白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及試驗(yàn)驗(yàn)證

劉元紅,胡玉歡,張 莉,楊萍瑞,胡衛(wèi)東,馬 琪,畢師誠(chéng)*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,重慶 402460;2.西南大學(xué)中獸醫(yī)研究所,重慶 402460)

便秘是一種以便次減少、排便困難、糞便干結(jié)等為主癥的臨床常見(jiàn)腸道疾病[1],在家畜中比較常見(jiàn)[2]。有30%～50%的母豬在妊娠后期及產(chǎn)后會(huì)發(fā)生便秘[3],腸道內(nèi)容物長(zhǎng)時(shí)間聚集,內(nèi)部菌群過(guò)度發(fā)酵,產(chǎn)生大量熱量和氣體導(dǎo)致脹肚,同時(shí)產(chǎn)生大量毒素,引發(fā)子宮炎、乳房炎、陰道炎等[4]。除此之外,便秘還會(huì)延長(zhǎng)母豬分娩時(shí)間導(dǎo)致產(chǎn)出活仔豬數(shù)下降,糞便壓迫產(chǎn)道導(dǎo)致流產(chǎn)、難產(chǎn)[5]。動(dòng)物常用治療便秘的藥物有硫酸鎂等容積性瀉藥、大黃等刺激性瀉藥、液體石蠟等潤(rùn)滑性瀉藥和毛果蕓香堿等神經(jīng)性瀉藥[6]。其中,中藥副作用較小、療效突出,成本相對(duì)較低,應(yīng)用廣泛。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水功效[7],還可以改善胃腸道功能和調(diào)節(jié)免疫[8]。肉蓯蓉有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血和潤(rùn)腸通便等功效[9]。治療便秘常用的藥物組合中,白術(shù)-肉蓯蓉為同現(xiàn)頻次較高的藥對(duì)[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)整合生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)內(nèi)容,以數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)、建模及分析技術(shù)和試驗(yàn)技術(shù)為基礎(chǔ),闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,分析藥物的作用機(jī)制。本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病作用網(wǎng)絡(luò),探討白術(shù)-肉蓯蓉有效成分治療便秘的作用機(jī)制,再通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證白術(shù)-肉蓯蓉治療慢傳輸型便秘的效果,為今后開發(fā)相關(guān)中藥治療便秘提供思路及方向。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)資料與方法

1.1.1 白術(shù)-肉蓯蓉化學(xué)成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)——中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái),在“Herb name”先后輸入“baizhu”、“roucongrong”進(jìn)行檢索;所得結(jié)果按口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18篩選,獲得相關(guān)中藥成分。然后在“Related Targets”下的“targets infomation”查詢成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白,導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢蛋白的基因名稱,并將基因名標(biāo)準(zhǔn)化。

1.1.2 便秘相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及藥物成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖繪制 分別在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以關(guān)鍵詞“constipation”檢索,收集便秘相關(guān)的靶點(diǎn)基因,整理后導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)將基因名標(biāo)準(zhǔn)化;利用Excel中的刪除重復(fù)項(xiàng)功能對(duì)白術(shù)和肉蓯蓉的有效成分作用靶點(diǎn)及便秘相關(guān)靶點(diǎn)去重,然后將所得靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0,構(gòu)建“白術(shù)與便秘靶點(diǎn)”、“肉蓯蓉與便秘靶點(diǎn)”以及“白術(shù)-肉蓯蓉與便秘靶點(diǎn)”的韋恩圖。選擇“白術(shù)-肉蓯蓉與便秘靶點(diǎn)”的韋恩圖中交叉部分,通過(guò)“Results”中獲得的交集靶點(diǎn)及有效成分靶點(diǎn)的Mol ID建立network和tape文件,導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建白術(shù)-肉蓯蓉有效成分與便秘的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.1.3 藥物成分-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將成分-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的“Multiple proteins”,之后,“Organisms”選擇“Homo sapiens”,進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析?！癝ettings”最低要求交互得分設(shè)為0.4,同時(shí)選擇隱藏網(wǎng)絡(luò)中已斷開的節(jié)點(diǎn),Clusters中集群的數(shù)量設(shè)為3,得到PPI網(wǎng)絡(luò)。將TSV格式數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,利用CentiScaPe 2.2插件對(duì)靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,通過(guò)度中心性(degree)、接近中心性(closeness)和中介中心性(betweenness)三個(gè)參數(shù)篩選大于閾值的數(shù)據(jù),得到靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.4 生物信息學(xué)GO分析及KEGG信號(hào)通路富集分析 將白術(shù)-肉蓯蓉與便秘的公共靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),利用“Shortcut to DAVID Tools”中的“Functional Annotation”進(jìn)行GO(Gene Ontology)的生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)富集分析以及KEGG信號(hào)通路分析。其中,“Select Identifier”選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”,“Select species”選擇“human”,“List Type”選擇“Gene List”。導(dǎo)出結(jié)果篩選P<0.05的數(shù)據(jù),降序排序后通過(guò)在線作圖平臺(tái)——微生信將KEGG前20位制作成富集氣泡圖,GO前10位制作成BP、CC、MF帶顏色富集條形圖。實(shí)現(xiàn)富集分析結(jié)果可視化,綜合預(yù)測(cè)白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的作用機(jī)制。

1.1.5 分子對(duì)接 為驗(yàn)證核心靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性,選擇部分核心靶點(diǎn)與潛在靶點(diǎn)較多的成分進(jìn)行分子對(duì)接。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)下載有效成分的3D結(jié)構(gòu),從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)篩選下載蛋白結(jié)構(gòu)并用PyMOL軟件刪除蛋白的配體和水分子。利用AutoDockTools軟件對(duì)蛋白和小分子進(jìn)一步處理后進(jìn)行分子對(duì)接,選擇結(jié)合較好的部分結(jié)果用PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理。

1.2 動(dòng)物模型試驗(yàn)驗(yàn)證材料與方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)雄性KM小鼠,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。試驗(yàn)動(dòng)物的利用遵照了西南大學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定,倫理審查號(hào):IACUC-20230213-01。

1.2.2 試劑與儀器 鹽酸洛哌丁胺、阿拉伯樹膠,上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):C14425224、C14049325;枸櫞酸莫沙必利,大連美侖生物技術(shù)有限公司,批號(hào):J0618B;白術(shù)、肉蓯蓉飲片購(gòu)自重慶榮昌西城大藥行;電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,型號(hào):BSA224 S-CW;定時(shí)恒溫磁力攪拌器,上海滬西分析儀器廠有限公司,型號(hào):90-2;智能恒溫電熱套,天津工興實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司,型號(hào):ZNHW;活性炭、1 mL注射器、灌胃針和手術(shù)器械等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.3 試驗(yàn)分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將小鼠隨機(jī)分為空白組(6只)和鹽酸洛哌丁胺組(34只)?？瞻捉M蒸餾水灌胃,鹽酸洛哌丁胺組以10.0 mg·kg-1灌胃給藥,前3 d每日1次,第4天開始每日早晚各1次。7 d造模成功后,將30只便秘小鼠隨機(jī)均分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和高、中、低劑量藥物組。晚第二次灌胃蒸餾水和鹽酸洛哌丁胺1 h后,空白組和模型組蒸餾水灌胃,陽(yáng)性對(duì)照組10.0 mg·kg-1枸櫞酸莫沙必利灌胃,高、中、低劑量藥物組分別灌胃4.8,2.4,1.2 g·kg-1的白術(shù)-肉蓯蓉混懸液,連續(xù)7 d,每日1次。灌胃體積均為0.1 mL·10 g-1。給藥劑量參考人和動(dòng)物間藥物等效劑量比值計(jì)算。

1.2.4 排便試驗(yàn) 第7天末次給藥治療后小鼠禁食不禁水飼養(yǎng)24 h,灌胃蒸餾水和鹽酸洛哌丁胺,1 h后空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組與高、中、低劑量藥物組灌胃相應(yīng)溶液。再間隔30 min給各組小鼠灌胃0.3 mL活性炭混懸液,正常飲食飲水,記錄首粒黑便時(shí)間和12 h內(nèi)排便粒數(shù)。

1.2.5 小腸運(yùn)動(dòng)試驗(yàn) 排便試驗(yàn)結(jié)束后小鼠禁食不禁水飼養(yǎng)24 h,各組分別予以上述同樣方法灌胃,30 min后全部小鼠灌胃0.3 mL活性炭混懸液,再間隔30 min處死小鼠。打開腹腔剪取幽門至盲腸的小腸,將其輕拉成直線測(cè)量小腸總長(zhǎng)度及幽門到活性炭混懸液前沿的推進(jìn)長(zhǎng)度,計(jì)算小腸推進(jìn)率=(小腸內(nèi)碳末推進(jìn)距離/小腸總長(zhǎng)度)×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理,組間比較選用單因素ANOVA檢驗(yàn),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示,P<0.05時(shí)表示差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 “白術(shù)”、“肉蓯蓉”化學(xué)成分及靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出白術(shù)-肉蓯蓉所含化合物共130個(gè),其中白術(shù)55個(gè),肉蓯蓉75個(gè)。以DL≥0.18,OB≥30%進(jìn)一步篩選得到白術(shù)7個(gè),包括12-十七?；?2E,8E,10E-蒼術(shù)三醇、α-氨基比林、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、8β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等,肉蓯蓉6個(gè),包括β-谷甾醇、槲皮素、花生四烯酸、細(xì)胞因子等,見(jiàn)表1。除去重復(fù)項(xiàng)及未查詢到的基因,白術(shù)有效成分作用靶點(diǎn)18個(gè),肉蓯蓉有效成分作用靶點(diǎn)158個(gè),將二者合并、除去重復(fù)項(xiàng)后共得到158個(gè)靶點(diǎn)。

表1 白術(shù)-肉蓯蓉有效成分

2.1.2 便秘靶點(diǎn)篩選及藥物-成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 以關(guān)鍵詞“constipation”在各數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,共收集相關(guān)靶點(diǎn)基因1 156個(gè),其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)1 133個(gè)(Relevance score>1篩選)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)7個(gè)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)5個(gè)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)11個(gè),匯總并刪除重復(fù)項(xiàng)后共1 140個(gè)。疾病靶點(diǎn)分別與白術(shù)、肉蓯蓉及白術(shù)-肉蓯蓉藥物成分靶點(diǎn)取交集獲得共同靶點(diǎn),韋恩圖見(jiàn)圖1。將白術(shù)-肉蓯蓉與疾病的交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),含86個(gè)節(jié)點(diǎn)和112條邊。其中,紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表藥物名稱,藍(lán)色橢圓形節(jié)點(diǎn)代表有效成分的Mol ID,綠色方形節(jié)點(diǎn)代表有效成分與疾病共有靶點(diǎn),灰色直線表示節(jié)點(diǎn)間的相互關(guān)系,具體見(jiàn)圖2。其中,PTGS2與9種有效成分連接,為連接度最高的靶點(diǎn)基因,白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘可能通過(guò)調(diào)節(jié)PTGS2起作用。有效成分中,槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮(3β-acetoxyatractylone)、蘇齊內(nèi)酯(suchilactone)和丁香樹脂二甲醚(Yangambin) degree較高,潛在靶點(diǎn)多。

圖1 “藥物成分-便秘”靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of target of " Pharmaceutical Ingredients-Constipation "

圖2 “白術(shù)-肉蓯蓉有效成分-便秘”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Target network of " Active Ingredient of Atractylodes Macrocephala and Cistanche Deserticola-Constipation"

2.1.3 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將白術(shù)-肉蓯蓉有效成分與疾病的71個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)得到PPI網(wǎng)絡(luò),得到靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)圖,節(jié)點(diǎn)代表靶蛋白,邊代表靶蛋白之間的相互作用。其中,邊數(shù)為993,平均節(jié)點(diǎn)度為28,平均局部聚類系數(shù)為0.724。節(jié)點(diǎn)分為相互作用較多的紅色、藍(lán)色、綠色三組,見(jiàn)圖3。繼而將TSV格式數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,數(shù)據(jù)按Degree>28.371、Closeness>0.009、Betweenness>46.343(保留三位小數(shù))篩選,Degree降序排列后得到19個(gè)核心靶點(diǎn),包括Degree值較高的RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase,AKT1)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、細(xì)胞腫瘤抗原 p53(Cellular tumor antigen p53,TP53)等,可能是白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的關(guān)鍵靶點(diǎn),具體結(jié)果見(jiàn)表2。構(gòu)建19個(gè)核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖4。

表2 白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的核心靶點(diǎn)

2.1.4 基因功能和通路富集分析 借助DAVID數(shù)據(jù)庫(kù),將白術(shù)-肉蓯蓉作用于便秘的71個(gè)靶蛋白進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析。結(jié)果表明,共涉及BP 26個(gè)、CC 50個(gè)、MF 72個(gè)、KEGG 24個(gè)。按P<0.05篩選,降序排序后將前10位的GO注釋結(jié)果以及前20位的KEGG通路相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信制圖。其中,BP主要調(diào)節(jié)對(duì)過(guò)氧化氫的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控及脂質(zhì)儲(chǔ)存負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程;CC主要對(duì)孔復(fù)合體、受體復(fù)合物及高爾基體等細(xì)胞組分有顯著作用;MF主要對(duì)氧化還原酶活性,結(jié)合分子氧作用于單個(gè)供體,結(jié)合兩個(gè)氧原子、蛋白酪氨酸激酶激活劑活性及ATP酶結(jié)合等分子功能方面作用顯著。KEGG富集潛在靶基因較多的通路有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化和乙型肝炎、癌癥中的蛋白聚糖和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等,白術(shù)-肉蓯蓉可能通過(guò)這些信號(hào)通路治療便秘。具體結(jié)果見(jiàn)圖5。

MF中“oxidoreductase activity…”全稱為“oxidoreductase activity, acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, incorporation of two atoms of oxygen”The full name for the “oxidoreductase activity…”in MF is “oxidoreductase activity, acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, incorporation of two atoms of oxygen”

2.1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 選擇AKT1、TNF、IL-6和PTGS2基因?qū)?yīng)的靶點(diǎn)蛋白與槲皮素、β-谷甾醇和3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮3個(gè)成分進(jìn)行對(duì)接,結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)合能越低分子間結(jié)合越穩(wěn)固,結(jié)合能<-5 kJ·mol-1時(shí)對(duì)接結(jié)果良好。用PyMOL對(duì)部分對(duì)接活性較好的結(jié)果可視化處理,見(jiàn)圖6。

a. AKT1-槲皮素;b. AKT1-β-谷甾醇;c. TNF-β-谷甾醇;d. IL6-β-谷甾醇;e. IL6-3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮;f. PTGS2-β-谷甾醇a. AKT1-quercetin; b. AKT1-beta-sitosterol; c. TNF-beta-sitosterol; d. IL6-beta-sitosterol; e. IL6-3β-acetoxyatractylone; f. PTGS2-beta-sitosterol

表3 分子對(duì)接結(jié)合能

2.2 白術(shù)-肉蓯蓉對(duì)便秘小鼠的作用

2.2.1 白術(shù)-肉蓯蓉對(duì)便秘小鼠排便情況的影響 由表4可知,與空白組相比,模型組小鼠首粒黑便時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01),12 h排便量顯著減少(P<0.05),表明便秘小鼠造模成功。與模型組首粒黑便時(shí)間相比,高劑量藥物組和陽(yáng)性對(duì)照組極顯著縮短(P<0.01),中劑量藥物組顯著縮短(P<0.05),低劑量藥物組差異不顯著(P>0.05)。與模型組相比,各劑量藥物組與陽(yáng)性對(duì)照組12 h排便量差異均不顯著(P>0.05)。表明中、高劑量白術(shù)-肉蓯蓉混懸液對(duì)小鼠慢傳輸型便秘有改善作用。

表4 白術(shù)-肉蓯蓉對(duì)小鼠排便及小腸運(yùn)動(dòng)情況的影響

2.2.2 白術(shù)-肉蓯蓉對(duì)便秘小鼠小腸運(yùn)動(dòng)情況的影響 由表4可知,與空白組相比,模型組小腸推進(jìn)率顯著降低(P<0.01),表明腸道蠕動(dòng)減弱,鹽酸洛哌丁胺造模成功。與模型組相比,中、高劑量藥物組小腸推進(jìn)率顯著增高(P<0.01),差異極顯著,低劑量藥物組與陽(yáng)性對(duì)照組小腸推進(jìn)率均無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

便秘癥首見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,基本病機(jī)為大腸通降不利,傳導(dǎo)失司[11],是大家畜經(jīng)常出現(xiàn)的一種病例,患病率較高[12]。有關(guān)中藥治療便秘的用藥規(guī)律分析表明,便秘的基本治則為潤(rùn)腸通便,調(diào)暢氣機(jī)促進(jìn)大腸傳導(dǎo)之力,白術(shù)、肉蓯蓉等是用于虛證的藥物組合[13]。由八珍散改制的顆粒劑治療產(chǎn)后便秘豬群有良好效果[14],由肉蓯蓉等10味中草藥配伍而成的復(fù)方制劑可以明顯減輕母豬便秘[15]。王文革等[16]對(duì)慢傳輸型便秘大鼠進(jìn)行研究,結(jié)果表明大劑量生白術(shù)可能通過(guò)促進(jìn)結(jié)腸組織c-kitmRNA表達(dá),修復(fù)結(jié)腸ICC治療便秘。范亞楠等[17]研究發(fā)現(xiàn),肉蓯蓉可以使便秘大鼠糞便粒數(shù)增加,小腸推進(jìn)度提高,有效治療便秘。本研究對(duì)白術(shù)-肉蓯蓉治療慢傳輸型便秘的效果進(jìn)行驗(yàn)證,數(shù)據(jù)表明,中、高劑量白術(shù)-肉蓯蓉可使洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘小鼠首粒黑便時(shí)間顯著縮短,小腸推進(jìn)率顯著增高,證明白術(shù)-肉蓯蓉可以促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng),對(duì)慢傳輸型便秘有明顯改善作用。中醫(yī)認(rèn)為慢傳輸型便秘以本虛標(biāo)實(shí)為主,多以氣虛型為主要證候,虛者補(bǔ)之是主要治則。本文試驗(yàn)僅驗(yàn)證了白術(shù)-肉蓯蓉對(duì)此種便秘證型有治療效果,對(duì)于諸如熱秘、冷秘、陽(yáng)虛秘、陰虛秘等其他型便秘的治療效果,本文未作探究,后續(xù)可設(shè)計(jì)相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。為驗(yàn)證白術(shù)-肉蓯蓉中有效成分治療便秘的準(zhǔn)確性,也可設(shè)計(jì)單純化合物的治療組開展試驗(yàn)。白術(shù)-肉蓯蓉藥作為治療便秘同現(xiàn)頻次較高的藥對(duì),治療便秘的機(jī)制尚不明確。因此,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的機(jī)制進(jìn)行探討。

白術(shù)、肉蓯蓉治療便秘與其成分相關(guān)。白術(shù)含有內(nèi)酯類、揮發(fā)油和多糖等成分,蒼術(shù)酮可以通過(guò)膽堿能受體促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng),白術(shù)內(nèi)酯I能增強(qiáng)唾液淀粉酶活性和調(diào)節(jié)腸道功能[18]。肉蓯蓉含有苯乙醇苷類和多糖等成分,總寡糖和半乳糖醇是通便的藥效物質(zhì)[19]?！鞍仔g(shù)-肉蓯蓉有效成分-便秘”靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明,槲皮素、β-谷甾醇、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、蘇齊內(nèi)酯和丁香樹脂二甲醚等成分潛在靶點(diǎn)較多,其中可能有白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的有效成分。有研究表明,槲皮素可以上調(diào)SIRT 1表達(dá),使NLRP3促炎反應(yīng)活化受到抑制,提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞作用,改善結(jié)腸炎性損傷[20];還可以保護(hù)腸黏膜,恢復(fù)腸道功能,緩解便秘癥狀[21]。研究表明,β-谷甾醇有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎和潤(rùn)腸通便等作用[22-23],能降低結(jié)腸炎小鼠腸道TNF-α、IL-6和IL-1β的水平,增加腸上皮細(xì)胞抗菌肽表達(dá),減輕炎癥對(duì)腸道環(huán)境干擾[24]。3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮是白術(shù)揮發(fā)油中的一種成分。白術(shù)經(jīng)炮制后蒼術(shù)酮含量減少,同時(shí)一部分轉(zhuǎn)化為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ[25]。白術(shù)中的揮發(fā)油成分沒(méi)有產(chǎn)生“燥性”導(dǎo)致機(jī)體津液受損而加重便秘癥狀,可能因?yàn)榘仔g(shù)治療便秘多為湯劑,其燥性部位揮發(fā)油有一定損失,因此在病理情況下白術(shù)仍以發(fā)揮通便作用為主[26]。

由本研究的靶點(diǎn)分析結(jié)果可知,多種有效成分均作用于PTGS2,而AKT1、IL-6和TNF等可能是核心靶點(diǎn),在治療中發(fā)揮主要作用。AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[27],可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控eNOS和NO的合成與分泌,從而調(diào)控腸道功能,治療慢傳輸型便秘[28]。前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS)又稱正環(huán)氧化酶(COX),有PTGS1(cox-1)和PTGS2(cox-2)兩種異構(gòu)酶。COX-2/PGE2是導(dǎo)致梗阻后腸運(yùn)動(dòng)障礙的重要機(jī)制[29]。TNF-α是主要促炎因子,可以引起腸道炎性損傷[30]。IL-6與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,是導(dǎo)致便秘的相關(guān)炎癥因子[31]。TNF-α和IL-6能促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá),從而降解細(xì)胞外基質(zhì),破壞基膜,加重炎性反應(yīng)[32]。

4 結(jié) 論

白術(shù)-肉蓯蓉治療便秘的主要作用機(jī)制可能為多種活性成分通過(guò)PTGS2、AKT1、TNF和IL-6等靶點(diǎn)對(duì)脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎等信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控,從而影響對(duì)過(guò)氧化氫的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、脂質(zhì)儲(chǔ)存負(fù)調(diào)控等過(guò)程。