一株適用于短程反硝化的細(xì)菌篩選及其脫氮特性

張建美，朱永茂，謝健強(qiáng)，呂鈺楠，梅江雪，蔣興超

（1.長(zhǎng)江大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北武漢 430100；2.長(zhǎng)江大學(xué)油氣地球化學(xué)與環(huán)境湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430100）

近些年來(lái)，隨著人們對(duì)污水處理認(rèn)知的不斷深入以及污水脫氮研究的進(jìn)一步發(fā)展，一些新型脫氮方法不斷出現(xiàn)，厭氧氨氧化（ANAMMOX）是指厭氧氨氧化菌在厭氧條件下，以NH4+-N為電子供體，以NO2--N為電子受體生成N2的過(guò)程，該反應(yīng)具有能耗低、脫氮效果好、剩余污泥少等優(yōu)點(diǎn)，成為污水處理行業(yè)的研究熱點(diǎn)〔1-2〕。一般污水中NO2--N濃度較低，難以維持ANAMMOX的持續(xù)進(jìn)行，如何獲得穩(wěn)定的NO2--N積累是該工藝能否被廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。短 程 硝 化（Partial nitrification，PN）常 被 用 做ANAMMOX的前置工藝〔3-4〕，但該工藝對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)苛，長(zhǎng)期運(yùn)行過(guò)程中難以保證NO2--N的穩(wěn)定積累，使ANAMMOX工藝面臨崩潰風(fēng)險(xiǎn)〔5〕。短程反硝化（Partial denitrification，PD）是指將NO3--N僅還原到NO2--N階段，未進(jìn)一步還原為N2的過(guò)程，因其具有更加穩(wěn)定的NO2--N積累廣受關(guān)注〔6-9〕。

J.S.ALMEIDA等〔10〕認(rèn)為PD的發(fā)生與硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase，Nar）和亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，Nir）對(duì)碳源所提供電子的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)，若Nar在競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，則反硝化過(guò)程中能實(shí)現(xiàn)高的NO2--N積累。前期研究表明，碳源類型、C/N、pH、溫度等環(huán)境因素都會(huì)對(duì)Nar和Nir的活性產(chǎn)生影響，從而引起不同程度的NO2--N積累〔11-14〕。除環(huán)境條件的影響外，反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)對(duì)于NO2--N的積累也至關(guān)重要，自然界中反硝化細(xì)菌種類繁多，一類反硝化細(xì)菌僅能進(jìn)行PD，以NO2--N為最終產(chǎn)物，另一類反硝化細(xì)菌可以同時(shí)還原NO3--N和NO2--N，無(wú)NO2--N積累，還有一類反硝化細(xì)菌盡管可以同時(shí)還原NO3--N和NO2--N，但NO2--N的還原速率較慢，仍可實(shí)現(xiàn)NO2--N的積累〔15-16〕。如果能富集和篩選出易于進(jìn)行PD的細(xì)菌，則可為短程反硝化-厭氧氨氧化（Partial denitrification ANAMMOX，PD/A）耦合工藝的實(shí)際應(yīng)用提供重要支撐。

本研究采集活性污泥以及水稻田土壤樣品，篩選易于進(jìn)行PD的細(xì)菌，并對(duì)影響菌株NO2--N積累的環(huán)境因子進(jìn)行了探析，以期為PD/A耦合新型脫氮工藝提供潛在菌株。

1 材料及方法

1.1 樣品采集

取蔡甸污水處理廠二沉池活性污泥樣品，其懸浮固體（SS）質(zhì)量濃度為2 870 mg/L，另外取長(zhǎng)江大學(xué)周邊水稻田表層下5 cm土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株的富集和分離。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：KNO31.0 g，葡萄糖5.0 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，定 容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH在7.0～8.0。

分離 培 養(yǎng) 基：KNO31.0 g，葡 萄 糖5 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，定 容至1 000 mL，調(diào) 節(jié)pH在7.0～8.0，加 入1.5%～2.0%的瓊脂。

純化 培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g，蛋白 胨1.0 g，NaCl 0.5 g，定 容 至1 000 mL，調(diào) 節(jié)pH在7.0～8.0，加 入1.5%～2.0%的瓊脂。

反硝 化 培 養(yǎng) 基：KNO31.0 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，檸檬酸鈉4.6 g，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH在7.0～8.0。

微量元素：EDTA 50 g，CuSO4·5H2O 1.5 g，CaCl25.5 g，CoCl2.6H2O 1.61 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 5 g，ZnSO42.2 g，定容至1 000 mL。

1.3 菌株篩選

1.3.1 菌株分離純化

稱量10 g水稻田土壤，加入100 mL無(wú)菌水，磁力攪拌器震蕩10 min，取5 mL土壤懸浮液和5 mL活性污泥樣品分別接種到100 mL富集培養(yǎng)基中，于30 ℃下厭氧搖床培養(yǎng)3 d，重復(fù)富集3次。之后將菌液濃度分別稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7這5個(gè)量級(jí)，均勻涂至分離培養(yǎng)基平板上，30 ℃下于厭氧培養(yǎng)罐中倒置培養(yǎng)。待平板長(zhǎng)出菌落后，挑選形態(tài)大小各異的菌落用劃線培養(yǎng)法進(jìn)行分離、純化至無(wú)雜菌生長(zhǎng)，菌株保藏備用。

1.3.2 菌株篩選

經(jīng)過(guò)富集分離純化后，得到形態(tài)不同的單菌落，挑選這些單菌落在試管內(nèi)進(jìn)行液體厭氧培養(yǎng)，72 h后，測(cè)定試管內(nèi)NO3--N以及NO2--N濃度，從而獲得反硝化效率高的4株菌株H6、H7、D5、D9。之后對(duì)該4株菌株進(jìn)行NO3--N還原性能測(cè)試，選擇檸檬酸鈉為碳源，C/N控制在8，30 ℃下厭氧培養(yǎng)，定期取樣測(cè)試OD600、NO3--N和NO2--N濃度，篩選出PD效果好的菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

選擇PD性能優(yōu)良的菌株D5，從形態(tài)學(xué)以及16S rDNA序列方面對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1）菌株形態(tài)。用平板劃線法和掃描電鏡（SEM）觀察所選菌株D5的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將菌株接種于反硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取2 mL菌液離心，倒掉上清液，加入預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液固定24 h后用掃描電鏡觀察菌株細(xì)胞形態(tài)。

2）菌株的PCR擴(kuò)增。用細(xì)菌DNA提取盒提取菌株D5的DNA，然后以基因組DNA為模板，利用細(xì)菌 通 用 引 物27F（5'-TTC CGG TTG ATC CTG CCG GA-3'）和1492R（5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)Blast軟件進(jìn)行同源性比較并用Mega構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 不同環(huán)境因子對(duì)菌株D5脫氮的影響

1.4.1 碳源

選取酒石酸鉀鈉、乙酸鈉和檸檬酸鈉為碳源，配制NO3--N質(zhì)量濃度為120.01 mg/L，C/N為8的反硝化培養(yǎng)液，分別取300 mL加入到500 mL厭氧瓶?jī)?nèi)，120 ℃滅菌15 min，冷卻后接種5 mL D5菌液，通高純氮?dú)?0 min除氧，密封，于30 ℃下進(jìn)行搖床實(shí)驗(yàn)。定期取水樣檢測(cè)分析NO3--N和NO2--N，研究碳源對(duì)菌株D5脫氮的影響。

1.4.2 C/N

選擇檸檬酸鈉為碳源，配制C/N分別為0.8、1、2、3、5的培養(yǎng)液，按1.4.1實(shí)驗(yàn)步驟于30 ℃下厭氧培養(yǎng)，定期取水樣分析NO3--N和NO2--N，研究C/N對(duì)菌株D5脫氮的影響。

1.4.3 溫度

設(shè)置3個(gè)溫度分別為15、25、30 ℃，控制C/N為5，按1.4.1實(shí)驗(yàn)步驟接種D5于反硝化培養(yǎng)液中，厭氧環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，定期取水樣分析NO3--N和NO2--N，研究溫度對(duì)菌株D5脫氮性能的影響。

1.5 分析方法

pH采用pH計(jì)測(cè)定（上海雷磁公司pHS-3E型）；DO采用110溶解氧儀測(cè)定（上海雷磁公司JPSJ-605F型）；OD600采用分光光度計(jì)測(cè)定（島津公司UV-1100型）；NO3--N采用紫外分光光度法；NO2--N采用分光光度法。水樣分析前均用0.45 μm膜進(jìn)行過(guò)濾處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過(guò)富集分離純化后，得到24株形態(tài)不同的單菌落，挑選這些單菌落在試管內(nèi)進(jìn)行厭氧反硝化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)NO3--N還原能力和自身生長(zhǎng)繁殖速度，選取H6、H7、D5、D9共4株菌株，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)了這4株菌株的反硝化性能以及NO2--N積累能力，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌株的反硝化脫氮過(guò)程Fig.1 Nitrogen removal of different strains

由圖1（a）可見(jiàn)，H7、D5、D9菌株的NO3--N去除規(guī)律類似，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后NO3--N的去除效果明顯，在24 h內(nèi)NO3--N質(zhì)量濃度迅速降低到8.69、14.92、23.29 mg/L，去除率達(dá)到94.5%、90.5%、85.2%，在6～24 h內(nèi)菌株OD600也顯著增加至0.825、0.765、0.743〔圖1（c）〕，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，NO3--N去除率均大于90%。H6對(duì)硝酸鹽的去除呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)初始階段NO3--N濃度降低較慢，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行60 h后，硝酸鹽去除率僅為40.8%，之后迅速降低，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，去除率為88.4%。由OD600也可以看出H6生長(zhǎng)較為緩慢，36 h時(shí)僅為0.302，之后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期。該結(jié)果表明，在該實(shí)驗(yàn)條件下菌株H6的適應(yīng)期較長(zhǎng)，但隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，仍然具有較高的NO3--N去除率。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各菌株均有不同程度的NO2--N積累〔圖1（b）〕，H7、D5、D9積累NO2--N的規(guī)律一致，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，系統(tǒng)內(nèi)的NO2--N濃度迅速升高，24 h時(shí)達(dá)到最大值，依次為91.70、95.70、94.70 mg/L，之后下降，從36 h開(kāi)始直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，質(zhì)量濃度分別維持在（44.00±2.40）、（42.94±5.16）、（42.79±3.82） mg/L之間。由以上數(shù)據(jù)可以判斷，菌株H7、D5、D9在還原NO3--N的過(guò)程中，易于發(fā)生PD，從而引起顯著的NO2--N積累。H6則呈現(xiàn)出不同的現(xiàn)象，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NO2--N的積累量輕微，36 h時(shí)質(zhì)量濃度僅為3.94 mg/L，遠(yuǎn)低于H7、D5、D9的積累量，72 h時(shí)已無(wú)NO2--N檢出，這充分表明菌株H6進(jìn)行的是完全反硝化作用，NO2--N難以積累。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NO3--N的還原條件一致，細(xì)菌種類的不同是引起NO2--N積累程度差異的主要原因，菌株H7、D5、D9在還原硝酸鹽過(guò)程中，PD作用明顯，NO2--N積累量大，而H6在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反硝化作用徹底，NO2--N積累輕微。Rui DU等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)Thauera屬的反硝化細(xì)菌含有的Nir反硝化基因豐度要遠(yuǎn)低于Nar，判斷Thauera屬進(jìn)行的反硝化作用為階段性反硝化反應(yīng)。據(jù)此推測(cè)H7、D5、D9菌株中含有Nir反硝化基因，但其活性低于Nar，致使NO3--N被還原為NO2--N后，不能及時(shí)進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)化，從而引起NO2--N的積累，相反H6中含有的Nar豐度高于Nir，在反硝化過(guò)程中產(chǎn)生的NO2--N能被及時(shí)還原。

由上面的分析可知，D5菌株P(guān)D效果顯著，NO3--N去除率高，NO2--N積累明顯，選為后續(xù)研究的菌株。

2.2 菌株的鑒定

菌株D5的形態(tài)特征為菌落較大、圓形、淺黃色、表面光滑、濕潤(rùn)、易挑取。經(jīng)鑒定該菌株為桿狀細(xì)菌。

將菌株D5的16S rDNA進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)菌株D5與Klebsiella quasipneumoniae、Klebsiella pneumoniae的相似度均達(dá)到99%以上。另外由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）可見(jiàn)，菌株D5跟Klebsiella pneumoniae的親緣關(guān)系最近，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特性，鑒定分離的菌株D5為克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）、肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）。該菌株在人體腸道、動(dòng)物血液和內(nèi)臟等分離的比較多，以往的研究主要針對(duì)人體健康及耐藥性等方面〔18〕。在污水處理系統(tǒng)中，常見(jiàn)的反硝化細(xì)菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、陶厄氏菌屬（Thauera）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等〔19〕。本研究篩選的D5來(lái)自水稻田土壤，不屬于污水處理中的常見(jiàn)反硝化細(xì)菌，但是先前也有一些研究篩選出了Klebsiellasp.反硝化細(xì)菌〔20〕，例如劉詠等〔21〕從巢湖蘆葦濕地分離篩選出一株異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，命名為Klebsiellasp.DB-1，能夠有效地去除水中NO3--N，中間有NO2--N積累，但是72 h后NO2--N快速被分解掉。封勇等〔22〕篩選出的肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）具有降解銨鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽的作用，24 h 內(nèi)的降解率分別為 96%、100%、100%，中間過(guò)程有NO2--N積累，但是在18 h被完全降解掉。而本實(shí)驗(yàn)篩選出的菌株P(guān)D作用明顯，盡管實(shí)驗(yàn)后期NO2--N的積累量有所降低，但直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，仍保持一個(gè)較高的濃度水平。與以往資料中篩選出的Klebsiellasp.相比，菌株D5更易積累NO2--N，這可能與菌株的Nar與Nir活性 相 關(guān)，劉 詠 等〔21〕認(rèn) 為 菌 株Klebsiellasp.DB-1的Nar合成與Nir合成并不協(xié)調(diào)，72 h后Nir大量合成，將積累的亞硝酸鹽快速還原，據(jù)此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，菌株D5并未大量合成Nir，Nir活性低，NO2--N積累較為穩(wěn)定。

圖2 基于16S r DNA分析的菌株D5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain D5 based on 16S r DNA analysis

2.3 環(huán)境因子對(duì)菌株D5性能的影響

PD的實(shí)現(xiàn)跟反硝化細(xì)菌內(nèi)的Nar與Nir對(duì)供應(yīng)電子的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)，通過(guò)環(huán)境條件的調(diào)控可針對(duì)性干預(yù)Nar與Nir的競(jìng)爭(zhēng)，提升Nar的活性，同時(shí)抑制Nir的活性，便可取得好的PD效果，使NO2--N穩(wěn)定積累。

2.3.1 碳源

大部分反硝化細(xì)菌都需要依靠外界碳源作為電子供體還原NO3--N，不同類型污水中的有機(jī)物種類不同，反硝化菌對(duì)其利用能力存在差異，進(jìn)而影響NO2--N的積累〔23-24〕。碳源對(duì)菌株D5反硝化性能的影響見(jiàn)圖3。

圖3 碳源對(duì)菌株D5反硝化性能的影響Fig.3 Effect of the carbon source on the denitrification performance of strain D5

由圖3（a）可知，以酒石酸鉀鈉為碳源時(shí)，菌株D5還原NO3--N的效果差，去除率僅有12.7%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)NO2--N積累〔（圖3（b）〕，該結(jié)果說(shuō)明D5不能有效地利用酒石酸鉀鈉，短程反硝化難以進(jìn)行，無(wú)NO2--N積累。但是朱紅旭等〔25〕以酒石酸鉀鈉為碳源時(shí)，篩選出的反硝化菌株在72 h時(shí)NO3--N去除率超過(guò)60%，并有一定的NO2--N積累。以往的一些資料也發(fā)現(xiàn)不同的反硝化細(xì)菌對(duì)碳源的利用能力存在差異〔26-27〕，因此針對(duì)不同的細(xì)菌選擇合適的碳源是取得好的PD效果的關(guān)鍵。

當(dāng)以乙酸鈉跟檸檬酸鈉為碳源時(shí)，菌株D5均表現(xiàn)出強(qiáng)的NO3--N還原能力，但仍存在一定差異〔圖3（a）〕。以乙酸鈉為碳源時(shí)，24 h內(nèi)NO3--N去除率較低，僅有23.8%，之后快速升高，36 h的去除率為81.1%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，去除率達(dá)到97.9%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中PD現(xiàn)象明顯，但是在12 h內(nèi)無(wú)NO2--N積累，結(jié)合前面的NO3--N去除率，可以判斷在該實(shí)驗(yàn)階段D5處于適應(yīng)期，NO3--N還原速率慢，無(wú)NO2--N積累。12 h之后NO2--N質(zhì)量濃度逐漸升高，達(dá)到（18.29±1.61） mg/L。由以上分析可知，乙酸鈉為碳源時(shí)，菌株D5可以進(jìn)行PD反應(yīng)，但是啟動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)。以檸檬酸鈉為碳源時(shí)，菌株D5的活性更高，24 h內(nèi)NO3--N的去除率便達(dá)到90%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)去除率為94.4%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NO2--N積累達(dá)到（18.84±2.89）mg/L，PD效果明顯，啟動(dòng)時(shí)間短。以往很多研究曾一度將乙酸鹽視為PD的最佳電子供體，Lingxiao GONG等〔12〕曾以乙酸鹽作為碳源在C/N為2.5時(shí)實(shí)現(xiàn)了高的PD效果，Rui DU等〔28〕也以乙酸鹽驅(qū)動(dòng)PD實(shí)現(xiàn)了NAR達(dá)到90%的效果，而本實(shí)驗(yàn)中檸檬酸鈉能更快速地啟動(dòng)PD，是菌株D5的最佳碳源，與以往的研究存在差異，這可能是由于反硝化系統(tǒng)中細(xì)菌的種類不同所致，以前也有資料發(fā)現(xiàn)不同的PD菌群對(duì)同一類型的碳源利用能力不同〔15，29〕，可以判斷，菌株D5能更有效地利用檸檬酸鈉。朱云等〔30〕同樣發(fā)現(xiàn)乙酸鈉、檸檬酸鈉是好氧反硝化細(xì)菌Pseudomonas furukawaii的最佳碳源。

由上面的分析可知，檸檬酸鈉和乙酸鈉為碳源時(shí)，D5去除NO3--N效果好，NO2--N積累明顯，而檸檬酸鈉能更快速地啟動(dòng)PD，為菌株D5的最佳碳源。

2.3.2 C/N

C/N通常被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)PD的重要因素，C/N越低，Nir受到抑制，NO3--N還原速率大于NO2--N還原速率，易造成NO2--N積累〔11，15〕，但過(guò)低的C/N會(huì)抑制反硝化細(xì)菌的活性，因此探究C/N對(duì)PD的影響對(duì)于取得穩(wěn)定的NO2--N積累有著重要的意義。圖4是C/N對(duì)菌株D5反硝化性能的影響。

圖4 C/N對(duì)菌株D5反硝化性能的影響Fig.4 Effect of C/N on the denitrification performance of strain D5

由圖4（a）可知，在不同的C/N條件下，菌株D5去除NO3--N的效果有較大的差別。當(dāng)C/N為0.8、1時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NO3--N有一定的去除，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)NO3--N質(zhì)量濃度分別為34.96、23.89 mg/L，去除率為59.0%、71.8%，表明體系中有機(jī)碳限制了細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致NO3--N去除率較低。當(dāng)C/N升高為2時(shí)，NO3--N去除率明顯增大，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)NO3--N質(zhì)量濃度為14.45 mg/L，去除率達(dá)到84%。而當(dāng)C/N為3、5時(shí)，反硝化效果進(jìn)一步提升，到48 h時(shí)，去除率便分別達(dá)到88.3%、90.5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，去除率均高于96.0%，明顯高于當(dāng)C/N為0.8、1、2時(shí)的NO3--N去除率，表明隨著C/N越高，D5還原NO3--N的效果越好。以往的一些研究也表明，細(xì)菌的脫氮效果會(huì)隨著C/N的增大而升高，達(dá)到一定值后，脫氮效果維持穩(wěn)定〔31〕。本研究中C/N為3、5時(shí)，最終的NO3--N去除率接近，劉泳等〔21〕也發(fā)現(xiàn)當(dāng)C/N大于3以后，碳源已不再是反硝化體系的限制性因素，NO3--N的去除率基本不變。而Jinming DUAN等〔32〕卻發(fā)現(xiàn)，菌株Vibrio diabolicusSF16在C/N為10時(shí)脫氮效果最高，造成這種差異的原因可能跟碳源類型、微生物種類等因素有關(guān)。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直有明顯的NO2--N積累，對(duì)比圖4（a）、圖4（b）發(fā)現(xiàn)，NO2--N的積累規(guī)律不同于NO3--N的去除規(guī)律，C/N為1、2、3時(shí)，36 h后質(zhì)量濃度便分別達(dá)到（61.87±2.43）、（61.76±1.67）、（57.47±2.90） mg/L，積累率超過(guò)60%，而當(dāng)C/N為0.8、實(shí)驗(yàn)中仍存在顯著的NO2--N積累，但是積累量要低于C/N為1、2、3時(shí)，結(jié)合前面的硝酸鹽去除率，推測(cè)C/N為0.8時(shí)，體系內(nèi)碳源不足，Nar和Nir均被抑制，因此積累的NO2--N濃度略低。而當(dāng)C/N為5時(shí)，充足碳源能夠保證Nir的活性，產(chǎn)生的NO2--N被還原，積累量最低，但是仍有一定的積累，可以推斷菌株D5的Nir活性要低于Nar活性，致使NO3--N還原速率大于NO2--N還原速率，易于積累NO2--N。

由上面的分析可知，合適的C/N是取得最佳PD效果的關(guān)鍵，結(jié)合硝酸鹽去除率以及NO2--N的積累，本研究中的最佳C/N為3。以往的研究也表明，在一定范圍內(nèi)增加C/N有助于NO2--N的積累，但C/N過(guò)高反而不利，T.V.KRISHNA MOHAN等〔33〕研究了乙酸鈉作為碳源時(shí)C/N對(duì)高濃度硝酸鹽廢水反硝化的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C/N為1.5～3.0，完全脫氮時(shí)間和最大NO2--N積累量隨C/N比的增大而增大。柳全龍等〔11〕發(fā)現(xiàn)在PD過(guò)程中，C/N對(duì)亞硝酸鹽積累有明顯的影響，當(dāng)C/N在2.0～2.5時(shí)，NO2--N積累率隨C/N的升高而升高，在C/N=2.5時(shí)，達(dá)到最高值82.18%，而C/N在3.3～5.0時(shí)NO2--N積累明顯下降，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似。不同研究中的最佳C/N存在差異，這可能跟細(xì)菌類型、碳源種類以及其他環(huán)境條件有關(guān)。

2.3.3 溫度

溫度可以通過(guò)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和新陳代謝而影響細(xì)菌的反硝化性能，進(jìn)而影響NO2--N的積累〔13〕。溫度對(duì)菌株D5反硝化性能的影響見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)菌株D5反硝化性能的影響Fig.5 Effect of the temperature on the denitrification performance of strain D5

由圖5可知，當(dāng)溫度為15 ℃時(shí)，NO3--N去除率低于10%，且無(wú)NO2--N檢出，這說(shuō)明15 ℃時(shí)，D5活性低下，難以還原NO3--N，無(wú)NO2--N積累。當(dāng)溫度上升到25 ℃和30 ℃時(shí)，NO3--N去除率明顯提高，去除率均達(dá)到95%以上，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中積累的NO2--N從24 h開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別達(dá)到88.14、76.7 mg/L，積累率分別高達(dá)84%、73%，獲得了好的PD效果。先前的研究亦表明反硝化細(xì)菌的最適溫度為20～35 ℃〔34〕。

結(jié)合前面的分析可以推斷，菌株D5是一類可以同時(shí)還原NO3--N和NO2--N的反硝化細(xì)菌，Nar在跟Nir競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，NO3--N的還原速率要高于NO2--N的還原速率，引起NO2--N的積累，通過(guò)調(diào)控環(huán)境條件可以取得最佳的PD效果。

3 結(jié)論

1）從水稻田土壤中篩選出一株具有高效PD性能的菌株D5，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察為桿狀菌，結(jié)合16S rDNR測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)比對(duì)鑒定為肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）。

2）乙酸鈉和檸檬酸鈉均可作為菌株D5的碳源使用。以乙酸鈉為碳源時(shí)，NO2--N顯著積累，但PD啟動(dòng)較慢，檸檬酸鈉能快速啟動(dòng)PD反應(yīng)，24 h內(nèi)NO3--N的去除率便達(dá)到90%，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中NO2--N達(dá)到（18.84±2.89） mg/L，是菌株D5啟動(dòng)短程反硝化的最佳碳源。

3）C/N對(duì)菌株D5的PD效果影響明顯，最佳C/N為3，此時(shí)NO3--N的去除率高于96%，亞硝酸鹽的積累量達(dá)到（57.47±2.90） mg/L，積累率超過(guò)60%。

4）溫度對(duì)菌株D5的PD效果影響明顯，當(dāng)溫度為25 ℃和30 ℃時(shí)，NO3--N去除率均達(dá)到95%以上，NO2--N積累率達(dá)到84%和73%，PD效果顯著。

上述成果不但為PD/A新型脫氮工藝提供了適合的菌株，同時(shí)為確定最佳PD條件提供了重要理論支撐，在污水脫氮處理中具有廣闊的應(yīng)用前景。