全自動(dòng)在線固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用方法測定污水中11種常見毒品

呂建霞,蔣力維,楊 哲,王 晨,陳思夢,張 崇,孫小杰

(1.國家毒品實(shí)驗(yàn)室 北京分中心,北京 100164;2.SCIEX 中國技術(shù)支持中心,北京 100015)

毒品濫用已成為世界范圍內(nèi)不容忽視的問題。2021年中國毒情形勢報(bào)告中指出全國共破獲毒品犯罪案件5.4萬起,抓獲犯罪嫌疑人7.7萬名,繳獲毒品27 t,查處吸毒人員32.6萬人次。在新冠疫情的影響下,吸毒人數(shù)減少[1-2],但毒品濫用種類多樣,吸食毒品替代物質(zhì)情況增多。濫用場所更加隱蔽,利用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)在線吸毒增多,發(fā)現(xiàn)查處難度大。監(jiān)測毒品濫用情況可以及時(shí)掌握本地區(qū)毒品濫用的種類以及毒品消費(fèi)量,而如何監(jiān)測則成為一個(gè)新的課題。2001 年DAUGHTON[3]提出了一個(gè)新的概念——污水流行病學(xué)方法來評估毒品消費(fèi)情況,其原理是通過測定污水處理廠進(jìn)水中毒品及其代謝物濃度,通過污水廠日處理量、服務(wù)區(qū)域的人口數(shù)量及毒品排泄率等參數(shù)反算毒品濫用量。應(yīng)用污水流行病學(xué)方法進(jìn)行毒情監(jiān)測,省時(shí)省力且客觀性強(qiáng),能為緝毒部門提供合理有效建議,目前已被很多國家應(yīng)用于毒情監(jiān)測[4-7]。

污水中毒品代謝物的濃度測定是污水分析法評估毒品濫用量的關(guān)鍵。方法的基礎(chǔ)是對生活污水中的毒品及代謝物進(jìn)行分析。毒品代謝物進(jìn)入污水收集系統(tǒng)后與生活污水進(jìn)行混合,其中代謝物含量被稀釋上千甚至上萬倍,濃度通常只有納克甚至皮克級別,并且污水成分復(fù)雜,因此對污水樣品進(jìn)行富集凈化的前處理方法非常重要。目前污水中毒品及其代謝物的前處理方法主要有液液萃取法[8-9]、針式微萃取技術(shù)[10]和固相萃取方法[11-14]。液液萃取耗費(fèi)的試劑比較多,而且凈化效果不理想;針式微萃取技術(shù)比較適合于氣相色譜的熱解析,在液相色譜中應(yīng)用較少;而固相萃取由于其較高的回收率和優(yōu)異的凈化效果而應(yīng)用比較廣泛。離線固相萃取方式步驟比較繁瑣,需要耗費(fèi)大量的人力、物力、時(shí)間成本;相比傳統(tǒng)的離線固相萃取方式,在線固相萃取(Online SPE)具有樣品利用率高、所需樣品少;全體積自動(dòng)在線萃取、解吸、進(jìn)樣,通量高、可大大節(jié)約人力及時(shí)間成本;以及前處理交叉污染相對較少等特點(diǎn),因此在實(shí)際污水驗(yàn)毒工作中深受一線檢測人員歡迎?；诖?本工作開發(fā)了全自動(dòng)On-line SPE-LC MS/MS 系統(tǒng)對污水中11種常見毒品及代謝物進(jìn)行定性與定量分析方法,并用于污水中11種常見毒品及代謝物的定量測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)PAL3系統(tǒng),瑞士CTC公司,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(色譜儀:美國SCIEX Exion LC 20ADTM系統(tǒng),質(zhì)譜儀:美國SCIEX Triple QuadTM6500系統(tǒng)),固相萃取柱Oasis HLB(2.10 mm×30 mm,20 μm),美國Waters公司。

11種常測毒品的標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg·mL-1,甲醇溶劑)和人口標(biāo)記物可替寧以及各自相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(100 μg·mL-1,甲醇溶劑),美國Cerilliant公司,包括苯丙胺(AM)、苯甲酰愛康寧(BZE)、氯胺酮(K)、甲基苯丙胺(MA)、3,4-亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)、去甲氯胺酮(NK)、O6-單乙酰嗎啡(O6)、嗎啡(Mor)、可卡因(Coc)、可待因(Cod)、可替寧(Cot),以 及 AM-D5、BZE-D3、K-D4、MA-D5、MDA-D5、MDMA-D5、NK-D4、O6-D3、Mor-D3、Coc-D3、Cod-D6、Cot-D3。

1.2 樣品前處理平臺(tái)

PAL3平臺(tái)是一款具備自動(dòng)樣品前處理功能的平臺(tái),機(jī)械臂能夠在X,Y,Z三維方向自由移動(dòng),能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)加液、樣品瓶轉(zhuǎn)移、振蕩混勻、大體積進(jìn)樣等功能。基于該平臺(tái),建立了全自動(dòng)樣品前處理方法,包括自動(dòng)添加內(nèi)標(biāo)、將樣品瓶轉(zhuǎn)移至渦旋混合器中混勻、大體積上樣至固相萃取小柱等步驟。

1.3 質(zhì)譜和液相色譜參數(shù)的優(yōu)化

質(zhì)譜中需要優(yōu)化的參數(shù)主要是去簇電壓和碰撞能量,根據(jù)所檢測化合物的相對分子質(zhì)量設(shè)置掃描的質(zhì)荷比的范圍,尋找母離子。利用儀器自動(dòng)優(yōu)化去簇電壓(DP)得到最佳母離子響應(yīng)。然后再自動(dòng)優(yōu)化碰撞能量(CE),得到最佳響應(yīng)的子離子對。豐度最大的離子對作為定量離子對,另一離子對作為定性離子對。

采用液相色譜柱Phenomenex Kinetex Biphenyl(2.1 mm ×100 mm,2.6 μm),優(yōu)化流速、流動(dòng)相pH 值、所含鹽類及濃度、洗脫梯度等條件,以獲得目標(biāo)物的理想峰形和高分離度。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化后的樣品前處理參數(shù)

從取樣點(diǎn)取回的污水冷凍保存,進(jìn)行測定前先解凍,然后經(jīng)過0.45 μm 玻璃纖維濾膜過濾,取10 mL過濾后的樣品于20 mL 樣品瓶中,置于PAL3全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)樣品托盤中,待分析。啟動(dòng)樣品前處理程序后,PAL3系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)使用進(jìn)樣針向樣品中添加同位素內(nèi)標(biāo)制得25 ng·L-1的溶液,然后將樣品瓶轉(zhuǎn)移至渦旋混合器混合均勻,再將樣品瓶轉(zhuǎn)移回樣品托盤上,待上樣分析。

PAL3系統(tǒng)自動(dòng)從樣品瓶中采用定量環(huán)定量移取樣品2 mL上SPE小柱進(jìn)行富集凈化。離線固相萃取的相關(guān)研究[12,14]中,均選擇使用Oasis HLB(60 mg,3 mL),本方法中也選擇相同類型的SPE小柱,以求取得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,同時(shí)根據(jù)在線固相萃取小柱的要求選用不同的尺寸,因此本方法中使用的小柱類型為:Oasis HLB(2.1 mm ×30 mm,20 μm)。采用的流速為2 mL·min-1,流動(dòng)相A:水;流動(dòng)相B:甲醇,采用的梯度見表1。

表1 泵1流動(dòng)相洗脫程序Table 1 Mobile phase elution procedure of pump 1

2.2 優(yōu)化后的液相色譜參數(shù)

分析柱:Phenomenex Kinetex Biphenyl(2.1 mm ×100 mm,2.6 μm),具有100%水溶性溶劑穩(wěn)定的反相固定相,具備疏水性選擇性、芳香族選擇性和增強(qiáng)的極性選擇性,能夠保證所有化合物具有良好的峰形和分離度。流動(dòng)相中有機(jī)相選用乙腈,乙腈具有中等洗脫能力、強(qiáng)溶解能力、能夠得到明確的色譜峰、低黏度等特性,比較適合用作流動(dòng)相。流動(dòng)相中加入適量的甲酸和甲酸銨,可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH 值,也可以提高目標(biāo)物的電離效率。具體參數(shù)如下,柱溫:40 ℃,流動(dòng)相A:水(0.02%甲酸+2 mmol·L-1甲 酸銨);B:乙腈(0.02% 甲酸+2 mmol·L-1甲酸銨),流速0.4 mL·min-1,梯度見表2。

2.3 優(yōu)化后的質(zhì)譜檢測參數(shù)

電噴霧電離源,正離子化模式(ESI+);監(jiān)測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS):3 000 V;氣簾氣壓力(CUR):30 Psi(1 Psi=6.89 kPa);碰撞氣壓力(CAD):8 Psi;霧化氣壓力(GSI):55 Psi;輔助加熱氣壓力(GS2):65 Psi;輔助氣溫度:500 ℃。每個(gè)化合物的離子對、去簇電壓、碰撞能量見表3。

表3 12種目標(biāo)物及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 MS parameters of 12 objectives and internal standards

2.4 對已優(yōu)化的方法的評價(jià)

2.4.1 12種目標(biāo)物的典型色譜圖

可替寧是尼古丁的代謝物,吸煙人群排出體外到污水中,而可替寧只有人體代謝這一來源,因此可做為一種生物標(biāo)記物,來計(jì)算采樣區(qū)域服務(wù)人口數(shù)量。所以除了11種常見毒品之外,可替寧也作為一種目標(biāo)物需要進(jìn)行測定。

配制12種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為20 ng·L-1,直接進(jìn)樣,考察各目標(biāo)物的出峰情況,見圖1。如圖1所示,12種目標(biāo)物的出峰時(shí)間在4.4和7.0 min區(qū)間內(nèi),每個(gè)化合物的峰形良好,充分表明本方法用于檢測此12種物質(zhì)完全可行。

圖1 12種目標(biāo)物的典型色譜圖Fig.1 Representative chromatogram of 12 objectives

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度結(jié)果

采用空白污水基質(zhì)樣本加標(biāo),配置濃度在1～500 ng·L-1范圍內(nèi)的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線,內(nèi)標(biāo)加入濃度為25 ng·L-1,以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),做線性關(guān)系圖。全部12種化合物線性關(guān)系良好,線性方程和相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 12種目標(biāo)物的線性方程及定量限結(jié)果Table 4 Linearity and LOQ of 12 objectives

將1 ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級用水稀釋,以信噪比S/N≥10為定量限標(biāo)準(zhǔn),確定12種化合物的儀器靈敏度(見表4)。

2.4.3 重復(fù)性及回收率結(jié)果

針對本方法中涉及的12 種化合物,在1、10、100 ng·L-13個(gè)濃度下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),污水的實(shí)際加標(biāo)回收率在87.7%～113.8%之間,滿足方法學(xué)要求。同時(shí)進(jìn)行3個(gè)濃度點(diǎn)的重復(fù)性試驗(yàn),所有化合物濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 在1.49%～7.39%之間(表5),方法及儀器的穩(wěn)定性良好。

3 方法應(yīng)用于實(shí)際污水樣品的檢測

分別在2個(gè)污水處理廠采集了4份污水樣品,編號(hào)為:589、602、617和572,經(jīng)PAL3全自動(dòng)樣品前處理平臺(tái)進(jìn)行自動(dòng)加內(nèi)標(biāo)混勻后,大體積進(jìn)樣到液相色譜中,在線固相萃取富集凈化后上機(jī)檢測,測定結(jié)果見表6。從結(jié)果中可以看出,檢出的毒品種類主要有嗎啡、甲基苯丙胺、3,4-亞甲基二氧基苯丙胺、氯胺酮,檢出的濃度分別為2.13～7.82 ng·L-1、0.16 ng·L-1、0.27～1.70 ng·L-1、0.21～0.44 ng·L-1;嗎啡檢測含量較高,可以為相關(guān)部門的毒情研判提供一定的線索。實(shí)際樣品的檢測譜圖,見圖2。

表6 實(shí)際污水樣品測定結(jié)果Table 6 Determination results of actual sewage samples

4 結(jié)論

采用SPE小柱富集凈化,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測,建立了全自動(dòng)On-line SPE-LC-MS/MS聯(lián)用方法測定污水中11種常見毒品及代謝物的分析方法。本方法不僅可對污水樣品實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)樣品前處理操作,而且靈敏度高,具有綠色環(huán)保、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn),適用于實(shí)際污水樣品中常見毒品的測定,能夠?yàn)槎厩楸O(jiān)測工作提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。