豬δ冠狀病毒重慶流行株的診斷與N基因序列分析

吳學婧,于吉鋒,葉勇剛,肖 璐,毛從劍,曹 冶,康潤敏通信作者

1.四川省畜牧科學研究院,四川 成都 610066 2.動物遺傳育種四川省重點實驗室,四川 成都 610066

0 引言

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)又稱豬丁型冠狀病毒,是一種新型的致病性豬腸道冠狀病毒。PDCoV可引起感染豬發(fā)生水樣腹瀉、嘔吐及脫水[1],可引起腸絨毛萎縮、脫落,腸上皮細胞腫脹和空泡化。其臨床癥狀和病理變化與豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastraenteritis virus,TGEV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus,PoRV)等感染相似[2],在臨床中難以區(qū)分。各年齡段豬均可感染PDCoV,感染豬日齡越小,死亡率越高[3]。由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不全,新生仔豬感染后死亡率最高;育肥豬和母豬也會出現(xiàn)腹瀉等典型的臨床癥狀,但癥狀相對較輕,死亡率較低[2]。

PDCoV屬套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ 冠狀病毒屬,是一種具有囊膜的單股正鏈 RNA 病毒[4]。PDCoV基因組全長約25.4 kb,是已知冠狀病毒中基因組最小的病毒[5]?；蚪M結構為5′端非編碼區(qū)(Untranslated regions,5′UTR)—復制酶多聚蛋白(ORF1a/b)—纖突蛋白(Spike,S)—囊膜蛋白(Envelope protein,E)—膜蛋白(Membrane,M)—非結構蛋白 6(nonstructural protein 6,NS6)—核衣殼蛋白(Nucleocapsid,N)—非結構蛋白7(nonstructural protein 7,NS7)—3′端非編碼區(qū)(3′UTR)[6]。S蛋白是一種跨膜蛋白,在受體識別和與宿主細胞膜的融合中發(fā)揮重要作用,可誘導機體產生中和抗體,由S1和S2亞基組成[7]。N基因編碼的N蛋白是主要的結構蛋白,和病毒核酸結合組成病毒基本結構,具有高度保守性。N蛋白可誘導機體細胞發(fā)生強烈的免疫應答,產生大量的特異性抗N蛋白抗體。E蛋白和M蛋白是跨膜蛋白,參與病毒包膜的形成和釋放[2]。

自2014年初PDCoV引起的仔豬腹瀉在美國暴發(fā)以來,PDCoV已蔓延至全球,加拿大、泰國、越南、中國、韓國、日本等國家均有報道[8-9]。Zhang et al.[10]對2012—2018年中國南方5省腹瀉樣本的檢測發(fā)現(xiàn)PDCoV樣本流行率和環(huán)境檢出率僅次于PEDV,且與致病性豬腸道冠狀病毒(PEDV、TGEV、PoRV等)存在混合感染。近年來,PDCoV已開始在我國廣泛流行,市場上尚無商品化疫苗,給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大影響。此外,PDCoV具有跨物種傳播風險,可感染禽類、牛等其他物種,此前還有報道顯示海地3名兒童感染PDCoV,對人類公共安全存在潛在威脅[11-12]。2023年,重慶市某規(guī)模化養(yǎng)豬場豬群出現(xiàn)腹瀉等癥狀,本研究對該豬場腹瀉病例進行了臨床剖檢及實驗室診斷,確定為PDCoV感染。對該流行毒株核蛋白(N)基因進行了序列分析,以了解該毒株的遺傳進化規(guī)律,進一步掌握我國PDCoV的病原學及流行病學情況,為PDCoV的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

2023年5月,重慶市某規(guī)?；B(yǎng)豬場豬群發(fā)生腹瀉,已接種豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗(WH-1株+AJ1102株)的保育豬、育肥豬均發(fā)生腹瀉,隨后產房母豬及哺乳仔豬腹瀉。腹瀉豬群精神沉郁,排灰黑色水樣稀便,脫水、消瘦,部分感染豬稀便呈噴射狀排出,使用抗生素治療無效。新生仔豬持續(xù)腹瀉3～4 d,出現(xiàn)少量死亡,發(fā)病仔豬約286頭,死亡63頭,死亡率22.03%。成年豬腹瀉后癥狀較輕,通常能自行耐過,未發(fā)生死亡。取腹瀉瀕死仔豬,送四川省畜牧科學研究院動物遺傳育種四川省重點實驗室進行腹瀉相關病原檢測。

1.1.2 主要試劑與儀器

FineMag磁珠法動物病毒DNA/RNA快速提取試劑盒,購自濟凡生物科技(常州)有限公司;M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover反轉錄試劑盒、2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR Mix(with blue dye)均購自北京聚合美生物科技有限公司;GoldView I型核酸染色劑購自北京索萊寶科技有限公司;DNA Maker,購自北京博邁德基因技術有限公司;Biowest瓊脂糖,購自北京百晶生物技術有限公司;pMD19-T載體等,購自寶生物(大連)有限公司;感受態(tài)大腸桿菌 DH5α、膠回收試劑盒,購自天根生化科技北京有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng)

無菌采集腹瀉瀕死仔豬心血、肝臟、脾臟接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察是否有菌落形成,結果未發(fā)現(xiàn)菌落形成。

1.2.2 樣品采集與處理

取腹瀉瀕死仔豬剖檢觀察病理變化,無菌采集仔豬小腸組織,加入無菌PBS研磨,制成1：5重量體積比的組織懸液,-80 ℃反復凍融3～5次,12 000 r/min離心10 min收集上清液,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計與合成

根據(jù)文獻報道[13-14]分別合成擴增PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV基因部分片段的引物。參照GenBank中登錄的PDCoV CHN/Sichuan/2019株(登錄號:MK993519.1)等全基因序列,利用軟件Premier premier 5.0設計擴增PDCoVN基因片段的引物(引物序列見表1),引物均由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表1 鑒定引物序列

1.2.4 病毒RT-PCR檢測

按照FineMag磁珠法動物病毒DNA/RNA快速提取試劑盒說明書提取小腸組織上清液RNA,采用M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板,分別進行PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的RT-PCR擴增,反應體系為:2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR Mix 6.5 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,RNase-free Water補足至20 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性25 s,55 ℃退火25 s,72 ℃延伸10～30 s(延伸速度為10～15 kb/min),35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。反應結束后,PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。

1.2.5 PDCoV的N基因的克隆測序

提取出的cDNA為模板,PDCoV-N-F/R為引物,擴增PDCoVN基因,PCR反應體系同1.2.4。取PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。擴增的PCR產物用膠回收試劑盒純化回收,回收產物測序鑒定。測序正確的膠回收產物連接pMD19-T載體,轉化DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

1.2.6 PDCoVN基因序列分析

利用生物學軟件DNAStar和MEGA11.0將PDCoV流行株N基因序列與GenBank中登錄的30株PDCoV參考毒株N基因序列進行核苷酸序列分析和遺傳進化分析。利用Mega 11.0軟件進行遺傳進化分析,采用鄰接法(neighbor-joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)發(fā)育樹各分枝置信度采用重抽樣法(bootstrap)進行自舉檢驗,檢驗次數(shù)設置為1 000次。參考毒株序列信息見表2。

表2 PEDV參考毒株

續(xù)表

2 結果

2.1 剖檢病變

無菌條件下剖檢腹瀉瀕死仔豬,可見發(fā)病仔豬小腸腸壁變薄、小腸黏膜充血、出血,腸道內充滿氣體和黃色液體,腸道及胃內含有未消化的凝乳塊。病豬的腹股溝淋巴結及腸系膜淋巴結等出現(xiàn)不同程度腫脹(見圖1)。

圖1 小腸黏膜充血

2.2 RT-PCR檢測結果

送檢樣品RT-PCR產物經電泳鑒定,結果顯示PDCoV為陽性,擴增出長度約627 bp的目的條帶,與預期大小相符。PEDV、TGEV、PoRV未擴增出條帶,均為陰性(見圖2)。

2.3 PDCoV N基因的克隆

以腹瀉仔豬小腸組織 cDNA為模板,PDCoV-N-F/R為引物,擴增出約1 348 bp的PCR產物,與預期大小相符(見圖3)。將N基因擴增產物連接轉化構建質粒后測序,結果表明成功擴增出全長1 029 bp的PDCoVN基因,將該PDCoV流行毒株命名為CQ2023。

M—DNA分子量標準(BM5000+); 1—PDCoV N基因PCR產物;2—陰性對照。

2.4 PDCoV 流行株N基因核苷酸同源性分析

采用DNAStar軟件將獲得的PDCoV CQ2023株N基因核苷酸與30株參考毒株N基因核苷酸序列進行同源性分析,結果顯示PDCoV CQ2023株與參考毒株核苷酸相似性為96.7%～99.4%(見圖4),其中與CHN-HeN06-2022株的相似性最高,為99.4%,其次是CHN/Sichuan/2019株,相似性為98.9%;與HKU15-155和HKU15-44的相似性均為98.3%;與美國毒株Michigan/8977/2014、USA/Minnesota159/2014、SDCV/USA/Illinois121/2014的相似性為98.2%、98.3%、98.0%;與韓國KNU16-07株、日本OKN/JPN/2014株的相似性分別為98.2%、98.3%;與東南亞泰國P2_13_ST2_0313/PDCoV/0213/Thailand株和越南VUT-1/2016/Vietnam株的相似性為97.2%、96.7%。

圖4 PDCoV流行株N基因核苷酸序列比對結果

2.5 PDCoV流行株N基因遺傳進化分析

利用MEGA 11軟件中的Clustal W方法將本研究毒株與30株具有代表性的國內外PDCoV參考毒株N基因核苷酸進行序列比對,并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結果顯示,通過PDCoVN基因遺傳進化樹分析,可將PDCoV分為3個相對獨立的群,分別為美國/韓國/日本毒株、中國毒株及東南亞地區(qū)毒株。中國毒株與美國和韓國/日本毒株親緣關系較近,序列相似性較高,可能起源于同一毒株;與東南亞地區(qū)毒株親緣關系較遠,序列相似性最低。在國內毒株中,PDCoV CQ2023與CHN-HeN06-2022株、CHN/Sichuan/2019株同處一個分支,親緣關系最近,與早期國內流行毒株親緣關系相對較遠。

圖5 PDCoV N基因系統(tǒng)進化樹分析

3 討論

冠狀病毒(croronaviruses)可分為α、β、γ及δ4種不同病毒屬,α-冠狀病毒和β-冠狀病毒主要感染哺乳動物,γ-冠狀病毒通常感染鳥類,δ-可同時感染哺乳動物和鳥類。近年來,由于嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)(2003年)、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)(2019年)等的出現(xiàn),人們對冠狀病毒的關注與日俱增[15]。冠狀病毒為單鏈 RNA病毒,可打破物種屏障,具有跨物種傳播風險,對全球養(yǎng)豬業(yè)及相關從業(yè)人員構成威脅。豬腸道冠狀病毒是病毒性腹瀉中最重要的病原,主要包括PEDV、TGEV、PDCoV、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome-coronavirus,SADS-CoV)等[16]。這些病毒具有類似的流行規(guī)律、臨床表現(xiàn)和病理特征,可感染不同年齡的豬,導致腹瀉、嘔吐和脫水,但感染部位和癥狀嚴重程度有所不同[17]。PDCoV作為一種新發(fā)的豬腸道冠狀病毒,對仔豬危害最嚴重,育肥豬和母豬感染后癥狀較輕,常呈隱性感染或與其他病原混合感染[18]。

自2012年首次報道以來,PDCoV已迅速在全球多個國家和地區(qū)流行,毒株的變異可能導致大流行。目前關于PDCoV臨床診斷、流行病學、致病性及疫苗研制的研究較為缺乏,因此持續(xù)開展流行毒株的診斷、致病特性及基因序列分析對于PDCoV的防控和疫苗開發(fā)至關重要。本研究以2023年重慶市某規(guī)?；B(yǎng)豬場腹瀉仔豬為材料,進行了腹瀉病原的實驗室診斷,探究了致病毒株PDCoV的N基因序列特征。

PDCoVN基因在不同PDCoV毒株間高度保守,N基因編碼的N蛋白是構成病毒衣殼的成分,在病毒復制及致病過程中發(fā)揮著多種生物學功能,是研究PDCoV感染、復制以及免疫機制的重要基因[8]。通過比對N基因序列,發(fā)現(xiàn)PDCoV CQ2023株與參考毒株核苷酸相似性為97.0%～99.4%,具有較好的保守性。與CHN-HeN06-2022株的核苷酸相似性最高,親緣關系最近,表明可能具有相同起源,因生豬跨區(qū)域調運及毒株變異等演化為不同毒株。CQ2023株與國內流行毒株處于同一進化分支上,表明CQ2023株為國內流行毒株。有研究顯示PDCoV國內分離毒株在Nsp2和Nsp3區(qū)域與泰國、越南和老撾分離毒株間具有相同的不連續(xù)氨基酸缺失[19],表明毒株進化過程中可能發(fā)生了基因突變和重組。本研究對N基因核苷酸序列的遺傳進化分析發(fā)現(xiàn),不同流行毒株間存在區(qū)域性,國內毒株間親緣關系較近,聚為一群,美國/日本/韓國毒株和東南亞毒株分別聚為一群,不同地區(qū)毒株間的遺傳進化關系還需要進一步論證。N蛋白具有很好的抗原性,已被作為PDCoV早期診斷的重要靶標應用于PDCoV的核酸檢測和免疫學診斷中,對N基因序列的研究可為PDCoV的診斷、體外表達及基因工程疫苗的開發(fā)提供參考資料。

4 結論

本研究以重慶市某規(guī)模化養(yǎng)豬場腹瀉仔豬為材料,對其進行病原檢測,結果顯示為PDCoV感染。擴增該毒株N基因片段,并對其克隆測序,應用生物學軟件對N基因進行序列分析。結果表明該毒株為PDCoV國內流行株,其N基因具有較好的保守性,與近年我國河南、四川等地流行毒株親緣關系較近,以上研究豐富了我國PDCoV流行病學數(shù)據(jù)庫。