紫外分光光度法快速測(cè)定綠葉菜中硝酸鹽含量的技術(shù)步驟優(yōu)化

包蔚 徐樺 朱曉蕓 何鍇 余海芬 吳真善 黃明皓 王絡(luò)繹

（上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201800）

目前綠葉菜中硝酸鹽含量的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、酚二磺酸比色法、鎘柱或鎘粒還原分光光度法、離子色譜法等[1]。其中，酚二磺酸比色法是測(cè)定綠葉菜中硝酸鹽含量的經(jīng)典方法，但該方法操作煩瑣、干擾因素多，不能滿足常規(guī)分析的需要；鎘柱還原分光光度法是檢測(cè)蔬菜中硝酸鹽含量的國家標(biāo)準(zhǔn)方法[2]，此方法以金屬鎘還原NO3-為NO2-為原理，操作步驟繁多，且在還原時(shí)鎘粒量要充足，否則易造成測(cè)定結(jié)果偏低；離子色譜法對(duì)儀器的要求較高，且所用試劑有毒，對(duì)環(huán)境和操作人員均有不良影響；紫外分光光度法具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，更符合常規(guī)檢測(cè)安全、快速、大批量的要求。鑒于此，筆者采用紫外分光光度法，通過比較不同提取方法、不同振蕩時(shí)間和干擾物質(zhì)等不同測(cè)定條件對(duì)綠葉菜中硝酸鹽含量測(cè)定的影響，并對(duì)不同測(cè)定條件下的檢測(cè)精密度及準(zhǔn)確度進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，以期優(yōu)化測(cè)定步驟，從而為綠葉菜中硝酸鹽含量的檢測(cè)提供更為簡(jiǎn)便快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品為2022年隨機(jī)采自上海設(shè)施菜地的新鮮蔬菜，包括生菜、青菜、菠菜、空心菜、芹菜、米莧、杭白菜等。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：氨緩沖溶液（pH為9.6～9.7）、飽和硼砂溶液、0.25 mol/L 亞鐵氰化鉀溶液、l mol/L 乙酸鋅溶液、500 mg/L 硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液、活性炭、正辛醇。

主要儀器：紫外分光光度計(jì)、分析天平、粉碎機(jī)、恒溫振蕩器、勻漿機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及原理

紫外分光光度法測(cè)定綠葉菜中硝酸鹽含量是利用提取液提取出硝酸鹽，然后加入活性炭去除色素，加入蛋白質(zhì)沉淀劑去除蛋白質(zhì)及其他干擾物質(zhì)，再利用硝酸根離子在紫外區(qū)219 nm 處具有吸收波長的特性，測(cè)定提取液的吸光度，從而計(jì)算出硝酸鹽含量。

1.3.1 樣品制備

選取一定數(shù)量具有代表性的供試樣品，先用自來水沖洗，再用去離子水清洗干凈，吸干表面水分，切碎后置于粉碎機(jī)中勻漿，勻漿后在其中加1 滴正辛醇，以消除泡沫。

1.3.2 硝酸鹽提取

飽和硼砂提?。悍Q取15～20 g 勻漿試樣，加入飽和硼砂溶液2.5 mL，再加入70～80 ℃的熱水40 mL，然后置于沸水浴中加熱15 min，持續(xù)攪拌。待溶液冷卻后，沖洗入250 mL 容量瓶中，加入0.25 mol/L 亞鐵氰化鉀溶液5 mL，搖勻，再加入1 mol/L 乙酸鋅溶液5 mL、活性炭1 g，然后定容到刻度，搖勻、過濾。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

氨緩沖液提?。悍Q取10 g 勻漿試樣，置于100 mL 燒杯中，用100 mL 去離子水分次將樣品轉(zhuǎn)移到250 mL 容量瓶中，再加入5 mL 氨緩沖溶液、2 g粉末狀活性炭，在可調(diào)式往返振蕩機(jī)上（200次/min）振蕩30 min，然后加入亞鐵氰化鉀溶液和硫酸鋅溶液各2 mL，充分混合后，加去離子水定容至250 mL，充分搖勻，放置5～10 min后過濾。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.3.3 硝酸鹽與亞硝酸鹽含量的測(cè)定

吸取上述提取液2～10 mL 置于50 mL 容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容。用1 cm 石英比色皿，于219 nm處測(cè)定吸光度。蔬菜中的亞硝酸鹽含量采用國標(biāo)GB/T 15401-94 中鹽酸萘乙二胺比色法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 工作曲線的配制

分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL 容量瓶中，加去離子水定容至刻度并搖勻，此標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的硝酸根有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。用1 cm 石英比色皿，于219 nm處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。

1.3.5 計(jì)算公式

樣品中硝酸鹽含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(單位：mg/kg)表示，計(jì)算公式W=(C×V1×V3)÷(m×V2），式中，C為從工作曲線中查得的測(cè)試液中的硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/L)，V1為提取液定容體積（mL），V2為吸取濾液體積（mL），V3為待測(cè)液定容體積（mL），m是樣品質(zhì)量(g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 飽和硼砂提取法和氨緩沖液提取法比較

選取新鮮生菜和菠菜作為供試材料，分別采用飽和硼砂提取法和氨緩沖液提取法測(cè)定其硝酸鹽含量，每處理重復(fù)4次。由表1可知，飽和硼砂提取法測(cè)得的生菜和菠菜中硝酸鹽含量的平均值分別為2 809.19 mg/kg 和862.45 mg/kg，而氨緩沖液提取法測(cè)得的生菜和菠菜中硝酸鹽含量的平均值分別為2 948.16 mg/kg 和873.69 mg/kg，氨緩沖液提取法測(cè)得的綠葉菜中硝酸鹽含量略高于飽和硼砂提取法，但兩者差異不顯著。氨緩沖液提取法的變異系數(shù)低于飽和硼砂提取方法，且氨緩沖液提取法的操作步驟比飽和硼砂提取法的操作步驟簡(jiǎn)單。因此，本研究最終選取氨緩沖液提取法來提取綠葉菜中的硝酸鹽。

表1 不同提取方法對(duì)硝酸鹽含量測(cè)定的影響

2.2 振蕩時(shí)間對(duì)硝酸鹽含量測(cè)定的影響

對(duì)于實(shí)驗(yàn)室大批量快速檢測(cè)來說，提取時(shí)震蕩時(shí)間越長，檢測(cè)耗時(shí)越長。為確定樣品中硝酸鹽是否已被完全提取，本試驗(yàn)設(shè)振蕩時(shí)間分別為0、10、20、30、40 min，共5 個(gè)處理，每處理重復(fù)4次。由表2可知，各振蕩時(shí)間測(cè)得的硝酸鹽含量為3 613.31～3 745.86 mg/kg，其中，硝酸鹽含量平均值最大的處理為振蕩20 min，最小的處理為振蕩0 min，但各處理間差異不顯著，且變異系數(shù)均小于10%。以上結(jié)果說明，振蕩時(shí)間對(duì)硝酸鹽含量測(cè)定結(jié)果的影響不大，且沒有呈現(xiàn)出硝酸鹽含量隨振蕩時(shí)間增加而遞增的規(guī)律。

表2 不同振蕩時(shí)間對(duì)硝酸鹽含量測(cè)定的影響

2.3 亞硝酸鹽的干擾實(shí)驗(yàn)

鑒于亞硝酸鹽在219 nm 處有吸光度，會(huì)干擾硝酸鹽含量的測(cè)定結(jié)果，故選取新鮮的青菜、空心菜、芹菜、米莧、杭白菜進(jìn)行亞硝酸鹽含量的測(cè)定。由表3可知，新鮮蔬菜的亞硝酸鹽含量很少，相較于硝酸鹽含量來說，亞硝酸鹽含量幾乎可以忽略不計(jì)。因此，亞硝酸鹽含量對(duì)硝酸鹽含量的測(cè)定結(jié)果基本沒有影響。

表3 蔬菜中硝酸鹽含量與亞硝酸鹽含量比較

2.4 準(zhǔn)確度、精密度實(shí)驗(yàn)

取青菜、空心菜、生菜、芹菜4種新鮮蔬菜樣品，分別加入2 000 mg NO3-，與樣品測(cè)定步驟一樣測(cè)定硝酸鹽含量，計(jì)算回收率。由表4可知，4種蔬菜的回收率在92.61%～109.50%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取青菜、米莧、杭白菜各2個(gè)品種，每個(gè)品種設(shè)4 個(gè)重復(fù)，精密度結(jié)果如表5所示。由表5 可知，各蔬菜中硝酸鹽測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)均小于10%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

通過比較實(shí)驗(yàn)，本研究最終選取氨緩沖液作為提取液，并采用搖勻代替振蕩30 min 的方式，優(yōu)化了紫外分光光度法測(cè)定綠葉菜中硝酸鹽含量的技術(shù)步驟；通過測(cè)定亞硝酸鹽含量，排除了干擾因素；經(jīng)過準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)表明，優(yōu)化后的測(cè)定方法的加標(biāo)回收率在92.61%～109.5%，符合實(shí)驗(yàn)要求。綜上，經(jīng)過完善和優(yōu)化技術(shù)步驟后的測(cè)定方法，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，適用于實(shí)驗(yàn)室大批量綠葉菜樣品的檢測(cè)。需要注意的是，本方法并不適用于所有綠葉菜樣品的測(cè)定；同時(shí)，在新鮮綠葉菜中亞硝酸鹽的含量較低時(shí)，立即檢測(cè)不會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，但是一旦樣品保存時(shí)間過長，或存儲(chǔ)溫度過高，亞硝酸鹽含量便會(huì)在1～2 d內(nèi)增加，那么硝酸鹽含量則會(huì)減少，最終便會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度[3]。因此，新鮮蔬菜在采樣后要盡快進(jìn)行測(cè)定，若當(dāng)天不能完成檢測(cè)，須將其置于冷凍條件下保存。