大豆GmHSF21 基因的生物信息學(xué)分析*

宋勇澤，劉汝翠，朱永勝，李 月，姜 妍，佟曉紅，王紹東**，王 遂

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.克東禹王大豆蛋白食品有限公司，黑龍江 克東 164800；3.黑龍江九陽豆業(yè)有限公司，黑龍江 大慶 166200；4.杭州九陽豆業(yè)有限公司，杭州 310018）

大豆在我國種植歷史悠久，富含豐富的蛋白質(zhì)和油脂，在國民生產(chǎn)中占有重要地位[1-2]?！皵U(kuò)大豆，提產(chǎn)能”是當(dāng)前我國大豆生產(chǎn)的重要任務(wù)。目前，受種植結(jié)構(gòu)調(diào)整及耕地資源限制等因素影響，亟需擴(kuò)大大豆適用耕地資源。我國鹽漬土地面積較大，其總面積約為99.13 萬km2，其中涵蓋了作為我國糧食主產(chǎn)區(qū)的黃淮海平原和東北松嫩平原[3-4]。因此，提升大豆耐鹽堿性可作為增加大豆產(chǎn)量和耕地面積的重要手段之一，篩選耐鹽堿大豆品種是提高鹽堿地利用率的重要途徑。

植物中共有64 種轉(zhuǎn)錄因子，其廣泛參與植物的細(xì)胞、分子、生理生化等不同調(diào)節(jié)機(jī)制，通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平抵御脅迫帶來的傷害[5-6]。熱激轉(zhuǎn)錄因子作為植物中研究廣泛的轉(zhuǎn)錄因子之一，根據(jù)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異可分為A、B、C 三類[7]。其中僅有A 類HSFs 成員C 末端包含具有轉(zhuǎn)錄激活功能的AHA 基序。目前，對植物熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在A 類，對B 類和C 類的研究相對較少[8]。A 類熱激轉(zhuǎn)錄因子是參與熱脅迫響應(yīng)的重要調(diào)控因子，其通過調(diào)控?zé)峒さ鞍祝℉eat shock protein，HSPs）基因的表達(dá)參與植物熱脅迫響應(yīng)[9-10]，在細(xì)胞中發(fā)揮重要保護(hù)作用，可維持蛋白質(zhì)的正確折疊和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，減輕由脅迫對細(xì)胞產(chǎn)生的損害。此外，A 類熱激轉(zhuǎn)錄因子還參與干旱及鹽等非生物脅迫[11-12]。

A 類熱激轉(zhuǎn)錄因子對防治生物脅迫和非生物脅迫具有重要意義。云柳等[13]發(fā)現(xiàn)將小麥HSFB4 基因轉(zhuǎn)至擬南芥中可負(fù)向調(diào)控?cái)M南芥抗鹽性和耐旱性；李天豪等[14]人發(fā)現(xiàn)將桃A 類HSF 轉(zhuǎn)錄因子PpHSF18 過表達(dá)可減小其分枝角度。水稻中的OsHSFC1b 在對滲透脅迫響應(yīng)及ABA 介導(dǎo)的耐鹽性中發(fā)揮重要作用[15]。OsHSFC2a 的CRISPR/Cas9敲除突變后不僅可使種子在低溫條件下萌發(fā)加速，還可上調(diào)COLD1 等耐冷基因的表達(dá)[16]。LI 等[17]發(fā)現(xiàn)在高溫條件下番茄SlHSFA3 基因表達(dá)水平顯著提高，該基因過表達(dá)可顯著增強(qiáng)植株對高溫的耐受性。

大豆屬中低度耐鹽作物，因此篩選耐鹽基因?qū)Υ蠖巩a(chǎn)量和品質(zhì)提升及保證大豆在逆境脅迫條件時(shí)降低產(chǎn)量損失具有重要意義[18]。本文以大豆品種中黃13 前期鹽脅迫處理下的轉(zhuǎn)錄組差異基因數(shù)據(jù)為研究對象，對HSF 基因家族中的候選基因GmHSF21 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為深入探究大豆GmHSF21 在鹽脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

中黃13[19]由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚中采用盆栽法對三葉期大豆幼苗進(jìn)行鹽脅迫處理。采用濃度為200 mmol/L 的NaCl 溶液灌根2 次，灌根時(shí)間間隔為48 h。于灌根處理后24 h 取第3 個(gè)三出復(fù)葉，所有葉片取樣后立即采用液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存，用于提取大豆總RNA。

1.1.2 試劑材料

大豆總RNA 提?。篛MEGA 植物RNA 提取試劑盒（BIO-TEK，R6827-01），北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄：PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，RR047A），寶日醫(yī)（北京）生物技術(shù)有限公司；熒光定量分析：SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，QPK-201），東洋紡（上海）生物科技有限公司； 2 × Taq PCR MasterMix II（TIANGEN，KT211-02），天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 其他材料

基因組信息參考中黃13 基因組ZH13.v2 版本（https://ngdc.cncb.ac.cn/soyomics/download）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及多態(tài)性位點(diǎn)分析

通過PlantTFDB 下載大豆HSF 家族全部蛋白質(zhì)序列。利用SOPMA（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，利用Alphafold2（https://alphafold.ebi.ac.uk）預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，采用Pymol（version2.5.5）繪制三級結(jié)構(gòu)圖。

1.2.2 大豆HSF 基因家族結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過MEME（https://meme-suite.org）進(jìn)行HSF家族保守結(jié)構(gòu)域功能基序分析，利用TBtools（version1.120）對其結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.3 大豆HSF 基因家族系統(tǒng)發(fā)育及順式作用元件分析

通過Tair（https://www.arabidopsis.org/）下載擬南芥HSF 家族蛋白質(zhì)序列，通過MEGA（version11）軟件與大豆HSF 家族蛋白質(zhì)序列進(jìn)行ClustalW 多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用TBtools獲取基因上游2 000 bp 序列，通過Plant Care（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，再利用TBtools 對其結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.4 大豆總RNA 提取及cDNA 合成

使用OMEGA 試劑盒提取大豆總RNA，進(jìn)行去除基因組DNA 反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)管分裝10 μL 混合液、10 μL 去除基因組DNA 后的RNA，混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件設(shè)置為37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，隨后放入-20 ℃保存?；旌先芤簽椋? μL RNase Free dH2O、4 μL 5 × PrimeScript Buffer 2（for Real Time）、1 μL RT Primer Mix、1 μL Prime-Script RT Enzyme Mix I。

1.2.5 鹽脅迫差異基因的熒光定量PCR 分析

通過鹽脅迫差異對基因進(jìn)行熒光定量PCR 分析，其中處理1 為對照CK（無任何處理），處理2為經(jīng)鹽脅迫處理24 h。熒光定量PCR 分析使用TOYOBO 試劑盒，混合溶液為：6.4 μL 的ddH2O、10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix、上下游引物各0.8 μL 及2 μL 的cDNA 模板。設(shè)置3 次重復(fù)，擴(kuò)增階段反應(yīng)條件為：95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)60 s，循環(huán)次數(shù)為45 次。引物設(shè)計(jì)使用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Primer-BLAST 功能設(shè)計(jì)引物，并對引物進(jìn)行特異驗(yàn)證。選擇特異性好、退火溫度相近、跨內(nèi)含子的引物。引物及序列信息參數(shù)如表1 所示。

表1 大豆鹽脅迫差異基因熒光定量PCR 引物信息參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

由圖1 可知，大豆GmHSF21 共編碼341 個(gè)氨基酸，其中183 個(gè)氨基酸處于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，16 個(gè)氨基酸處于伸展鏈結(jié)構(gòu)中，18 個(gè)氨基酸處于β-轉(zhuǎn)角中，124 個(gè)氨基酸處于無規(guī)則卷曲中。

圖1 大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.1.2 大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖2（a）所示。圖2（b）為蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)置信圖，當(dāng)預(yù)測結(jié)構(gòu)與真實(shí)結(jié)構(gòu)在殘基y 上對齊時(shí)，位置（x，y）處的顏色表示AlphaFold 2 在殘基x 處的預(yù)期位置誤差。由圖2（b）可知，由大豆GmHSF21基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列長度為40～130 bp，預(yù)測結(jié)構(gòu)可信。

圖2 大豆GmHSF21 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)圖

結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)僅含有1 條多肽鏈時(shí)空間結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。

2.1.3 大豆GmHSF21 基因多態(tài)性位點(diǎn)分析

由圖3 可知，編碼區(qū)共存在4 處多態(tài)性位點(diǎn)，其中2 個(gè)位點(diǎn)位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，另2 個(gè)位點(diǎn)位于無規(guī)則卷曲中。

圖3 大豆GmHSF21 突變體三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

4 處位點(diǎn)分別位于第25、118、156、326 個(gè)氨基酸處，其中第156 個(gè)氨基酸突變導(dǎo)致氨基酸電荷改變，由帶負(fù)電荷的天冬氨酸突變?yōu)椴粠щ姾傻母拾彼帷?/p>

2.2 大豆HSF 基因家族結(jié)構(gòu)域預(yù)測

由圖4 可知，HSF 基因家族成員均具有保守基序HSF 和HSF DNA-binding，且大部分含有UPF0242 和BRE1 超家族基序，表明該基因家族蛋白具有相似結(jié)構(gòu)域，其基因可能具有相似功能。

圖4 大豆HSF 基因家族結(jié)構(gòu)域分析

2.3 大豆HSF 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖5 可知，AT3G22830 與GmHSF21 親緣關(guān)系近。研究顯示，AT3G22830 屬HSF 基因家族中的A 亞族，且已被證實(shí)AT3G22830 基因參與抗病反應(yīng)，在抵抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[20]。結(jié)果表明，大豆GmHSF21 為HSF 基因家族中的A 亞族，推測其可能與AT3G22830 行使相同功能，在非生物脅迫中發(fā)揮作用。

圖5 不同物種HSF 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 大豆GmHSF21 啟動(dòng)子順式作用原件分析

由圖6 可知，大豆GmHSF21 的啟動(dòng)子順式作用元件包含光響應(yīng)元件、脫落酸元件、防御及應(yīng)激響應(yīng)元件等，多與脅迫相關(guān)。結(jié)果表明，GmHSF21 參與多種脅迫響應(yīng)，在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖6 大豆GmHSF21 啟動(dòng)子順式作用原件分析

2.5 大豆GmHSF21 基因表達(dá)量分析

由圖7 可知，鹽脅迫條件下大豆GmHSF21 基因的表達(dá)量上調(diào)。結(jié)果表明，該基因參與鹽脅迫調(diào)控。

圖7 大豆GmHSF21 鹽脅迫后基因表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

本研究通過對大豆GmHSF21 的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因共編碼341 個(gè)氨基酸，其編碼區(qū)存在4 處多態(tài)性位點(diǎn)，具有保守的HSF 和HSF DNA-binding 基序。其中第156 個(gè)氨基酸處的多態(tài)性位點(diǎn)位于HSF DNA-binding 結(jié)構(gòu)域中，該處氨基酸由天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔渲懈拾彼釣榉菢O性疏水性氨基酸，天冬氨酸為酸性氨基酸，二者理化性質(zhì)不同。α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，已有研究表明脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸及天門冬酰胺不利于α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本研究中第156 個(gè)氨基酸處的多態(tài)性位點(diǎn)處于α-螺旋結(jié)構(gòu)中，且突變后對應(yīng)的氨基酸為甘氨酸，因此推測該突變可能會造成α-螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，其是否會對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明AT3G22830 與GmHSF21親緣關(guān)系近，符合HSF 基因家族中A 亞族的一般特征，推測其可能與AT3G22830 行使相同功能，在非生物脅迫中發(fā)揮作用。順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子順式作用元件包含光響應(yīng)元件、脫落酸元件、防御及應(yīng)激響應(yīng)元件等，多與脅迫相關(guān)，表明大豆GmHSF21 基因可能參與植物脅迫應(yīng)答。當(dāng)前部分HSF 基因家族成員已被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)植株對鹽脅迫的響應(yīng)，但目前關(guān)于上述研究結(jié)果還存在一定爭議。一方面，研究發(fā)現(xiàn)某些植物中增加熱激蛋白的表達(dá)可增強(qiáng)植物對鹽堿脅迫的耐受性。這是因?yàn)闊峒さ鞍卓蓞f(xié)助維持蛋白質(zhì)的正確折疊，避免蛋白質(zhì)在脅迫條件下聚集和失活，從而維持細(xì)胞正常功能[21]。另一方面，熱激蛋白過表達(dá)可能影響植物生長發(fā)育。SUN 等[22]發(fā)現(xiàn)匍匐剪股穎發(fā)芽期和生長期對高鹽和外源脫落酸的超敏性和AsHSP17 基因的過表達(dá)相關(guān)。這可能與蛋白質(zhì)折疊和調(diào)節(jié)的平衡有關(guān)，過多熱激蛋白可能干擾其他蛋白質(zhì)的正常功能。

HSF 基因家族作為近年來的研究熱點(diǎn)，已被證實(shí)可響應(yīng)除熱脅迫外的其他非生物脅迫。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大豆共有52 個(gè)HSF 基因家族成員，在不同脅迫條件下，每個(gè)基因的表達(dá)水平相差較大[23]。鹽脅迫條件下，GmHSF12 已被證實(shí)在24 h 內(nèi)表達(dá)量顯著上調(diào)。低溫脅迫條件下，GmHSF12 和GmHSF28 基因表達(dá)量稍上調(diào)，GmHSF35 顯著上調(diào)[23]。LI 等[24]研究發(fā)現(xiàn)GmHSF34 基因轉(zhuǎn)入擬南芥后使其對高溫和干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)。此外，GmHSFB2b 可促進(jìn)黃酮類化合物合成，降低體內(nèi)ROS 積累，提高大豆耐鹽性[25]。鹽脅迫差異基因熒光定量PCR 分析表明，鹽脅迫條件下大豆GmHSF21基因表達(dá)量上調(diào)，表明該基因參與鹽脅迫調(diào)控。

本研究為進(jìn)一步研究大豆GmHSF21 基因功能奠定了基礎(chǔ)。今后將對該基因在不同部位、不同時(shí)期的表達(dá)及HSF 基因家族在大豆鹽脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行研究，并通過構(gòu)建該基因過表達(dá)載體在擬南芥和大豆中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)對該基因功能的深入系統(tǒng)鑒定。