(diào)節(jié)劑MAPK1（ERK1/2），發(fā)現(xiàn)MALAT1/MAPK1影響mTOR 信號傳導以介導細胞自噬，并進一步影響冠心病進展。結(jié)果表明，MALAT1 通過調(diào)節(jié)MAPK1 觸發(fā)mTOR 信號通路。

本研究發(fā)現(xiàn)當高糖高脂刺激HUVEC 時，內(nèi)皮細胞中MALAT1表達升高激活內(nèi)皮細胞線粒體自噬，導致內(nèi)皮細胞凋亡與細胞功能障礙，加速AS 進程。在給予si-MALAT1 干擾后，MAPK1 表達下降及mTOR 表達上升，內(nèi)皮細胞功能得到改善。

綜上所述，本研究認為糖脂毒性環(huán)境下lncRNA MALAT1 誘導內(nèi)皮細胞線粒體自噬，內(nèi)皮細胞凋亡與功能障礙，可能與調(diào)節(jié)MAPK1/mTOR 信號通路有關。抑制MALAT1 表達后，可改善內(nèi)皮細胞功能，為臨床上進一步治療AS 提供了新思路。然而，本研究有局限性，未設計動物實驗進行驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突