原核表達(dá)的褐黃血蜱唾液腺蛋白和鐵蛋白1的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

陳 玲,陳 浩,岳嬋娟,馬 銳,范雪陽(yáng),劉頌蕊*,楊光友*

(1.成都大熊貓繁育研究基地,四川省瀕危野生動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610081;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130)

蜱是一種常見的動(dòng)物體表寄生蟲,也是多種動(dòng)物疾病的傳播媒介,據(jù)估計(jì)在全球范圍內(nèi),蜱和蜱傳疾病每年會(huì)造成220億～300億美元的損失[1]。褐黃血蜱(Haemaphysalisflava)屬于硬蜱科血蜱屬,可寄生在犬、貓、山羊、刺猬、野豬以及鳥類體表[2-5],同時(shí)它也是危害野生大熊貓的優(yōu)勢(shì)蜱種[6]。該蜱在我國(guó)廣泛分布于河南、湖南、湖北、四川、江蘇等地區(qū)[7-8]。據(jù)報(bào)道褐黃血蜱能夠攜帶立克次體(Rickettsiarickettsii)[9]、貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)[10]、埃氏疏螺旋體(Borreliaafzelii)[5]和無(wú)形體(Anaplasma)[11]等諸多病原體,引起宿主或人類感染多種疾病,對(duì)動(dòng)物和人類健康造成極大威脅?；瘜W(xué)防控是控制蜱和蜱傳疾病有效方法,但大量使用化學(xué)藥物可導(dǎo)致耐藥蜱的產(chǎn)生以及環(huán)境的污染問(wèn)題,相比之下抗蜱疫苗更加環(huán)保并且有效減少蜱的數(shù)量,是替代化學(xué)殺蟲劑控制蜱感染和病原傳播的有效方法[12],研究顯示H.flava熱休克蛋白70-b2具有良好的免疫原性,可誘發(fā)體液免疫[13]。

鐵蛋白1(ferritin 1,Fer1)是調(diào)節(jié)蜱體內(nèi)鐵的儲(chǔ)存和釋放來(lái)維持鐵代謝平衡的關(guān)鍵蛋白[14]。AV422蛋白是一種保守蜱唾液腺蛋白,其能在蜱的吸血過(guò)程中起到抑制血液凝固的作用[15]。本研究通過(guò)從褐黃血蜱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中(GSE67247 和GSE69721)篩選出唾液腺蛋白(HfAV422)和鐵蛋白1(HfFer1)兩個(gè)基因進(jìn)行原核表達(dá),通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)重組蛋白的抗蜱效果,為褐黃血蜱的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

褐黃血蜱采自于四川省放牧的山羊體表,經(jīng)分子鑒定為褐黃血蜱[6],并在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心通過(guò)新西蘭兔進(jìn)行傳代繁殖與保種。飽血雌蜱置于裝有濕潤(rùn)棉花的培養(yǎng)皿中,在溫度為26 ℃±1 ℃,相對(duì)濕度為80%±10%的條件下孵育、產(chǎn)卵。卵在21 d左右孵化成幼蜱,經(jīng)14～21 d靜止期后進(jìn)行試驗(yàn)。

22只新西蘭兔(平均體重3 kg±0.2 kg),購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。在試驗(yàn)期間,每只兔獨(dú)籠飼養(yǎng),給予充足的水和食物。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser)購(gòu)自成都福際生物技術(shù)有限公司;T4連接酶、QuickCutTM限制性內(nèi)切酶SacⅠ/XhoⅠ/BamHⅠ/HindⅢ購(gòu)自大連寶生物有限公司;HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;Rabbit IL-2、IL-4和IFN-γ ELISA Kit 試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;中高壓蛋白純化系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Cytiva公司;控溫?fù)u床(HZQ-100)購(gòu)自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 褐黃血蜱總RNA的提取和cDNA合成

將褐黃血蜱饑餓幼蜱按照提取總RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA的提取。以抽提的褐黃血蜱總RNA為模板,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成,將所得產(chǎn)物保存于-80 ℃。

1.4 生物信息學(xué)分析及目的基因擴(kuò)增

從褐黃血蜱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取褐黃血蜱HfFer1和HfAV422的CDs序列,利用生物信息學(xué)分析軟件分別對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。切除信號(hào)肽和跨膜區(qū)后然后利用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1),斜體為保護(hù)性堿基。

表1 HfFer1和HfAV422的序列設(shè)計(jì)

1.5 HfFer1和HfAV422基因的原核表達(dá)、蛋白純化及免疫印跡分析

將陽(yáng)性菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和提取質(zhì)粒,質(zhì)粒用相對(duì)應(yīng)的快切酶進(jìn)行酶切然后進(jìn)行T4連接測(cè)序。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單個(gè)菌落接種于1 L含氨芐抗性的培養(yǎng)液中,37 ℃搖床培養(yǎng)至菌液OD590 nm為0.6后加入誘導(dǎo)劑IPTG(1 mmol·L-1),37 ℃誘導(dǎo)12 h(160 r·min-1),隨后進(jìn)行可溶性分析,取收集的上清和沉淀制樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分析兩種蛋白可溶性表達(dá)情況。用鎳離子親和層析方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。將純化后的蛋白進(jìn)行免疫印跡分析,以1∶100稀釋的褐黃血蜱陽(yáng)性兔血清作為一抗,以1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗。

1.6 重組蛋白免疫保護(hù)性試驗(yàn)

1.6.1 試驗(yàn)分組及免疫程序 將新西蘭兔隨機(jī)分組,皂素對(duì)照組6只,蛋白組每組各8只。頸部皮下注射,相同劑量免疫兩次,間隔14 d(表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和免疫程序

1.6.2 褐黃血蜱幼蜱的感染 在第二次免疫后一周,將褐黃血蜱幼蜱感染于兔耳部。每只兔感染100只幼蜱,為了方便收集飽血幼蜱,每只耳朵固定耳袋,并套上伊麗莎白圈。攻蟲24 h后觀察幼蜱感染情況并且計(jì)數(shù),之后每天觀察并收集飽血幼蜱,并將飽血蜱放入濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿中并在溫度為26 ℃±1 ℃的條件下進(jìn)行蛻皮。對(duì)飽血幼蜱進(jìn)行計(jì)數(shù)、稱重以及觀察其蛻皮情況。

幼蜱的免疫效果是基于Aguirre等[16]描述的方法進(jìn)行計(jì)算:抗幼蜱免疫效果=[1-Ra×Rb]%,Ra代表免疫組平均飽血蜱數(shù)量與對(duì)照組平均飽血蜱數(shù)量的比值,Rb代表免疫組蛻皮率與皂素對(duì)照組蛻皮率的比值。

1.6.3 抗體水平檢測(cè) 在首免前、免疫后每周固定時(shí)間以及攻蟲后一周采集兔血并分離血清,使用間接ELISA方法檢測(cè)IgG抗體水平(蛋白稀釋比1∶100,二抗稀釋比 1∶3 000)。

1.6.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)二免后兔血清進(jìn)行細(xì)胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增

以褐黃血蜱cDNA為模板擴(kuò)增出HfFer1(GenBank No.:OP820815)、HfAV422(GenBank No.:OP820814),擴(kuò)增片段大小分別為525和636 bp(圖1)。

A. 基因HfFer1擴(kuò)增結(jié)果;B. 基因HfAV422擴(kuò)增結(jié)果;M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A. HfFer1 amplication; B. HfAV422 amplication; M. DNA marker

2.2 HfFer1和HfAV422的生物信息學(xué)分析

克隆得到的HfFer1和HfAV422序列翻譯成氨基酸序列與褐黃血蜱湖南株的氨基酸序列比對(duì)存在一定差異,相似度分別為99.43%和96.68%(圖2)。其中HfAV422與美洲花蜱、變異花蜱氨基酸序列相似度較高,均在90%以上;與篦子硬蜱氨基酸序列的相似度較低,為85.99%(圖2A)。HfFer1與長(zhǎng)角血蜱、美洲花蜱氨基酸序列的相似度較高,分別為96.55%和94.15%;而與篦子硬蜱氨基酸序列的相似度較低,為86.47%(圖2B)。

H. flava. 褐黃血蜱;A. americanum. 美洲花蜱;A. variegatum. 變異花蜱;I. ricinus. 篦子硬蜱;H. longicornis.長(zhǎng)角血蜱;紅色長(zhǎng)條塊. α螺旋;綠色箭頭. β折疊;紅色虛線方框. B抗原表位H. flava. Haemaphysalis flava; A. americanum. Amblyomma americanum; A. variegatum. Amblyomma variegatum; I. ricinus. Ixodes ricinus; H. longicornis. Haemaphysalis longicornis; Red rectangle. Alpha helix; Green arrows. Beta fold; Red dashed box. B antigen epitopes

2.3 原核表達(dá)、蛋白純化及免疫印跡

測(cè)序成功后的菌液擴(kuò)培提取質(zhì)粒,然后進(jìn)行雙酶切得到的pMD19-T載體骨架和525 bp的Fer1基因片段、636 bp的AV422基因的目的片段與預(yù)期大小相符(圖3)。

A. HfFer1質(zhì)粒雙酶切;B. HfAV422質(zhì)粒雙酶切;M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker ⅢA. Enzyme digestion of HfFer1 plasmid; B. Enzyme digestion of HfAV422 plasmid; M. DNA Marker Ⅲ

rHfFer1重組蛋白在25 ℃、1 mmol·L-1濃度的IPTG的條件下誘導(dǎo)12 h時(shí)能夠大量表達(dá),并且表現(xiàn)為可溶性表達(dá);rHfAV422重組蛋白在37 ℃、1 mmol·L-1濃度的IPTG的條件下誘導(dǎo)24 h后能夠大量表達(dá),其重組蛋白主要表達(dá)在包涵體中(圖4)。重組蛋白通過(guò)鎳離子親和層析柱純化后,經(jīng)凝膠電泳分離,結(jié)果顯示純化后的蛋白均為單一條帶(圖5)。免疫印跡分析rHfFer1、rHfAV422均能識(shí)別陽(yáng)性血清,具有良好的免疫反應(yīng)性(圖6)。

M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(ku);1. 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌體裂解物上清;2～4. 菌體裂解物先后溶解于2、4、8 mol·L-1尿素M. Protein molecular weight markers (in ku); 1. Soluble protein; 2-4. Inclusion body in 2, 4, 8 mol·L-1 urea

2.4 rHfAV422和rHfFer1的免疫保護(hù)效果

2.4.1 血清中特異性IgG抗體水平的變化 兩個(gè)免疫組分別免疫接種rHfFer1和rHfAV422后,每周在固定時(shí)間進(jìn)行采血和收集血清。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)血清中的特異性IgG抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。皂素對(duì)照組在免疫前后血清中平均IgG抗體水平一直維持在較低水平。而免疫組在免疫后血清中的平均IgG抗體水平明顯升高,其平均水平顯著高于皂素對(duì)照組的特異性IgG抗體水平(P<0.05),并且在攻蟲后一周的抗體同樣保持較高水平(圖7)。

immunization分別代表第一次和第二次免疫蛋白時(shí)間;Infestation.感染幼蜱的時(shí)間。不同字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05),相同字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異(P>0.05)Immunization: Time of the first and second immunization with vaccine; Infestation. Time of challenge with larvae. There is a statistically significant difference between data labeled with different letters (P<0.05) and there is no statistically significant difference between data labeled with the same letters (P>0.05)

2.4.2 細(xì)胞因子水平分析 rHfFer1免疫組IL-2水平顯著高于皂素對(duì)照組,而IL-4和IFN-γ無(wú)明顯變化;rHfAV422免疫組IL-2和IL-4水平與皂素對(duì)照組存在顯著性差異,IFN-γ無(wú)明顯差異(圖8)。

不同字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05),相同字母標(biāo)注的數(shù)據(jù)間不存在顯著差異(P>0.05)There is a statistically significant difference between data labeled with different letters (P<0.05) and there is no statistically significant difference between data labeled with the same letters (P>0.05)

2.4.3 抗蜱效果分析 從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看rHfFer1免疫組的幼蜱飽血率和蛻皮率(41.13%和54.98%)均明顯低于皂素對(duì)照組(84.25%和80.25%)(P<0.05);rHfAV422免疫組的幼蜱飽血率和蛻皮率(64.78%和63.29%)與皂素對(duì)照組的飽血率和蛻皮率同樣存在顯著性差異(P<0.05)。而兩個(gè)免疫組與皂素對(duì)照組的幼蜱飽血體重均無(wú)明顯差異(表3)。rHfAV422和rHfFer1蛋白的抗蜱效力分別50.00%和68.06%。

表3 免疫 rHfAV422和rHfFer1蛋白對(duì)幼蜱攝食和蛻皮參數(shù)的影響

3 討 論

使用抗蜱疫苗誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)蜱蟲和蜱媒病原體感染的免疫保護(hù)是一種經(jīng)濟(jì)有效的替代方法,它可減少化學(xué)殺蟲劑的使用和耐藥蜱的產(chǎn)生[17-19]?？跪缫呙绲脑O(shè)計(jì)目的不是預(yù)防蜱的感染,而是通過(guò)蜱攝取宿主體內(nèi)的抗體與蜱體內(nèi)靶蛋白相互作用后破壞靶蛋白的功能,從而影響蜱的攝食、蛻皮和繁殖來(lái)控制蜱的數(shù)量[20-21]。早在1995年,Willadsen等[22]報(bào)道從微小扇頭蜱(Rhipicephalusmicroplus)中腸提取出的保護(hù)性抗原Bm86免疫牛后能夠明顯降低牛體表蜱蟲的感染數(shù)量,此后基于此抗原開發(fā)出GARDTM和GavacTM兩款商品化蜱疫苗,在大規(guī)模田間試驗(yàn)中,基于Bm86抗原的疫苗能夠有效降低牛感染微小扇頭蜱(包括耐藥蜱株)的概率,而且還能夠控制血液寄生蟲的感染[23]。不過(guò)Bm86疫苗僅對(duì)微小扇頭蜱和扇頭蜱屬的蜱具有良好的抗蜱效果,對(duì)其他蜱種的防治效果有限。此后,有多種抗原(如絲氨酸蛋白酶抑制劑、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、金屬蛋白酶、4D8等)被證明可用作抗蜱疫苗候選抗原[24]。然而篩選高效且具有交叉保護(hù)作用的抗原仍為今后抗蜱疫苗研發(fā)的主要方向。蜱作為一種專性吸血的體表寄生蟲進(jìn)化出一套特殊的生存機(jī)制,包括能夠長(zhǎng)時(shí)間附著于宿主體表吸血,防止體內(nèi)血液凝固以及長(zhǎng)期儲(chǔ)存中腸內(nèi)血餐等[25]。血餐是蜱的唯一營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,蜱的每一次蛻皮以及雌蜱完成產(chǎn)卵都需要吸食足夠的血液方可完成,而參與蜱吸血相關(guān)生理過(guò)程的基因成為抗蜱疫苗候選抗原的重要來(lái)源。

有研究報(bào)道,長(zhǎng)角血蜱(Haemaphysalislongicornis)甘肅株P(guān)27/30基因的核苷酸序列和氨基酸序列與長(zhǎng)角血蜱日本Okayama株、長(zhǎng)角血蜱四川孤雌生殖株均存在差異,推測(cè)蜱株的地域性分布差異可能導(dǎo)致蟲株之間的氨基酸序列存在一定的差異[26]。在本試驗(yàn)中擴(kuò)增的褐黃血蜱HfFer1和HfAV422基因編碼的氨基酸序列與褐黃血蜱湖南株的相似度分別為99.43%和96.68%,這表明褐黃血蜱四川株與湖南株也存在一定的差異。

鐵蛋白(ferritin)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中,負(fù)責(zé)鐵存儲(chǔ)和運(yùn)輸鐵元素,在維持生物體的中維持鐵的動(dòng)態(tài)平衡起著關(guān)鍵作用[27]。該蛋白主要由24個(gè)亞基組成,折疊成4個(gè)螺旋束后形成1個(gè)近乎球形外殼,并且有1個(gè)可以容納多達(dá)4 000個(gè)鐵原子的巨大空腔[28]。Fer1是一種關(guān)鍵細(xì)胞保護(hù)蛋白,其主要負(fù)責(zé)維持鐵代謝穩(wěn)態(tài)和保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[27]。在蜱中Fer1通過(guò)將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Fe2+轉(zhuǎn)化成Fe3+后儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)以減少Fe2+的氧化毒性,當(dāng)機(jī)體需鐵時(shí)再將Fer1中儲(chǔ)存的鐵釋放出來(lái)[29]。在有關(guān)沉默蜱體內(nèi)Fer1基因的研究中,發(fā)現(xiàn)Fer1基因的沉默能夠降低蜱的攝食、產(chǎn)卵及卵孵化能力,甚至導(dǎo)致飽血蜱死亡[30-32]。同樣,有學(xué)者對(duì)兔免疫長(zhǎng)角血蜱(H.longicornis)重組蛋白rHlFer1后,觀察到飽血雌蜱產(chǎn)卵重量明顯降低(降低16%),并且在卵孵化期間部分幼蟲出現(xiàn)死亡[33]。這說(shuō)明Fer1在蜱的吸血過(guò)程和繁殖中起關(guān)鍵作用。在本試驗(yàn)中,接種rHfFer1蛋白后明顯降低了幼蜱的飽血率和蛻皮率,這可能是幼蜱從兔體內(nèi)攝取的Fer1抗體與蟲體體內(nèi)的Fer1發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致幼蜱因氧化應(yīng)激而影響其飽血和蛻皮能力甚至引起死亡。

AV422最初在美洲花蜱體內(nèi)發(fā)現(xiàn),其轉(zhuǎn)錄水平在吸血后7 d的唾液腺中明顯上升,這表明其可能是一種唾液蛋白并且在吸血過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。體外凝血試驗(yàn)顯示,rHfAV422能夠延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APPT)和凝血酶(thrombin time,TT)時(shí)間,從而起到抗凝血作用[34]。美洲花蜱(Amblyommaamericanus)重組蛋白rAamAV422能夠延遲血漿凝固并抑制血小板聚集,并且當(dāng)在沉默AamAV422 mRNA之后,該蜱飽血后的重量顯著降低(約44%)[35],這說(shuō)明AV422在蜱吸血過(guò)程中可能會(huì)干預(yù)多個(gè)凝血步驟而起到抑制血液凝固的作用。在蜱體內(nèi)血餐被消化之前會(huì)以液體的形式在消化道儲(chǔ)存,而血液的凝固可能會(huì)阻止血餐的攝取和消化,因此抗凝作用對(duì)蜱的存活至關(guān)重要[34]。有趣的是,AV422蛋白是蜱蟲體內(nèi)獨(dú)有的一種蛋白,在其它節(jié)肢動(dòng)物和脊柱動(dòng)物體內(nèi)沒有同源物,這可能意味著當(dāng)該蛋白作為疫苗靶向抗原時(shí),對(duì)脊椎動(dòng)物宿主可能不會(huì)產(chǎn)生副作用[35]。AV422蛋白通常會(huì)在蜱吸血過(guò)程中從唾液腺分泌出進(jìn)入宿主體內(nèi),從而引起宿主體液免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)篦子硬蜱(Ixodesricinus)重組蛋白rIrAV422能夠與感染過(guò)網(wǎng)紋革蜱(Dermacentorreticulatus)的大鼠血清和有過(guò)蜱蟲感染史的獵犬和人血清發(fā)生交叉反應(yīng),表明AV422具備交叉免疫反應(yīng)性特征[35-37]。在本研究中,作者發(fā)現(xiàn)rHfAV422蛋白免疫實(shí)驗(yàn)兔后表現(xiàn)出良好的抗蜱效果,與皂素對(duì)照組飽血率和蛻皮率相比較,免疫組幼蜱的飽血率和蛻皮率更低,說(shuō)明AV422作為一種蜱保護(hù)性抗原,具有開發(fā)為控制不同蜱種的抗蜱疫苗的潛力。

IL-2、IL-4和IFN-γ在宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其中IL-2和IFN-γ主要是由Th1細(xì)胞分泌,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答;IL-4是由Th2細(xì)胞分泌,它可促進(jìn)B細(xì)胞分化和抗體的產(chǎn)生[38]。研究顯示,蜱唾液腺能促進(jìn)IL-4上調(diào)使細(xì)胞因子向Th2型極化[39-40]。蜱在自然感染宿主過(guò)程中主要是引起Th2型免疫反應(yīng)[41-43],其可能是因?yàn)轵缭诙Ｒ拗鲿r(shí)從蜱唾液腺中分泌蛋白進(jìn)入宿主體內(nèi)引起IL-4、IL-10等相關(guān)因子的上調(diào),誘導(dǎo)宿主Th2型免疫反應(yīng)。在璃眼蜱(Hyalomma)rHaa86對(duì)雜交牛的免疫應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)rHaa86體外刺激免疫后不同時(shí)間段的外周血液淋巴細(xì)胞,IFN-γ表達(dá)水平均無(wú)明顯變化,這可能是因?yàn)樵撝亟M蛋白引起了宿主Th2型免疫反應(yīng)[44]。不過(guò)有研究顯示向兔注射重組IL-2后表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗蜱能力,能夠有效降低篦子硬蜱(Ixodesricinus)成蜱的飽血能力以及產(chǎn)卵重量,因此細(xì)胞免疫在蜱的免疫應(yīng)答中同樣扮演重要角色[45]。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示,兩個(gè)免疫組的產(chǎn)生的IFN-γ水平與皂素對(duì)照組無(wú)明顯差異,但I(xiàn)L-2濃度水平與皂素對(duì)照組存在顯著差異,rHfAV422免疫組的IL-4濃度水平與皂素對(duì)照組同樣存在顯著性差異,這表明rHfFer1能夠引起Th1型免疫反應(yīng),而rHfAV422能夠同時(shí)引起Th1型和Th2型免疫反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)原核表達(dá)獲得了rHfFer1和rHfAV422,rHfFer1和rHfAV422兩個(gè)蛋白分別按500 μg劑量對(duì)兔進(jìn)行兩次免疫后產(chǎn)生的抗蜱效率分別為68.06%和50.00%,rHfFer1可引起Th1型免疫反應(yīng),而rHfAV422能夠同時(shí)引起Th1型和Th2型免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果表明這兩個(gè)抗原具有成為抗蜱疫苗候選抗原的潛力。