天然產(chǎn)物山奈酚的聚集誘導發(fā)光特性及在鋁離子檢測中的應用
——推薦一個大學化學綜合實驗

王小青，盧雯，徐莉

南京林業(yè)大學理學院，南京 210037

1 概述

隨著熒光探針與熒光顯微技術(shù)的發(fā)展，用熒光成像來示蹤生物體中的金屬離子引起了人們越來越多的研究興趣[1–3]，然而利用該方法來示蹤植物中金屬離子，在本科實驗教學中基本沒有涉及。傳統(tǒng)的化學實驗教學主要以理論驗證和基本操作為培養(yǎng)目標，缺乏對于學生解決實際問題和創(chuàng)新意識等綜合能力的培養(yǎng)。在雙一流建設背景下，在全面提高人才培養(yǎng)質(zhì)量的目標下，以科研反哺教學，與思政協(xié)同育人[4,5]，對于學生的創(chuàng)新意識培養(yǎng)和綜合能力提高具有重要的作用。

山奈酚(Kaempferol，Kae)是從銀杏葉中分離提取的一種黃酮類天然產(chǎn)物分子，已被廣泛研究并被發(fā)現(xiàn)具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌等多種藥理特性。最近的研究表明，該類天然產(chǎn)物分子還可被用于熒光傳感領域[3,6]。大多數(shù)熒光分子通常在稀溶液中強烈發(fā)光，但在聚集狀態(tài)下會遇到不同程度的聚集引起的猝滅效應(Aggregation induced quenching，ACQ)。為了避免ACQ，探針通常被控制在較低的濃度下進行檢測。然而，在熒光傳感和成像過程中，由于光漂白作用，低濃度的探針會導致弱熒光信號和檢測效率降低。聚集誘導發(fā)光(Aggregation induced emission，AIE)已成為解決這一問題的一種普適的策略。AIE生色團(AIEgens)在稀溶液中不發(fā)光，而在聚集狀態(tài)下高效發(fā)光。到目前為止，AIEgens在生物檢測和成像、醫(yī)學診斷和治療領域顯示出巨大的潛力，值得驕傲的是，中國科學家在AIE材料的研究方面一直處于世界領先水平[7,8]。山奈酚的物理和化學特性取決于自身的結(jié)構(gòu)和聚集程度?；谏侥畏拥奶匦裕砂l(fā)展出具有高選擇性、高靈敏度和高穩(wěn)定性的生物成像和檢測手段。以山奈酚聚集體為探針的分析方法，具有簡便、高效、抗光漂白等優(yōu)點，并能應用于實際樣品的檢測與成像。鋁及其化合物被廣泛應用于人類的生產(chǎn)和日常生活中，鋁元素攝入超標可誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病和植物中毒。目前已報道的對Al3+的檢測中，熒光探針法由于其操作簡單、靈敏度高、實時無損等優(yōu)勢而受到了廣泛的關(guān)注。

在本綜合實驗中，向山奈酚的良溶劑溶液中加入不良溶劑，可以觀察到山奈酚溶液由不發(fā)光到發(fā)出藍色熒光，同時伴隨熒光逐漸變強的變化；然后向含山奈酚聚集體的溶液中加入Al3+后，可以觀察到發(fā)出的熒光由藍色變?yōu)樗{綠色；結(jié)合紫外-可見吸收和熒光光譜儀的測試結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，學生可以直觀地了解AIE的特點及其檢測應用，并能夠?qū)W會檢測限的計算方法。同時，通過對比山奈酚與ACQ熒光分子(以羅丹明B為例)在分散和聚集狀態(tài)下的不同熒光性能，學生也可以直觀地了解ACQ的特點。該實驗適合作為化學、材料化學等專業(yè)本科高年級學生的化學綜合實驗。

2 實驗部分

2.1 實驗目的

(1) 了解熒光的基本原理與應用。

(2) 了解AIE與ACQ的區(qū)別。

(3) 掌握紫外-可見吸收和熒光光譜儀的基本操作和圖譜分析。

(4) 掌握檢測限的計算方法。

(5) 加強綠色發(fā)展理念、增強民族自豪感和激發(fā)學習熱情。

2.2 實驗原理

2.2.1 熒光的產(chǎn)生原理

熒光是一種常見的光致發(fā)光現(xiàn)象，具體產(chǎn)生過程如圖1所示[9]。處于基態(tài)(S0)的分子吸收合適能量的光子后，其電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，具有較高能量的激發(fā)態(tài)分子很快以振動馳豫(VR)和內(nèi)轉(zhuǎn)換(IC)的方式釋放出熱量達到單重激發(fā)態(tài)的最低能級(S1)，然后電子直接以輻射衰變釋放出光子的形式返回至基態(tài)的最低能級(S0)，發(fā)出熒光。在某些情況下，如果受激發(fā)分子的電子在激發(fā)態(tài)時經(jīng)系間竄越(ISC)形成三重激發(fā)態(tài)，再經(jīng)過VR達到三重激發(fā)態(tài)的最低能級(T1)，也會伴隨熱量的釋放。其中，振動馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換和系間竄越都屬于非輻射衰變，不利于熒光的產(chǎn)生。

圖1 雅布隆斯基的分子激發(fā)和發(fā)射能級圖

2.2.2 ACQ分子與AIE分子的發(fā)光機制

經(jīng)典的熒光分子一般具有大的π共軛結(jié)構(gòu)，在稀溶液狀態(tài)下發(fā)出較強的熒光，但在高濃度或聚集狀態(tài)下，由于分子之間的π–π堆積作用，使得激發(fā)態(tài)的能量以非輻射衰變的形式消耗掉從而產(chǎn)生聚集誘導熒光猝滅，即ACQ現(xiàn)象。與經(jīng)典的ACQ分子不同的是，AIE熒光分子通常具有“螺旋槳”狀結(jié)構(gòu)。該類分子在溶液中由于取代基繞單鍵的自由旋轉(zhuǎn)消耗了激發(fā)態(tài)能量，從而導致熒光較弱；而在聚集狀態(tài)下，取代基的自由旋轉(zhuǎn)受到阻礙，非輻射衰變被有效抑制，從而使熒光顯著增強。另外，AIE型分子的“螺旋槳”狀分子結(jié)構(gòu)還能夠有效抑制分子間緊密的π–π堆積，從而有利于提高分子聚集體發(fā)光效率。本文中報道的山奈酚分子，亦具有部分“螺旋槳”狀結(jié)構(gòu)[10]，通過碳碳單鍵將苯酚與2,5,7-三羥基色原酮這兩個共軛基團相連接，形成具有AIE特性的熒光分子(圖2)。

圖2 山奈酚的結(jié)構(gòu)圖

2.3 試劑和儀器

本實驗所用試劑與儀器如表1和表2所示。

表1 實驗試劑

表2 實驗儀器

2.4 實驗內(nèi)容

2.4.1 山奈酚與羅丹明B的熒光比較實驗

分別取少量山奈酚和羅丹明B置于載玻片上，在365 nm紫外燈的照射下，觀察兩者的熒光強度。

分別稱取山奈酚和羅丹明B各0.01 g裝入試管中，加入10 mL四氫呋喃，配成溶液。在365 nm紫外燈的照射下，觀察兩者的熒光強度。

2.4.2 山奈酚聚集體的制備

制備山奈酚(3 mmol·L?1)的四氫呋喃(THF)儲備液1.5 mL。用移液管量取100 μL儲備溶液轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中。加入一定量的水和THF，定容至10 mL，得到30 μmol·L?1山奈酚的THF/水溶液，水的體積分數(shù)分別被調(diào)至fw= 0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和99%，以365 nm為激發(fā)波長，測試溶液在375–600 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

2.4.3 山奈酚聚集體的粒徑分布表征

取1 mL山奈酚(30 μmol·L?1)的THF/水溶液(fw= 80%)放入比色皿中，通過粒徑分布測試儀進行表征。

2.4.4 檢測離子的配制和熒光測試

分別將CaCl2、CdCl2、CoCl2、CrCl3、CuCl2、FeCl2、FeCl3、KCl、MgCl2、MnCl2、NaCl、Ni(CH3COO)2、Pb(CH3COO)2、ZnCl2、AlCl3、KBr、NaCl、NaF、KI、H2O2和FeSO4、NaNO2、Na2SO3、Cu(ClO4)2、Na2HPO4、NH?HSO?、CH3COONa固體溶解在適量水中，然后在10 mL的容量瓶中進行定容，配成3 mmol·L?1儲備液。分別取30 μL以上儲備液加入到3 mL Kae (30 μmol·L?1)的H2O/THF(8 : 2，V/V)二元溶液中，以365 nm為激發(fā)波長，測試溶液在375–600 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

2.4.5 紫外滴定測定Kae與Al3+配位比的實驗

分別取0–50 μL (10 μL之前體積梯度為1 μL，10 μL之后體積梯度為5 μL) Al3+儲備液加入到3 mL Kae (30 μmol·L?1)的H2O/THF (8 : 2，V/V)二元溶液中，測試溶液在325–550 nm范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜。

2.4.6 測試檢測限的實驗

分別取0–200 μL (70 μL之前體積梯度為5 μL，70 μL之后體積梯度為50 μL) Al3+儲備液加入到3 mL Kae (30 μmol·L?1)的H2O/THF (8 : 2，V/V)二元溶液中，以365 nm為激發(fā)波長，測試溶液在375–600 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

取3 mL THF/水溶液(fw= 80%)放入4 mL的比色皿中，然后用365 nm激發(fā)波長，測試溶液在375–600 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。重復10次，分別記錄486 nm和421 nm處的熒光強度值，計算兩者的比值然后獲得標準方差σ值，再結(jié)合擬合后線性關(guān)系的斜率，根據(jù)公式DL = 3σ/k計算檢測限。

2.4.7 光穩(wěn)定測試

取3 mL山奈酚(30 μmol·L?1)的THF/水溶液(fw= 80%)放入4 mL的比色皿中，用365 nm的紫外燈進行照射1 h，然后測其熒光光譜。

2.4.8 pH穩(wěn)定性實驗

取適量山奈酚(30 μmol·L?1)的THF/水溶液(fw= 80%)放入小燒杯中，測其pH，在此基礎上用1 mol·L?1鹽酸和1 mol·L?1氫氧化鈉溶液調(diào)pH范圍1–12 (梯度為1)，以365 nm為激發(fā)波長，測試溶液在375–550 nm范圍內(nèi)的熒光光譜，記錄486 nm處的熒光強度值。

取30 μL Al3+儲備液加入到3 mL Kae (30 μmol·L?1)的H2O/THF (8 : 2，V/V)二元溶液中，測其pH，在此基礎上用1 mol·L?1鹽酸和1 mol·L?1氫氧化鈉溶液調(diào)pH范圍1–12 (梯度為1)，以365 nm為激發(fā)波長，測試溶液在375–550 nm范圍內(nèi)的熒光光譜，記錄486 nm處的熒光強度值。

2.4.9 擬南芥根部組織的Al3+成像(演示)

用水洗滌擬南芥根部三次以除去雜質(zhì)。之后，將清洗過的根分別在水中和含Kae (30 μmol·L?1)的THF/水(2 : 8，V/V)溶液中孵育1 h，用365 nm激發(fā)波長的激光共聚焦掃描顯微鏡進行熒光成像。

2.4.10 山奈酚聚集體及與Al3+螯合物的形貌表征(演示)

分別取適量山奈酚(30 μmol·L?1)的THF/水溶液(fw= 80%)以及與加入Al3+后的溶液滴在銅網(wǎng)上，待溶劑揮發(fā)后進行透射電子顯微鏡(TEM)表征。

3 結(jié)果與討論

3.1 山奈酚的AIE特性

山奈酚在THF中表現(xiàn)出良好的溶解性。由于分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)誘導的非輻射衰變，其稀溶液的熒光基本被猝滅。當水作為不良溶劑加入并且其體積含量(fw)增加到50%前，山奈酚的熒光強度幾乎保持不變。當fw達到60%時，觀察到以421 nm為中心的發(fā)射帶，隨著fw增加到80%時，發(fā)射強度急劇增加(圖3a、3b)。動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果表明，此時形成了直徑為180 nm左右的聚集體(圖3c)。當fw超過90%時，由于沉淀的形成，山奈酚的溶液變得渾濁，發(fā)射強度明顯降低。這些結(jié)果表明山奈酚具有AIE特性。另外，山奈酚聚集體表現(xiàn)出優(yōu)異的抗光漂白能力。如圖3d所示，即使在紫外線照射60 min下，fw為80%的山奈酚聚集體的AIE熒光強度也保持不變，表明其具有高度光穩(wěn)定性。

圖3 (a) 山奈酚在不同體積比的水與THF中的熒光發(fā)射譜圖；(b) 隨著水的體積含量變化，山奈酚在421 nm處的熒光強度變化；(c) 山奈酚聚集體的粒徑分布；(d) 山奈酚聚集體的光穩(wěn)定性

3.2 山奈酚聚集體探針的Al3+響應機理

為了了解山奈酚聚集體對Al3+的響應機制，在THF/水二元溶劑(8 : 2，V/V)中進行了紫外滴定實驗。如圖4a所示，隨著Al3+濃度的增加，吸收光譜370 nm處的吸收峰逐漸減小，同時425 nm處產(chǎn)生了一個新的吸收峰。這一結(jié)果表明山奈酚與Al3+發(fā)生反應形成了Kae-Al配合物。從吸光度(425 nm)與Al3+濃度之間的關(guān)系曲線來看，Kae-Al配合物的Kae與Al3+的配位比為3 : 1 (圖4b)，基于上述結(jié)果，聚集的Kae對Al3+的響應機制可能如圖5所示。最初，Kae分子聚集成納米顆粒，分布在THF/水的二元溶劑(8 : 2，V/V)中，由于AIE特性，聚集的Kae發(fā)出強烈的藍色熒光。隨著Al3+的加入，Kae聚集體將與其螯合，并且與Kae聚集物相比發(fā)射波長紅移，發(fā)出藍綠色熒光。從TEM照片可以看出，在THF/水的二元溶劑(8 : 2，V/V)中，Kae分子以及與Al3+形成的螯合物均以聚集體的形式存在。

圖4 (a) 山奈酚聚集體對Al3+的紫外滴定實驗；(b) 425 nm吸光度與Al3+濃度的關(guān)系曲線

圖5 山奈酚聚集體與Al3+的作用機制示意圖

3.3 山奈酚聚集體探針的Al3+響應選擇性和靈敏性

為了研究該探針對Al3+的特異性響應能力，我們考察了其他生物相關(guān)物種對Kae聚集體(THF/水，2 : 8，V/V)的AIE性質(zhì)的影響(圖6a、6b)。加入30 μmol·L?1的Al3+后，在421 nm處的發(fā)射峰明顯減弱，同時在486 nm的發(fā)射峰明顯增加。發(fā)射峰紅移表明Kae和Al3+的絡合作用導致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移增強。I486nm/I421nm的熒光比增加超過12倍，表明Kae聚集體對Al3+顯示出高選擇性。此外，加入30 μmol·L?1的Cu2+、Fe3+、Fe2+或Pb2+后，熒光幾乎被淬滅，Kae對各種其他金屬離子和陰離子的響應幾乎可以忽略不計。

圖6 (a) 探針對Al3+或各種干擾離子響應的熒光光譜和(b) 熒光強度比(I486 nm/I421 nm)；(c) 探針與不同濃度Al3+響應的熒光強度變化；(d) I486 nm/I421 nm比值與Al3+濃度的函數(shù)圖

為了研究Kae聚集體對Al3+響應的靈敏度，我們進行了Al3+的熒光滴定實驗(圖6c)。加入Al3+后，在421 nm處的發(fā)射強度緩慢降低，同時在486 nm處的發(fā)射峰強度緩慢增加。此外，觀察到I486nm/I421nm熒光比和Al3+濃度在5–65 μmol·L?1范圍內(nèi)的呈線性關(guān)系(圖6d)，表明Kae聚集體可以用于定量檢測Al3+。檢出限(DL)是根據(jù)DL = 3σ/k的方程確定的，計算為0.37 μmol·L?1，其中σ為空白樣品10次測量值的標準差，k為滴定實驗中線性方程的斜率。

3.4 酸堿度對Kae聚集體檢測Al3+的影響

為了研究探針在生物酸度條件下的穩(wěn)定性，我們對探針在pH = 1–12的條件下進行了檢測Al3+實驗(圖7)。結(jié)果表明Kae聚集體在pH值6–12范圍內(nèi)熒光穩(wěn)定。加入Al3+后，在pH值4–9范圍內(nèi)，發(fā)射強度明顯增加。值得注意的是，在pH值6–8范圍內(nèi)，Kae-Al的熒光非常穩(wěn)定，表明Kae聚集體在生理條件下對Al3+具有穩(wěn)定的檢測能力。

圖7 探針對Al3+響應的pH穩(wěn)定性

3.5 擬南芥根部組織的Al3+成像

如上所述，當pH在6–8范圍內(nèi)，Kae聚集體對Al3+具有高效的響應特征，這表明該探針可能具備在植物根部環(huán)境檢測Al3+的能力。我們在擬南芥根部進行了Kae聚集體對Al3+成像的能力評估。如圖8所示，首先將根部與水一起孵育1 h，然后利用熒光共聚焦顯微鏡對其成像，發(fā)現(xiàn)在410–450 nm(通道1)范圍內(nèi)不能獲得熒光信號，而在465–600 nm (通道2)范圍內(nèi)可以捕獲擬南芥微弱的自發(fā)熒光；之后，將根部與Kae聚集體溶液再一起孵育1 h，在通道1中可以看到微弱的熒光信號，而在通道2中可以獲得明顯增強的熒光信號。這些結(jié)果表明，Kae聚集體可以有效地實現(xiàn)擬南芥根部Al3+的可視化。

4 實驗教學安排

實驗總學時為16學時，分4次完成。具體安排如下：第一次課，4學時，學生經(jīng)過文獻調(diào)研后匯報熒光產(chǎn)生的原理以及AIE分子的發(fā)光機制；演示如何利用軟件進行作圖。第二次課，4學時，山奈酚與羅丹明B的熒光比較測試，含不同比例四氫呋喃/水溶劑的山奈酚的熒光光譜測試，交叉進行山奈酚聚集體的光穩(wěn)定性測試、聚集體的粒徑分布測試。第三次課，4學時，紫外滴定實驗和熒光滴定實驗、選擇性測試、pH穩(wěn)定性測試。第四次課，4學時，進行擬南芥根部的處理和激光共聚焦顯微鏡成像的觀察、聚集體的TEM測試樣品的制備和形貌表征。

5 結(jié)語

本實驗將前沿和熱點研究與基礎教學相結(jié)合，能夠滿足雙一流建設中人才培養(yǎng)的需求，實驗貼近自然和生活，容易激發(fā)學生的興趣。一方面，學生通過查閱文獻，對天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和應用有一定認識和了解，同時引導學生利用天然產(chǎn)物來解決與自身密切相關(guān)的環(huán)境問題，加強綠色發(fā)展理念；另一方面，通過對AIE提出背景和特點的了解，在拓展學生視野的同時，培養(yǎng)學生提出問題和分析問題的能力，并增強學生民族自豪感和激發(fā)學習的熱情。