研究型儀器分析實(shí)驗(yàn)：紅酒樣品中多氯聯(lián)苯含量的測定

鄭海嬌，許海，賈瓊

吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春 130012

儀器分析是指采用比較復(fù)雜或特殊的儀器設(shè)備，通過測量物質(zhì)的某些物理或物理化學(xué)性質(zhì)的參數(shù)及其變化來獲取物質(zhì)的化學(xué)組成、成分含量及化學(xué)結(jié)構(gòu)等信息的一類方法。儀器分析實(shí)驗(yàn)為本科化學(xué)專業(yè)及近化學(xué)專業(yè)學(xué)生必修的一門實(shí)驗(yàn)課程[1–3]，它具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、取樣量少、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。在現(xiàn)有的儀器分析實(shí)驗(yàn)中，通常注重儀器操作與樣品分析的流程，或針對單一種類的儀器安排實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，缺少對樣品前處理流程的關(guān)注和不同種類儀器在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中的配合使用，這些缺陷使得儀器分析實(shí)驗(yàn)缺少整體性和綜合性。評價(jià)高等院校人才培養(yǎng)質(zhì)量的重要指標(biāo)是大學(xué)生的實(shí)踐動(dòng)手能力。因此，開展完整性和綜合性較強(qiáng)的儀器分析實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐與思維創(chuàng)新的能力，讓學(xué)生在認(rèn)識儀器組成的同時(shí)熟悉儀器原理與操作，此教學(xué)內(nèi)容的開展十分重要。筆者所在教學(xué)團(tuán)隊(duì)承擔(dān)儀器分析理論課與實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的工作，且多年從事樣品前處理領(lǐng)域的科研工作，尤其在固相微萃取技術(shù)方面取得一系列科研與教學(xué)成果[4–8]。希望通過總結(jié)多年實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，采用參考文獻(xiàn)與實(shí)際研究相結(jié)合的方式，將前沿的科研成果轉(zhuǎn)化成與基礎(chǔ)教學(xué)相匹配的教學(xué)資源，設(shè)計(jì)出具有合理性的同時(shí)適用于本科教學(xué)和實(shí)際應(yīng)用的儀器分析實(shí)驗(yàn)。

作為一類重要的持久性有機(jī)污染物，有機(jī)氯污染物所造成的污染和危害已引起人們的重視。首批列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥摩公約》受控名單的12種持久性有機(jī)污染物中，有9種是有機(jī)氯農(nóng)藥。參考世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)2017年公布的致癌物清單，多氯聯(lián)苯作為有機(jī)氯污染物中的一類，屬于I類致癌物。在我們的生產(chǎn)生活中，如絕緣油、熱載體等多種產(chǎn)品的工業(yè)添加劑的成分中均存在多氯聯(lián)苯。由于多氯聯(lián)苯的性質(zhì)穩(wěn)定，在自然界中很難被分解，導(dǎo)致其在環(huán)境中能長時(shí)間存在，并且會(huì)隨食物鏈進(jìn)入到人體，引發(fā)疾病發(fā)生[9,10]。因此，選用多氯聯(lián)苯作為待測物，在教學(xué)上是有實(shí)際意義的。目前，多氯聯(lián)苯已發(fā)展出多種檢測手段，包括拉曼光譜技術(shù)[11]、光電化學(xué)檢測法[12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)[13,14]、氣相色譜法[15,16]等。其中，氣相色譜法具有靈敏度高、進(jìn)樣量小、準(zhǔn)確度好、耗時(shí)短、適用范圍廣的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于多氯聯(lián)苯的檢測。作為儀器分析實(shí)驗(yàn)中不可或缺的環(huán)節(jié)，樣品前處理可有效減少環(huán)境樣品中存在的大量干擾性雜質(zhì)對分析結(jié)果造成的影響。固相微萃取技術(shù)于20世紀(jì)末由加拿大科學(xué)家Pawliszyn提出，這項(xiàng)技術(shù)通過集成化的萃取流程大大縮短了檢測時(shí)間，其優(yōu)勢有目共睹，在化學(xué)、環(huán)境、醫(yī)學(xué)、食品等學(xué)科中深受重視并推廣應(yīng)用[17]。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

本實(shí)驗(yàn)的主要教學(xué)對象是在學(xué)習(xí)并掌握無機(jī)化學(xué)、有機(jī)化學(xué)和儀器分析理論課及相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上的高等學(xué)?；瘜W(xué)專業(yè)高年級的本科生，通過儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提高學(xué)生綜合運(yùn)用儀器解決實(shí)際問題的動(dòng)手能力和創(chuàng)新能力。實(shí)驗(yàn)安排8學(xué)時(shí)，分為三個(gè)部分，固相微萃取技術(shù)的理論學(xué)習(xí)、儀器分析實(shí)驗(yàn)的理論知識學(xué)習(xí)、實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)處理。主要教學(xué)目的為：

(1) 通過實(shí)際樣品萃取實(shí)驗(yàn)操作學(xué)習(xí)并鞏固樣品前處理知識，讓學(xué)生充分了解儀器分析實(shí)驗(yàn)的全流程；

(2) 通過儀器分析實(shí)驗(yàn)操作學(xué)習(xí)并鞏固色譜理論及光譜理論，使學(xué)生掌握通過不同的儀器處理實(shí)際問題的方法，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力；

(3) 通過儀器分析全流程的實(shí)驗(yàn)演示及操作，具體問題具體處理，培養(yǎng)學(xué)生綜合思考的能力。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要試劑

甲基丙烯丁酸酯(≥ 99.7%)、偶氮二異丁腈(≥ 99.7%)、甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(≥ 99.7%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(≥ 99.7%)、氧化亞銅(≥ 99.5%)、正丙醇(≥ 99.5%)、1,4-丁二醇(≥ 99.5%)、正己烷(≥ 99.5%)、烯丙胺(≥ 99.5%)、β-環(huán)糊精(≥ 99.7%)、對甲苯磺酰氯(≥ 99.5%)及甲醇(≥ 99.5%)、丙酮(≥ 99.5%)等常用試劑采購于天津光復(fù)化學(xué)試劑廠。多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品(PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180，≥ 99.8%)來自于德國Dr. E公司。實(shí)驗(yàn)用超純水經(jīng)過Milli-Q (密理博公司，美國)系統(tǒng)凈化而成。

2.2 主要儀器

Thermo Nicolet 670型紅外光譜儀(賽默飛世爾公司，美國)，Q500型同步熱分析儀(梅特勒托利多公司，美國)，島津2014型氣相色譜儀(島津公司，日本)，氣相色譜柱為HP-1MS型號毛細(xì)管柱，檢測器為電子捕獲檢測器(ECD)，配備量程為10 μL的微量進(jìn)樣器。

2.3 儀器分析條件

氣相色譜實(shí)驗(yàn)條件：進(jìn)樣體積：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 °C；氣化室溫度：320 °C；毛細(xì)管色譜柱柱溫：270 °C；程序升溫：初始溫度設(shè)置50 °C，以10 °C·min?1的速率升溫到250 °C，保持1 min，隨后，以10 °C·min?1的速率升溫到250 °C，保持10 min；進(jìn)樣時(shí)間：0.75 min；壓力：0.17 Mpa，載氣和尾氣：高純氮?dú)猓?.3 mL·min?1和37 mL·min?1。

紅外光譜儀實(shí)驗(yàn)條件：采用KBr壓片法；干燥的試樣量：0.5–2.0 mg；干燥的KBr量：100–200 mg；對照試樣結(jié)構(gòu)對4000–400 cm?1區(qū)域的每一個(gè)峰進(jìn)行歸屬討論。

同步熱分析儀實(shí)驗(yàn)條件：干燥的試樣量：10 mg；溫度設(shè)置：25–800 °C；升溫速率：10 °C·min?1。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品及紅酒樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制：分別稱取7種多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷稀釋至10 mg·L?1并定容于10 mL的棕色容量瓶中，標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液放置于4 °C冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

選用本地超市的紅酒為樣品，取50 mL樣品紅酒加入氯化鈉(2.0 g)、硫酸鈉(2.0 g)和正己烷溶劑(5.0 mL)，以4500 r·min?1的轉(zhuǎn)速離心20 min后取上清液，經(jīng)濾膜過濾后上清液保存至4 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆??？瞻讟悠芳凹訕?biāo)混合液樣品的配制方法如上。

3.2 固相微萃取柱裝置的制備(教師制備，視頻演示)

毛細(xì)管內(nèi)壁的處理：取長度為40 cm的石英毛細(xì)管柱用丙酮、氫氧化鈉(1.0 mol·L?1)、鹽酸(1.0 mol·L?1)、高純水和丙酮依次沖洗30 min后用氮?dú)獯蹈擅?xì)管管壁。丙酮與甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷的混合液通入干燥的毛細(xì)管內(nèi)，將毛細(xì)管兩端的開口用硅膠塞封閉，在恒溫的50 °C水浴中反應(yīng)14 h。用丙酮沖洗冷卻至室溫后的毛細(xì)管柱，用氮吹法去除未反應(yīng)的試劑。

改性劑的制備：制備過程見圖1a。首先，以堿法反應(yīng)通過β-環(huán)糊精與對甲苯磺酰氯(p-TsCl)和烯丙胺溶劑合成6位取代的烯丙基β-環(huán)糊精。隨后，將烯丙基β-環(huán)糊精和氧化亞銅堿性溶液在室溫下混合后置于在水浴反應(yīng)器中連續(xù)反應(yīng)2 h，過濾清洗后的物質(zhì)經(jīng)60 °C真空烘箱中干燥24 h，得到烯丙基β-環(huán)糊精氧化亞銅改性劑。

圖1 (a) 固相微萃取柱的制備；(b) 萃取過程圖

稱取甲基丙烯丁酸酯(BMA，360 mg)、偶氮二異丁腈(AIBN，4.0 mg)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，240 mg)、正丙醇(610 mg)、1,4-丁二醇(790 mg)及烯丙基β-環(huán)糊精氧化亞銅改性劑(110 mg)作為聚合反應(yīng)液。將聚合反應(yīng)液振蕩20 min混勻，通入氮?dú)?，再將反?yīng)液通入處理后的毛細(xì)管中，在60 °C恒溫水浴中進(jìn)行16 h的反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將未參與反應(yīng)的物質(zhì)用甲醇沖洗除去。將所制備的微萃取柱用兩液混合硬化膠(AB膠)固定在5 mL注射器針?biāo)ㄎ恢?，取代金屬針頭，得到固相微萃取柱裝置。圖2為固相微萃取柱裝置結(jié)構(gòu)。

圖2 固相微萃取柱裝置結(jié)構(gòu)示意圖

在實(shí)際本科生儀器分析實(shí)驗(yàn)中，重點(diǎn)在于讓學(xué)生熟悉儀器表征方法以及采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對多氯聯(lián)苯含量的檢測。實(shí)驗(yàn)所用固相微萃取柱裝置的制備過程由實(shí)驗(yàn)教師先行完成，將錄制完整的合成過程教學(xué)演示視頻作為先導(dǎo)課程，輔助學(xué)生學(xué)習(xí)和鞏固有機(jī)合成方面的知識。

3.3 萃取過程及實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

固相微萃取柱對有機(jī)氯污染物的萃取過程主要包括預(yù)處理、上樣、清洗、洗脫四個(gè)步驟，具體步驟見圖1b。預(yù)處理步驟：吸取0.2 mL甲醇和0.5 mL磷酸緩沖溶液，依次以0.05 mL·min?1的流速?zèng)_洗并活化萃取柱；上樣：吸取1.0 mL的待測樣品溶液以0.1 mL·min?1的流速流過萃取柱；清洗：以與樣品溶液同樣的流速推入0.2 mL的磷酸緩沖溶液；洗脫：以0.05 mL·min?1的流速推入0.1 mL的洗脫液，并在萃取柱的出口處收集洗脫液，以備后續(xù)分析使用。

為了達(dá)到更好的萃取性能，我們優(yōu)化了影響萃取實(shí)驗(yàn)的樣品流速及解吸液流速，樣品及解吸液的流速?zèng)Q定了萃取時(shí)間的長短，決定了固相微萃取柱的柱背壓高低，決定了萃取效率的優(yōu)劣。本實(shí)驗(yàn)選用濃度為10 ng·mL?1的多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品，采用單因素控制變量法，對其進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)最優(yōu)的萃取效果。

4 結(jié)果與討論

4.1 固相微萃取柱的表征

為成功合成確定固相微萃取柱，對所合成的改性劑進(jìn)行紅外光譜的表征，采用KBr紅外壓片法，如圖3所示，圖3a中1365和845 cm?1處出現(xiàn)的峰分別對應(yīng)甲苯磺?；?環(huán)糊精的S＝O和C―H伸縮振動(dòng)峰。在圖3b中，1640、1571和1080 cm?1處出現(xiàn)的紅外峰分別為中間體烯丙基β-環(huán)糊精的C＝C、N―H和C―N的振動(dòng)峰。圖3c中，除了圖3b中的紅外峰，在630 cm?1處新增了一個(gè)屬于O―Cu(I)的紅外吸收峰，以上結(jié)果可以表明烯丙基β-環(huán)糊精-氧化亞銅的成功合成。

圖3 對甲苯磺?；?環(huán)糊精(a)、烯丙基β-環(huán)糊精(b)、烯丙基β-環(huán)糊精-氧化亞銅(c)的紅外譜圖

為了評價(jià)萃取柱的熱穩(wěn)定性能，用細(xì)針將毛細(xì)管萃取柱內(nèi)的材料推出并收集以備熱重分析實(shí)驗(yàn)使用，將收集的萃取柱內(nèi)材料置于樣品室，在室溫下以10 °C·min?1的速率升溫到850 °C，結(jié)果如圖4所示。在250 °C之前材料熱穩(wěn)定性較好，當(dāng)溫度在400–450 °C之間，材料產(chǎn)生明顯的熱失重至質(zhì)量不再損失，表明所制備的萃取柱裝置熱穩(wěn)定性良好，符合萃取實(shí)驗(yàn)所需。

圖4 (甲基丙烯丁酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯-烯丙基β-環(huán)糊精-氧化亞銅)萃取柱的熱失重分析圖

4.2 樣品流速和解吸液流速對萃取效率的影響

本實(shí)驗(yàn)選取1.0 mL樣品量，在樣品流速為0.05–0.2 mL·min?1的范圍內(nèi)，考察不同樣品流速對萃取柱富集多氯聯(lián)苯的富集能力的影響，結(jié)果如圖5a所示，當(dāng)樣品流速從0.05 mL·min?1開始增大時(shí)，氣相色譜圖中目標(biāo)分析物的峰面積隨流速的增大而增大，峰面積在樣品流速為0.1 mL·min?1時(shí)達(dá)到最大，其后峰面積隨流速的增大而減小。之后，采用同樣的控制變量法對解吸液流速進(jìn)行優(yōu)化(圖5b)，選取0.1 mL為解吸液體積，在0.02–0.1 mL·min?1流速的范圍內(nèi)考察解吸效率的變化趨勢。綜合考慮萃取時(shí)間及柱背壓的影響，最終實(shí)驗(yàn)選取0.1和0.05 mL·min?1作為樣品與解吸液流速。

圖5 樣品流(a)速和解吸液流速(b)對萃取效率的影響

4.3 多氯聯(lián)苯的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在最佳的萃取條件下，用固相微萃取柱結(jié)合氣相色譜法對多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分離檢測。在7支10 mL的容量瓶中分別加入10 mg·L?1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.000、0.001、0.010、0.050、0.100、0.250、0.500 mL，加入正己烷溶液定容至10 mL，搖勻。將所配制溶液依次經(jīng)過萃取柱萃取，收集萃取液，用微量進(jìn)樣器吸取1 μL的樣品送入氣相色譜進(jìn)樣口。經(jīng)檢測，本方法檢出的7種多氯聯(lián)苯均線性關(guān)系良好，相關(guān)性系數(shù)(R)達(dá)0.9980以上。圖6為典型的氣相色譜圖。

圖6 七種多氯聯(lián)苯的典型色譜圖

4.4 紅酒樣品中多氯聯(lián)苯含量的測定

紅酒樣品均購于本地超市，讓學(xué)生通過加標(biāo)回收的實(shí)驗(yàn)測定實(shí)際樣品中多氯聯(lián)苯的回收率，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)為向樣品中加入低、高兩種濃度(1.0和10 ng·mL?1)標(biāo)準(zhǔn)的多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果見表1所示。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)

5 教學(xué)實(shí)踐與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)共需用時(shí)5–6 h，采取團(tuán)隊(duì)分工配合的方式完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)開始后，每2人為一組，分為以下五個(gè)步驟展開：(1) 課前預(yù)先觀看教師演示視頻，掌握固相微萃取柱的制備流程，此步驟全部同學(xué)參加；(2) 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解固相微萃取柱的紅外及熱重分析表征流程，了解待測物性質(zhì)，此步驟全部同學(xué)參加；(3) 制定實(shí)驗(yàn)方案并與教師討論，設(shè)計(jì)對照實(shí)驗(yàn)，調(diào)整并優(yōu)化最終實(shí)驗(yàn)方案，此步驟全部同學(xué)參加；(4) 開展實(shí)驗(yàn)：① 第一組同學(xué)配制不同加標(biāo)濃度的樣品，使用氣相色譜儀對影響萃取效率的不同的因素進(jìn)行優(yōu)化并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，② 第二組同學(xué)使用紅外光譜儀對固相微萃取柱內(nèi)固體樣品進(jìn)行表征分析，③ 第三組同學(xué)使用同步熱分析儀對固相微萃取柱內(nèi)固體樣品進(jìn)行表征分析，④ 第四組同學(xué)使用氣相色譜儀對實(shí)際樣品進(jìn)行定量分析；(5) 數(shù)據(jù)分析，并對所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行小組內(nèi)探討，此步驟全部同學(xué)參加。

我們的教學(xué)團(tuán)隊(duì)多年從事儀器分析課程的理論課與實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，與學(xué)生共同探討實(shí)驗(yàn)改進(jìn)方案，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)成果對實(shí)驗(yàn)課程的安排與實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，使用了紅外光譜法和同步熱分析法作為表征手段，通過對樣品前處理技術(shù)的學(xué)習(xí)和利用氣相色譜法對樣品進(jìn)行檢測，既改善了原有實(shí)驗(yàn)課程的單調(diào)性，又提高了實(shí)驗(yàn)課程的趣味性。通過對不同儀器的使用，加深了學(xué)生對儀器性質(zhì)及操作的認(rèn)知；通過固相萃取法結(jié)合氣相色譜檢測的實(shí)驗(yàn)操作，讓學(xué)生了解了儀器分析全流程的操作技術(shù)手段。同時(shí)，在教學(xué)的過程中，教師通過學(xué)生對實(shí)驗(yàn)各步驟的操作，更加綜合地掌握了學(xué)生動(dòng)手實(shí)踐中較為薄弱的環(huán)節(jié)，并對教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，在明顯提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量的同時(shí)，也進(jìn)一步提升了實(shí)驗(yàn)教師的教學(xué)業(yè)務(wù)水平。