研究型分析化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式探究
——以“海藻酸鹽微膠囊的制備、藥物包封及緩控釋分析實(shí)驗(yàn)”為例

胡國(guó)梁，顏鑫灝，陳睿希，劉紅瑜1,,＊，姚奇志1,，李嬌1,，李玲玲1,

1 化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué))，合肥 230026

2 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，合肥 230026

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程分I型、II型二種類(lèi)型。I型實(shí)驗(yàn)是以基本操作、基本技能和基本方法的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練為主，以綜合實(shí)驗(yàn)、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)為輔。II型分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)是以綜合型實(shí)驗(yàn)為主導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?，是在I型實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)學(xué)生的科研能力和創(chuàng)新意識(shí)?！昂Ｔ逅猁}微膠囊的制備、藥物包封及緩控釋分析實(shí)驗(yàn)”是II型分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)中非常典型的一個(gè)研究型實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)教學(xué)中涵蓋了微膠囊形成原理探究、實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)、微膠囊性能表征等科研基本能力的訓(xùn)練[1–5]。對(duì)于提升學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)芰τ蟹浅：玫膸椭?/p>

微膠囊是利用天然或合成高分子材料，將分散的物質(zhì)包裹起來(lái)，形成具有特定幾何結(jié)構(gòu)的微型容器，直徑一般為1–1000 μm。由于微膠囊化可以使芯材與外界隔離，保持物理性質(zhì)(如顏色、溶解性等)，提高穩(wěn)定性，具有物質(zhì)控釋性、釋放靶向性、生物相容性及可降解性等特點(diǎn)，該技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)涵蓋化工、食品、藥物、生物制品、醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域。海藻酸鈉由于與其他物質(zhì)能夠形成良好吸附性能的凝膠而廣受關(guān)注，由于其吸附性，在制備藥物微膠囊中也有十分重要的作用。海藻酸鈉無(wú)毒無(wú)害，擁有腸溶性，能將藥物送入腸道并吸收，并能起到緩釋作用，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，并將藥物濃度控制在一定范圍內(nèi)?？梢岳煤Ｔ逅猁}制備微膠囊，對(duì)藥物具有較好的緩釋效果[6,7]。

1 方法原理

當(dāng)海藻酸鈉遇見(jiàn)二價(jià)陽(yáng)離子或聚陽(yáng)離子時(shí)，會(huì)發(fā)生離子轉(zhuǎn)移，形成既具有強(qiáng)度性能又具有彈性的凝膠(一種介于固態(tài)和液態(tài)之間的狀態(tài))，由此制得海藻酸鹽微膠囊。

在靜電力作用下，海藻酸鈉溶液通過(guò)注射劑擠出針尖，在針尖處形成球狀液面，液面在注射器推動(dòng)下增長(zhǎng)，依次形成月牙形液面、倒錐形液面和細(xì)絲狀液柱，在靜電作用下崩解形成小液滴，當(dāng)液柱的重力(Fg)、注射器推動(dòng)力(Fp)和靜電力(Fe)之和大于表面張力時(shí)，液柱崩解。海藻酸鈉液柱崩解后在自身表面張力作用下變成直徑為d的球形，進(jìn)入含凝膠化鹽氯化鈣溶液中，生成海藻酸鈣凝膠微球。

2 試劑與儀器

2.1 主要試劑

海藻酸鈉、殼聚糖、亞甲基藍(lán)(MB)、冰乙酸、氯化鈣、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，所有試劑均為分析純。

2.2 主要儀器

注射器、移液槍、集熱式磁力攪拌器(德國(guó)IKA)、pHS-3C酸度計(jì)(儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、美譜達(dá)P4分光光度計(jì)(上海美譜達(dá))。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 微膠囊的制備

① 海藻酸鈉-Ca2+微膠囊的制備：先采用注射器將一定濃度的海藻酸鈉溶液(10 mL)注射到3%(海藻酸鈉質(zhì)量對(duì)水體積的百分比)濃度的氯化鈣溶液(10 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。

② 海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的制備：同3.1 ①，但將氯化鈣換為1% (殼聚糖質(zhì)量對(duì)水體積的百分比)殼聚糖。

3.2 緩釋實(shí)驗(yàn)

選擇亞甲基藍(lán)模擬小分子藥物作為緩釋研究對(duì)象。具體方法如下：

① 海藻酸鈉-Ca2+微膠囊做緩釋研究：將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的氯化鈣溶液(10 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。過(guò)濾，然后測(cè)定濾液中MB含量。再將等量的Alg-Ca2+微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測(cè)定MB的含量，做緩釋曲線。

② 海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊做緩釋研究：同3.2 ①，但將氯化鈣換為1%殼聚糖。同樣做緩釋實(shí)驗(yàn)，做緩釋曲線。

4 第一節(jié)課實(shí)驗(yàn)記錄

4.1 海藻酸鈉-CaCl2體系

取海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液各10 mL，制備微膠囊后濾液吸光度：1.354，溶液中亞甲基藍(lán)吸光度隨時(shí)間的變化數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 海藻酸鈉-CaCl2體系吸光度和時(shí)間關(guān)系(以0時(shí)刻作為參比)

4.2 海藻酸鈉-殼聚糖體系

取海藻酸鈉溶液和殼聚糖溶液各10 mL，制備微膠囊后濾液吸光度：0.897，溶液中亞甲基藍(lán)吸光度隨時(shí)間的變化數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 海藻酸鈉-殼聚糖體系吸光度和時(shí)間關(guān)系(以去離子水作為參比)

5 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析

5.1 數(shù)據(jù)處理

海藻酸鈉-CaCl2體系，亞甲基藍(lán)吸光度隨時(shí)間的變化如圖1所示。海藻酸鈉-殼聚糖體系，吸光度隨時(shí)間的變化如圖2所示。

圖1 海藻酸鈉-CaCl2體系吸光度–時(shí)間關(guān)系圖

圖2 海藻酸鈉-殼聚糖體系吸光度–時(shí)間關(guān)系圖

5.2 結(jié)果分析與總結(jié)

對(duì)比兩種體系，最終可以得出海藻酸鈉-殼聚糖體系的緩釋效果更好。海藻酸鈣-CaCl2體系在開(kāi)始時(shí)釋放速度較快，在1 h左右時(shí)釋放較為完全；而海藻酸鈉-殼聚糖體系釋放速度較慢，對(duì)藥物有很好的緩釋效果。

但CaCl2體系制備出的微膠囊結(jié)構(gòu)性能較好，易過(guò)濾，且不發(fā)生破裂，膠囊穩(wěn)定性較強(qiáng)。而殼聚糖體系制備出的微膠囊較軟，易破損。

對(duì)兩種體系的包埋率進(jìn)行對(duì)比，由于海藻酸鈉-殼聚糖體系的濾液吸光度較小，故其包埋率較高，對(duì)藥物的包埋效果更好。

6 第二節(jié)課研究型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施

6.1 實(shí)驗(yàn)思路

考慮到兩種不同體系制備出的微膠囊各有優(yōu)點(diǎn)，因此，綜合性實(shí)驗(yàn)考慮進(jìn)行多元體系的制備，以制備出緩釋性能和穩(wěn)定性能均良好的微膠囊。

經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)，最終決定以一步法和兩步法對(duì)微膠囊進(jìn)行制備[6]，并對(duì)兩個(gè)方法所制備出來(lái)的微膠囊進(jìn)行對(duì)比，得出優(yōu)缺點(diǎn)。同時(shí)，文獻(xiàn)中提到采用葡萄糖作為增塑劑可以提高微膠囊穩(wěn)定性[2]，其效果可能與CaCl2所起到的作用相似，在此進(jìn)行驗(yàn)證。

6.2 實(shí)驗(yàn)方案

6.2.1 一步法制備微膠囊

配制殼聚糖-CaCl2混合溶液，將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的混合溶液(15 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。過(guò)濾，然后測(cè)定濾液中MB含量。再將等量的微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測(cè)定MB的含量，做緩釋曲線。

6.2.2 兩步法制備微膠囊

將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的CaCl2溶液(15 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。過(guò)濾，然后測(cè)定濾液中MB含量。再將等量的海藻酸鈉-Ca2+微膠囊放入一定濃度的殼聚糖溶液(15 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，過(guò)濾。將等量的微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測(cè)定MB的含量，做緩釋曲線。對(duì)比組則先放入殼聚糖溶液中，再放入氯化鈣溶液中，其余步驟均相同。

6.2.3 探究葡萄糖對(duì)海藻酸鈉-殼聚糖體系微膠囊制備的影響

將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的殼聚糖溶液(15 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，使海藻酸鈉液滴成球。過(guò)濾，然后測(cè)定濾液中MB含量。再將等量的微膠囊放入6%葡萄糖溶液(15 mL)中，攪拌數(shù)分鐘，過(guò)濾。將等量的微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測(cè)定MB的含量，做緩釋曲線。

6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

6.3.1 一步法制備微膠囊

制備微膠囊后濾液吸光度：1.047，溶液體積：13.0 mL。

此時(shí)包埋率：

由于理論上該體系藥物釋放符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)，故用單位時(shí)間釋放的藥物量作為釋放效率，在這里用吸光度代替藥物量。

釋放效率：

吸光度與時(shí)間關(guān)系見(jiàn)表3，圖像見(jiàn)圖3，圖4為一步法制得的微膠囊的照片。

圖3 一步法體系吸光度-時(shí)間關(guān)系圖

圖4 一步法體系微膠囊形貌圖

表3 一步法制備微膠囊體系吸光度和時(shí)間關(guān)系(以去離子水作為參比)

結(jié)果分析：計(jì)算得到的包埋率較高，包埋效果良好。從圖4可以看出，微膠囊的形貌較好，穩(wěn)定性較高，且易分離。與海藻酸鈉-CaCl2二元體系相比，緩釋效果明顯提高；與海藻酸鈉-殼聚糖二元體系相比，微膠囊的穩(wěn)定性增強(qiáng)。即一步法將兩種體系的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，所制備出來(lái)的微膠囊穩(wěn)定性和緩釋性均良好，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

6.3.2 兩步法制備微膠囊

1) 先加入至CaCl2溶液，后加入至殼聚糖溶液。

制備微膠囊后濾液吸光度及溶液體積分別為：0.585、8 mL；0.764、10 mL。

包埋率：

釋放效率

吸光度與時(shí)間關(guān)系見(jiàn)表4，圖像見(jiàn)圖5，圖6為該方法制得的微膠囊的照片。

圖5 兩步法體系(先加至CaCl2溶液后加至殼聚糖溶液)吸光度–時(shí)間關(guān)系圖

圖6 兩步法體系(先加至CaCl2溶液后加至殼聚糖溶液)微膠囊形貌圖

表4 兩步法制備微膠囊體系(先加至CaCl2溶液后加至殼聚糖溶液)吸光度和時(shí)間關(guān)系(以去離子水作為參比)

2) 先加入至殼聚糖溶液，后加入至CaCl2溶液。

吸光度與時(shí)間關(guān)系見(jiàn)表5，圖像見(jiàn)圖7，圖8為該方法制得的微膠囊的照片。

圖7 兩步法體系(先加至殼聚糖溶液后加至CaCl2溶液)吸光度–時(shí)間關(guān)系圖

圖8 兩步法體系(先加至殼聚糖溶液后加至CaCl2溶液)微膠囊形貌圖

表5 兩步法制備微膠囊體系(先加至殼聚糖溶液后加至CaCl2溶液)吸光度和時(shí)間關(guān)系(以去離子水作為參比)

結(jié)果分析：對(duì)比兩步法制備的兩種微膠囊，可得出溶液的順序會(huì)對(duì)微膠囊的緩釋性能產(chǎn)生較大的影響。兩種順序制備的微膠囊穩(wěn)定性均較強(qiáng)，但緩釋性有所區(qū)別，按照CaCl2-殼聚糖順序制備出來(lái)的微膠囊緩釋性較好，在接近100 min時(shí)緩釋曲線才趨于平緩?？赡苁怯捎贑aCl2-殼聚糖體系中海藻酸鈉液滴先鈣化成球，殼聚糖包裹在求外，起到很好的緩釋效果。

6.3.3 探究葡萄糖對(duì)海藻酸鈉-殼聚糖體系微膠囊制備的影響

本部分最初是打算采用兩步法制備微膠囊，但最后制備出來(lái)的微膠囊放入緩沖溶液中，溶液中出現(xiàn)葡萄糖晶體，對(duì)溶液吸光度測(cè)量產(chǎn)生較大影響(圖9)。

圖9 兩步法制備后溶液渾濁圖像

故采用一步法直接進(jìn)行制備，一步法最后緩釋時(shí)溶液澄清，可以對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如下。

制備微膠囊后濾液吸光度：0.546，溶液體積：11.5 mL。

此時(shí)包埋率：

釋放效率

吸光度與時(shí)間關(guān)系見(jiàn)表6，圖像見(jiàn)圖10。圖11為該方法制得的微膠囊的照片。

圖10 海藻酸鈉-殼聚糖-葡萄糖體系吸光度-時(shí)間關(guān)系圖

圖11 海藻酸鈉-殼聚糖-葡萄糖體系微膠囊形貌圖

表6 海藻酸鈉-殼聚糖體系-葡萄糖體系吸光度和時(shí)間關(guān)系(以去離子水作為參比)

結(jié)果分析：加入葡萄糖后制得的微膠囊顏色為深藍(lán)色，與其余方法制備的微膠囊不同，這應(yīng)該是葡萄糖的影響。在制備過(guò)程中，注意到該微膠囊與不加葡萄糖制得的殼聚糖微膠囊相比，外部覆蓋了一層白色的膜，它有效地遏制了微膠囊的粘連。但最終得到的微膠囊為橢球形，形貌不好。注意到該體系的包埋率較高，遠(yuǎn)高于其他體系，這說(shuō)明加入葡萄糖可有效提高包埋效果；而緩釋效果與采用CaCl2一步法相比較差。兩種體系各有優(yōu)點(diǎn)，但考慮到微膠囊的形貌及穩(wěn)定性，使用CaCl2溶液更好，制備得到的微膠囊更穩(wěn)定。

7 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

(1) 本次實(shí)驗(yàn)先對(duì)二元體系的微膠囊進(jìn)行制備，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈉-CaCl2體系制得的微膠囊穩(wěn)定性較強(qiáng)，緩釋效果較差；海藻酸鈉-殼聚糖體系則相反。因此，在綜合實(shí)驗(yàn)中，對(duì)多元體系進(jìn)行探究，采用一步法和兩步法分別對(duì)微膠囊進(jìn)行制備，同時(shí)還探究葡萄糖對(duì)海藻酸鈉-殼聚糖體系微膠囊制備的影響。經(jīng)過(guò)對(duì)比，兩步法中按照CaCl2-殼聚糖順序制備得到的微膠囊性能最佳。一步法中將CaCl2換為葡萄糖后，包埋效果大大提高，但微膠囊的形貌結(jié)構(gòu)以及緩釋效果并沒(méi)有太大改變。

(2) 對(duì)比三類(lèi)微膠囊的釋放效果，發(fā)現(xiàn)兩步法制備出來(lái)的氯化鈣-殼聚糖微膠囊釋放速度最慢，葡萄糖-殼聚糖微膠囊釋放速度最快，一步法居中，這與緩釋效果一致?？梢钥紤]通過(guò)調(diào)控溶液的pH，以及在合成前對(duì)各組分含量進(jìn)行調(diào)整，從而達(dá)到調(diào)控膠囊壁層厚度及孔隙大小來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)釋放速度和釋放量的調(diào)控，得到效果最佳的微膠囊。

(3) 海藻酸鈉中有非常多羥基基團(tuán)，能夠通過(guò)絡(luò)合作用與鈣離子進(jìn)行絡(luò)合。在絡(luò)合后，海藻酸鈉由于電荷斥力會(huì)迅速分離。而通過(guò)多條海藻酸鈉鏈與多個(gè)鈣離子絡(luò)合，能夠形成交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的微球。而空隙則能夠吸附藥物分子。由于為固體顆粒，海藻酸鈣微球的機(jī)械強(qiáng)度較高，能夠形成尺寸均勻、彈性強(qiáng)的微珠，但由于其表面有許多空隙，緩釋效果較差，且對(duì)藥物的包埋率較低。

(4) 殼聚糖中含有許多胺基。在酸性條件下，胺基會(huì)與氫離子結(jié)合而帶有正電荷。而海藻酸有很多羥基。其中海藻酸鈉中氧原子帶負(fù)電荷。因此海藻酸鈉能夠與殼聚糖通過(guò)靜電作用進(jìn)行結(jié)合。而兩者帶電荷強(qiáng)弱都與pH有關(guān)，殼聚糖的溶解也與酸度有關(guān)，因此pH對(duì)微膠囊的制備十分重要。由于是靜電作用結(jié)合，因此殼聚糖與海藻酸鈉形成的凝膠機(jī)械強(qiáng)度較低，很容易粘連。但具有非常好的緩釋效果。

(5) 結(jié)合二者的優(yōu)點(diǎn)，在含藥物分子的海藻酸鈉與氯化鈣溶液混合時(shí)，會(huì)先形成具有交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣微球。將海藻酸鈣微球放入殼聚糖溶液后，由于海藻酸鈣微球表面會(huì)有海藻酸鈉伸出的羥基，能夠使殼聚糖在海藻酸鈣表面通過(guò)靜電作用形成一層膜，從而得到微膠囊。這樣得到的微膠囊不僅機(jī)械強(qiáng)度高，不易粘連，而且緩釋效果也大大提高了。

8 結(jié)語(yǔ)

該研究型實(shí)驗(yàn)利用兩節(jié)實(shí)驗(yàn)課完成(共16學(xué)時(shí))，第一節(jié)課主要是通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇最佳的微膠囊制備實(shí)驗(yàn)條件，為第二節(jié)課繼續(xù)開(kāi)展探究奠定基礎(chǔ)；第二節(jié)課學(xué)生首先匯報(bào)第一節(jié)課探究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行分組討論，之后基于第一節(jié)課中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題，進(jìn)一步拓展實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，提升微膠囊的緩釋性能。這種研究型教學(xué)方式讓學(xué)生完成了一次小型的科研體驗(yàn)，既鍛煉了學(xué)生的溝通交流能力，又拓展了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路，還提升了學(xué)生的課堂參與積極性，充分增強(qiáng)了課堂教學(xué)效果。