蛋雞禽致病性大腸桿菌分離鑒定及噬菌體制劑體外殺菌研究

劉 亮

江蘇省南通市如東縣栟茶畜牧獸醫(yī)站,江蘇 南通 226406

0 引言

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染引起的一類疾病的總稱,由于感染時(shí)間、免疫力、感染途徑以及菌株毒力的差異,引起的臨床癥狀也有所不同[1-2]。急性發(fā)病者以病程十分短、體溫急劇升高和突然死亡為主要特征;慢性發(fā)病者以精神萎靡、劇烈腹瀉、轉(zhuǎn)圈運(yùn)動等癥狀為主要特征;成年雞感染后可見關(guān)節(jié)滑膜炎、輸卵管炎和腹膜炎等癥狀。病理變化表現(xiàn)不一,多表現(xiàn)為肝周炎、氣囊炎,心包炎等。該病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性,多以春季、夏季等溫度偏高季節(jié)多發(fā)[3]。該病常與其他疾病并發(fā)或繼發(fā)感染而使死亡率升高,給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大損失[4-5]。

抗生素常用于治療大腸桿菌等細(xì)菌感染性疾病,但在獸醫(yī)臨床應(yīng)用過程中存在用藥劑量過大、不遵守休藥期、盲目用藥等諸多問題,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥譜越來越廣,多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,此外,另外致病性大腸桿菌感染動物體內(nèi)可形成生物被膜也會影響抗生素等藥物的治療效果[6]。因此亟須研發(fā)抗生素替代品來防控細(xì)菌性疾病。噬菌體是一種可侵染細(xì)菌的病毒,在自然界中廣泛存在,可以靶向感染宿主菌導(dǎo)致崩解,且不影響其他正常菌群功能的發(fā)揮。目前有較多噬菌體產(chǎn)品已成功用于細(xì)菌性疾病治療和防控,隨著抗生素耐藥性日益嚴(yán)重,噬菌體將進(jìn)一步替代抗生素在臨床上的應(yīng)用[7-8]。本研究于2021年3月—2023年5月采集某蛋雞養(yǎng)殖場疑似禽致病性大腸桿菌感染的病料,進(jìn)行病原的分離鑒定、生物學(xué)特性分析和藥物敏感試驗(yàn)等操作,進(jìn)而選擇其中代表性菌株開展噬菌體制劑體外殺菌試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因組DNA/RNA提取試劑盒、2×ES Taq Master Mix、DNA Marker和DNA凝膠回收劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;PrimeScript RT Master Mix購自寶生物工程有限公司;革蘭氏染色液(結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、復(fù)紅(沙黃)、蒸餾水等)、藥敏紙片和生化發(fā)酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司;GelRed染劑購自Biotium公司;麥康凱瓊脂和伊紅美蘭培養(yǎng)基購自青島海博生物公司;病料為某蛋雞養(yǎng)殖場的發(fā)病雞和病死雞,采取心臟、肝臟,脾臟和腎臟等組織用于細(xì)菌的分離鑒定。復(fù)合噬菌體制劑為A公司市售產(chǎn)品。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢

用一次性接種環(huán)無菌蘸取組織病料內(nèi)部組織液劃線接種于伊紅美蘭平板上,于37 ℃下倒置培養(yǎng)18～20 h。觀察是否生長出帶有金屬光澤的藍(lán)黑色、中等大小的菌落。觀察菌落形態(tài)特征,挑取疑似菌落進(jìn)行染色鏡檢。按照革蘭氏染色的常規(guī)步驟進(jìn)行染色后,油鏡觀察染色情況和細(xì)菌形態(tài)。

1.3 細(xì)菌的生化鑒定

對所有分離株進(jìn)行常規(guī)生化指標(biāo)進(jìn)行接種測定,于37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。若細(xì)菌能分解某一發(fā)酵管內(nèi)的糖,則此種糖類能產(chǎn)生酸,指示劑呈酸性變化,發(fā)酵管中顏色發(fā)生改變;若不分解此糖類,則無顏色變化;產(chǎn)氣者于倒置的小管內(nèi)出現(xiàn)氣泡。

1.4 細(xì)菌的PCR鑒定

挑取上述帶有金屬光澤的藍(lán)黑色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,于37℃下培養(yǎng)12 h以備用。菌液按DNA提取試劑盒說明書提取DNA進(jìn)行PCR鑒定。擴(kuò)增引物為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度約500 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL、 ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;共進(jìn)行35次循環(huán);最后,72 ℃再延伸10 min。最終的PCR產(chǎn)物于4 ℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.5 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)

選取2021年3月—2023年5月獲得的49株細(xì)菌,選用14種抗生素進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),觀察有無抑菌圈的形成,且根據(jù)直徑的大小判定藥物敏感程度。

1.6 噬菌體制劑體外殺菌

將A公司市售產(chǎn)品復(fù)合噬菌體制劑按說明書稀釋至104倍,稀釋后噬菌體濃度大于105,然后選取代表性的5株進(jìn)行體外殺菌試驗(yàn)。配置100 mL液體LB培養(yǎng)基,高壓滅菌,恢復(fù)室溫后按1：100分別轉(zhuǎn)接上述代表性5株大腸桿菌,分裝到7只(第1～7組)10 mL的無菌EP管中。第1～5組(噬菌體制劑組)管分別加入100 μL上述10 000倍稀釋后的菌益;第6組(氟苯尼考對照組)管加入氟苯尼考;第7組(對照組)管不加任何試劑。1～7號管置于37 ℃搖床培養(yǎng),分別在0 min,60 min,120 min,180 min用分光光度計(jì)測量1～9號管內(nèi)液體的光密度(OD),觀察體外殺菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢結(jié)果

蘸取新鮮組織的接種環(huán)在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線,將劃好的平板放入培養(yǎng)箱于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng),18～24 h觀察平板菌落性狀。觀察發(fā)現(xiàn)在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上長出帶有金屬光澤、深紫黑色菌落,檢測結(jié)果初步判定分離菌株為大腸桿菌(見圖1)。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果可見革蘭氏陰性,兩端鈍圓的短桿菌,符合大腸桿菌的形態(tài)特點(diǎn)。

圖1 分離菌株在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的生長情況

2.2 生化特性鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:分離的細(xì)菌能使木糖、蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,甘露醇、乳糖、葡萄糖產(chǎn)氣不產(chǎn)酸,硫化氫、棉子糖、蛋白胨不分解,山梨醇、肌醇、水楊苷產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(見表1),符合大腸桿菌的生化特性。

表1 生化反應(yīng)結(jié)果

2.3 細(xì)菌的PCR檢測結(jié)果

PCR方法擴(kuò)增大腸桿菌目的片段,結(jié)果表明,待檢菌株和陽性樣品能夠擴(kuò)增到預(yù)期大小的片段,為500 bp,而陰性對照未擴(kuò)增出任何片段如圖2所示。將擴(kuò)增的片段送生工生物進(jìn)行測序,表明結(jié)果分離菌株為禽致病性大腸桿菌。根據(jù)病死雞的臨床癥狀、病理變化,通過伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基的培養(yǎng)篩選、生化鑒定以及PCR鑒定等,從152份樣品中共分離到大腸桿菌49株。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2,顯示49株分離菌對環(huán)丙沙星、阿莫西林、頭孢他啶、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、林可霉素等耐藥率分別高達(dá)89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,均超過85%。敏感性最高的是氟苯尼考,為53.0%,其次是慶大霉素,為40.8%。根據(jù)臨床用藥情況結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果,選用氟苯尼考作為噬菌體制劑體外殺菌的陽性對照。

M—DL-2000 Marker;1—待檢樣品;2—陽性對照;3—陰性對照。

表2 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果單位:%

2.5 噬菌體制劑體外殺菌結(jié)果

殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示:第1～3組60 min后OD值均有增加,但第1、2組比第3組增加的慢,可以推測第1組中的噬菌體以及第2組中的氟苯尼考已發(fā)揮了殺菌作用;120 min后,第1組OD值明顯下降至起始濃度以下,表示噬菌體已基本殺死了培養(yǎng)基中全部的大腸桿菌,180 min后的結(jié)果與120 min相同。120 min時(shí)第2組的OD值明顯小于第3組但均大于第1組,說明第2組中的氟苯尼考發(fā)揮了殺菌作用但殺菌作用弱于第1組,180 min后的數(shù)據(jù)結(jié)果與120 min相同,如圖3所示。研究結(jié)果表明噬菌體制劑體外殺菌優(yōu)于氟苯尼考。

1—噬菌體制劑;2—氟苯尼考對照;3—陰性對照

3 討論

本研究累計(jì)分離獲得49株禽致病性大腸桿菌,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,發(fā)病雞場的大腸桿菌對大部分抗菌藥產(chǎn)生耐藥性,表明該雞場大腸桿菌多重耐藥問題已十分嚴(yán)重,這些抗生素在臨床上治療效果不佳,這對防控造成了十分大的阻礙,另外抗生素不規(guī)范使用引起藥物殘留、養(yǎng)殖環(huán)境菌群不平衡等問題,嚴(yán)重威脅人類健康[9]。

針對以上問題,國家相關(guān)部門出臺了一系列限抗禁抗和研發(fā)替抗產(chǎn)品的政策措施,鼓勵高等學(xué)校和科研院所研發(fā)抗生素替代品來防控耐藥菌感染。噬菌體是極具潛力的抗生素替代產(chǎn)品[10-12]。本研究結(jié)果表明噬菌體制劑體外殺菌優(yōu)于氟苯尼考,提示可用于蛋雞禽致病性大腸桿菌病的治療。

4 結(jié)論

通過病料采集、細(xì)菌分離鑒定、生物學(xué)特性分析和藥物敏感試驗(yàn)等,分離獲得49株致病性大腸桿菌,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示臨床上多重耐藥性較為嚴(yán)重。選用A公司市售產(chǎn)品復(fù)合噬菌體制劑進(jìn)行殺菌試驗(yàn),結(jié)果表明其殺菌效果優(yōu)于氟苯尼考。因此,該復(fù)合噬菌體制劑可用于該雞場蛋雞禽致病性大腸桿菌病的治療。