水楊酸甲酯及其同分異構(gòu)體的氣質(zhì)聯(lián)用定性分析
——推薦一個啟發(fā)思維的質(zhì)譜實驗

丁玉潔，高曉慧，李昆，蔡熾，陳淑云，彭電，劉浩然,＊

1 湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室，教育部分析化學(xué)課程虛擬教研室，湖南大學(xué)化學(xué)實驗教學(xué)中心，長沙 410082

2 長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，長沙 410605

質(zhì)譜分析是儀器分析中一個重要的組成部分。各高校的質(zhì)譜分析實驗?zāi)康母鞑幌嗤O(shè)計各有特色。有的采用氣質(zhì)聯(lián)用或液質(zhì)聯(lián)用檢測混合物[1,2]；有的采用基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜檢測蛋白質(zhì)或其他高分子[3,4]；有的則把質(zhì)譜作為制備化合物的一個檢測手段用來驗證結(jié)構(gòu)[5]；有的只是用質(zhì)譜儀檢測簡單化合物，注重儀器操作而不是解析[6]。

在課程設(shè)置上，有的學(xué)校是將質(zhì)譜實驗作為波譜分析實驗的一部分，也有的學(xué)校將質(zhì)譜實驗作為專業(yè)實驗或綜合實驗來開設(shè)。由于質(zhì)譜昂貴、復(fù)雜，實驗中能讓學(xué)生親自動手的機會不多，而質(zhì)譜解析現(xiàn)在大多是通過計算機搜索譜庫來完成。由此，在很多質(zhì)譜實驗中學(xué)生可能主要是觀摩整個過程，見識一下，參與程度不高。我們認(rèn)為，除了讓學(xué)生熟悉基本的質(zhì)譜操作外，質(zhì)譜的解析對于本科生來說亦是不可或缺的過程，這一過程不能停留在理論課堂上由老師給出幾個圖譜來進行訓(xùn)練，更需要通過實驗來真切地感受，在實驗過程中鞏固理論、提升實驗技能。筆者經(jīng)過多年不斷地摸索、完善，設(shè)計了一個既生動有趣、又能涵蓋眾多質(zhì)譜知識的實驗，對于學(xué)生的質(zhì)譜分析技能、思維均有良好的提升作用。現(xiàn)推薦如下。

1 實驗背景

水楊酸甲酯(1，鄰羥基苯甲酸甲酯)是冬青油的主要成分，也是風(fēng)油精、紅花油等藥物的化學(xué)成分之一[7,8]。水楊酸甲酯同分異構(gòu)體眾多。我們選擇以下5個生活中常見的異構(gòu)體與之進行對比分析，借以鞏固學(xué)生的質(zhì)譜理論知識，并提升其質(zhì)譜解析的能力。尼泊金甲酯(2)：尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯)是經(jīng)典的防腐劑，在藥品、化妝品用有廣泛的應(yīng)用[9]。間羥基苯甲酸甲酯(3)：間羥基苯甲酸甲酯是水楊酸甲酯及尼泊金甲酯的異構(gòu)體，只是酚羥基的取代位置不同。香蘭素(4)：香蘭素又稱香蘭醛，在藥品、食品中作為香味劑[10]。2,4-二羥基苯乙酮(5)及3,4-二羥基苯乙酮(6)二者是化學(xué)合成中重要的中間體，可作為合成天然產(chǎn)物查耳酮、黃酮的原料[11,12]。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)式

2 實驗?zāi)康?/h2>

(1) 掌握氣質(zhì)聯(lián)用儀的基本操作方法、基本參數(shù)；

(2) 鞏固質(zhì)譜解析的一般方法，熟悉苯環(huán)、酯、酚、醛、甲基、甲氧基等各基團的裂解特征；

(3) 熟悉質(zhì)譜中的重排規(guī)律。

3 實驗材料

3.1 主要試劑

水楊酸甲酯(鄰羥基苯甲酸甲酯)、尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯)、間羥基苯甲酸甲酯、香蘭素、2,4-二羥基苯乙酮、3,4-二羥基苯乙酮，以上均為分析純；甲醇，色譜級。

3.2 主要儀器

TRACE200 POLARIS Q型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國菲尼根公司。

4 實驗方法

4.1 色譜條件

進樣器溫度250 °C，載氣(氦氣)流速1 mL·min?1，起始溫度120 °C，保持3 min，10 °C·min?1程序升溫，升至200 °C，保持2 min。進樣分流比1 : 20。質(zhì)譜條件：傳輸線溫度210 °C，離子源210 °C，質(zhì)荷比掃描范圍35–500m/z，溶劑延遲設(shè)為3 min。

4.2 操作步驟

用色譜級甲醇配制水楊酸甲酯溶液，使?jié)舛瓤刂圃? μg·mL?1左右。用進樣針吸取上述溶液0.1 μL，進樣。記錄總離子流圖、質(zhì)譜圖(“棒圖”)。

5 結(jié)果分析與討論

5.1 基本信息

水楊酸甲酯總離子流圖顯示，其保留時間為4.29 min (圖2上)。質(zhì)譜棒圖顯示，其分子離子峰質(zhì)荷比為152，基峰為120，其余碎片有92，65，39 (圖2下)等。

插穗的生長年限決定其體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)積累和木質(zhì)化程度。1年生莖可能由于生長時間較短，養(yǎng)分存儲不足，加上髓部較大，所含粘液較多而容易腐爛。所以多年生的插穗成活率普遍比1年生莖高，且根系平均長度、根叢數(shù)量、新生幼枝平均長度整體上都比1年生莖的表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。但如果選取過于老化的枝條，其內(nèi)源生長素會逐漸減低，細胞的再生能力也會逐漸降低，所以其生根能力和成活率也會降低，故在實際生產(chǎn)中，小花清風(fēng)藤扦插繁殖建議剪取2～4年生的枝條作為插穗最適宜。

圖2 水楊酸甲酯的質(zhì)譜總離子流圖(上)及質(zhì)譜棒圖(下)

5.2 結(jié)果初步分析

m/z152為最右端的峰，與之相鄰的峰為120，二者相差32，差值在合理范圍內(nèi)，故152為分子離子峰?？赡芎紨?shù)個氮，或不含氮。152到120之間差值為32，一般此為中性片段甲醇[13]。120到92之間質(zhì)荷比相差28，可能為羰基的碎片，也可能是酚類的裂解碎片[13]。m/z92或91一般為取代苯的特征離子。以不含氮考慮，則一般物質(zhì)含碳、氧、氫。計算分子量為152的分子式。如為10個碳原子，則分子式為C10OH16或C10O2，均不合理。如為9個碳原子，則分子式為C9O2H12，不飽度為4；如為8個碳原子，則分子式為C8O3H8，不飽度為5。

經(jīng)過上述綜合分析，學(xué)生一般能推斷出結(jié)構(gòu)為水楊酸甲酯(鄰羥基苯甲酸甲酯)、間羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸甲酯其中之一。但要確定為水楊酸甲酯有較大難度。因為本實驗涉及重排裂解。

5.3 實驗難點、重點討論

此實驗中涉及的第一個知識點是重排裂解，這也是其中的重點和難點。一般教科書重點講述的通常是McLafferty重排(麥?zhǔn)现嘏?。不過此處涉及的重排卻是“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”，只有極少數(shù)教科書提及[14]。其原理是一些含有雜原子取代基的鄰二取代苯常發(fā)生六元環(huán)過渡重排，脫去中性分子碎片。事實上，在水楊酸甲酯這一裂解過程中有兩個途徑(圖3)。除了上述重排裂解之外，仍然存在失去?OCH3自由基的情況[13,15]。因此，在質(zhì)譜棒圖中，m/z120占優(yōu)勢，但也存在m/z121的峰。

圖3 水楊酸甲酯的重排(脫去CH2OH中性分子)與非重排裂解(脫去OCH3自由基)

就“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”這一主題，我們可以拓展一下。類似地，鄰羥基苯甲醇、鄰甲基芐胺、水楊酸、鄰氨基酚及鄰苯二酚在裂解中也會存在芳環(huán)鄰位效應(yīng)[14]，在重排裂解過程中脫去水或氨(圖4)。因此，借助于這一實驗，可直觀認(rèn)識重排裂解，又可鞏固理論知識。對于具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的分子，可推斷出可能發(fā)生的重排。

圖4 具有“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”的幾個化合物

通過上述例子，結(jié)合理論課上的基礎(chǔ)，學(xué)生無需刻板記憶即能基本掌握質(zhì)譜的“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”這一重排裂解規(guī)律，并能運用到其他類似化合物的解析之中，通過實驗“反哺”理論知識。

第二個知識點是酚類的裂解規(guī)律。酚羥基上的氫容易離去重排到芳環(huán)上，隨后發(fā)生α裂解，引起開環(huán)。接著可發(fā)生i斷裂，失去CO，得到[M ? 28]的奇電子碎片離子。也可以再發(fā)生氫重排和置換反應(yīng)，得到[M ? 29]的碎片離子。

第三個知識點是比較常規(guī)的苯環(huán)裂解規(guī)律。m/z77，65，51，39一般為苯環(huán)關(guān)聯(lián)的特征峰。取代苯可能出現(xiàn)m/z91或92的峰，這也是理論及實驗教學(xué)中應(yīng)把握的基本知識點。

雖然隨著科技的發(fā)展，質(zhì)譜的解析主要依靠計算機技術(shù)，極大減少了人工解析的工作量。但面對計算機給出的可能結(jié)構(gòu)式，最終確定結(jié)構(gòu)仍需要人的判斷。因此，對本科生而言在質(zhì)譜解析中鞏固、延伸基礎(chǔ)知識，培養(yǎng)、提升思維能力十分重要。

5.4 與同分異構(gòu)體的對比分析

為加深學(xué)生對“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”知識的理解，并在實驗中鞏固理論知識，我們通過搜索譜庫，找到下述水楊酸甲酯幾個異構(gòu)體的質(zhì)譜圖，進行對比分析。

(1) 對比分析尼泊金甲酯(對羥基苯甲酸甲酯) (圖5A)、間羥基苯甲酸甲酯(圖5B)的質(zhì)譜圖。由于二者的酚羥基沒有處于甲酯的鄰位，不會形成重排。因此，二者沒有m/z120的峰，只有脫去˙OCH3自由基后的m/z121的峰。這一對比可以加深對“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”的理解。

(2) 對比分析香蘭素的質(zhì)譜圖(圖5C)。因香蘭素為醛類，其特點是有較大的[M ? 1]及[M ? 29]的峰。這是醛的特征。較易識別。

(3) 對比分析2，4-二羥基苯乙酮(圖5D)、3，4-二羥基苯乙酮(圖5E)的質(zhì)譜圖。二者的基峰都是脫去甲基后m/z137的峰。前者除基峰以外，其余峰的豐度均非常小。而后者先脫去一分子CO產(chǎn)生一個m/z109的峰，再脫去一分子CO后形成m/z81的峰。

6 教學(xué)思考

本實驗具有以下特點：

(1) 所選化合物均為生活中常見或者具有重要生物活性的物質(zhì)，學(xué)生實驗時倍感親切，能激發(fā)其對專業(yè)的興趣。除上述六種化合物外，有學(xué)生想到生活中常用的樟腦、木糖醇分子量亦為152，也想測一測它們的質(zhì)譜圖。正如科學(xué)家愛因斯坦所言，“興趣是最好的老師”。

(2) 聯(lián)系理論與實驗教學(xué)，啟發(fā)思維。以水楊酸甲酯為中心設(shè)計，通過對其同分異構(gòu)體質(zhì)譜圖的對比，不僅讓學(xué)生掌握了氣質(zhì)聯(lián)用儀的基本操作方法，又鞏固了學(xué)生的質(zhì)譜解析知識，在相互關(guān)聯(lián)的實例中熟悉了苯環(huán)、酯、酚、醛、甲基、甲氧基等各基團的質(zhì)譜裂解特征。特別是對“芳環(huán)鄰位效應(yīng)”這一重排裂解知識加深了認(rèn)識。

(3) 本實驗可培養(yǎng)學(xué)生綜合思維能力，充分調(diào)動學(xué)生的主觀能動性。筆者曾問學(xué)生，“如果用氣質(zhì)聯(lián)用儀測間羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸甲酯，從質(zhì)譜圖上是否能區(qū)分開來？”答曰“非常難”或“不可能”。又問“用什么分析方法容易區(qū)分二者？”答曰“核磁共振”。由此，學(xué)生意識到“尺有所短，寸有所長”的哲學(xué)道理，也更加理解為什么化合物解析通常是四大譜進行綜合解析。

(4) 本實驗學(xué)時、難度靈活可調(diào)。本實驗如果只測定水楊酸甲酯一般2小時內(nèi)可完成。如果要測定多個化合物，學(xué)時可設(shè)置為4學(xué)時。也可以將其中一個化合物作為常規(guī)實驗用，將其他化合物作為未知物進行實驗考核。由于均為同分異構(gòu)體，學(xué)生如果只看分子量而不進行詳細解析并結(jié)合其他方法(紅外、核磁)是難以得到正確答案的。

綜上所述，本實驗?zāi)芴嵘究粕|(zhì)譜分析的思維能力，可推薦為化學(xué)、藥學(xué)、食品等相關(guān)專業(yè)本科生作為實驗項目，亦可作為研究生訓(xùn)練素材。