M1型巨噬細胞來源的外泌體微小RNA-16-5p對心房肌細胞電生理的影響

程燕妮 王學文 曹真 付韞韜 柯元甲 郭珂欣 李雅佳 龍曉建 趙慶彥

近年來研究表明外泌體在心房顫動(簡稱房顫)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。外泌體可通過調節(jié)細胞間的信息交流從而調控基因表達,影響心房重構和房顫的發(fā)生[2]。有研究結果顯示巨噬細胞來源的富含微小RNA(miRNA,miR)的外泌體可調控心肌細胞炎癥反應和電重構等病理過程[3]。miRNA是外泌體介導細胞間信號通訊的重要功能分子。研究發(fā)現(xiàn),miR-16-5p可促進心肌細胞的內(nèi)質網(wǎng)應激和氧化應激,抑制miR-16-5p表達可減少細胞凋亡及炎癥,減輕心肌損傷[4]。既往研究已證實炎癥和房顫的關系密切,臨床和基礎研究均發(fā)現(xiàn)房顫發(fā)生時心房M1型巨噬細胞浸潤明顯增多[5-6]。但M1型巨噬細胞分泌的外泌體miR-16-5p對心肌細胞電重構是否有作用尚不明確。本研究旨在探討M1型巨噬細胞來源的外泌體miR-16-5p對心房肌細胞電生理的影響及潛在機制。

材料與方法

1.材料:RAW264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞系)、HL-1細胞(小鼠心房肌細胞系)均購于武漢Procell實驗室。脂多糖(LPS)購于Sigma公司,中性鞘磷脂酶抑制劑(GW4869,一種外泌體抑制劑)購于MCE公司,轉染試劑Lipofectamine 6000(Lipo6000)、蛋白定量試劑盒(BCA試劑盒)均購于碧云天公司,RNA提取試劑(Trizol)購于TakaRa公司,細胞快速裂解液(RIPA裂解液)、第一鏈cDNA合成試劑盒、蛋白激酶B(AKT)抗體、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購于賽維爾生物科技有限公司,磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體均購于愛博泰克生物科技有限公司,CD81購于三鷹公司,miR-16-5p陰性對照(miR-16-5p NC)、miR-16-5p模擬物(miR-16-5p mimics)及miR-16-5p抑制物(miR-16-5p inhibitor)均由武漢勤達創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

2.方法

(1)巨噬細胞的培養(yǎng)及分組:首先將RAW264.7細胞接種在含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基的大皿中并置于37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng),當細胞增殖至密度達到80%～90%時進行傳代,將細胞分為5組:①LPS組:LPS誘導刺激RAW264.7細胞24 h使其分化為M1型巨噬細胞后不施加任何干預;②miR-16-5p NC組:將miR-16-5p NC轉染RAW264.7細胞后誘導分化;③miR-16-5p mimics組:將miR-16-5p mimics轉染RAW264.7細胞使miR-16-5p過表達,再誘導分化;④miR-16-5p inhibitor組:將miR-16-5p inhibitor轉染RAW264.7細胞抑制miR-16-5p表達,再誘導分化;⑤LPS+GW4869組:RAW264.7細胞經(jīng)LPS誘導完成后,更換新鮮培養(yǎng)基并加入10 μM GW4869繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

(2)巨噬細胞的誘導:將巨噬細胞以1×106個細胞/孔接種于六孔板中,每孔添加LPS(500 ng/ml)刺激24 h分化為M1型巨噬細胞,誘導結束后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1～2次,加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),采用光學顯微鏡觀察巨噬細胞形態(tài)變化,采用免疫熒光觀察未分化組及分化組巨噬細胞標志物小鼠含生長因子樣模體黏液樣激素樣受體(F4/80)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達水平,采用實時熒光PCR(qRT-PCR)檢測M1型巨噬細胞特定表面受體標記物腫瘤壞死因子(TNF)-α和iNOS表達情況。

(3)巨噬細胞轉染miR-16-5p:首先向250 μl的高糖培養(yǎng)基中加入5 μl的lipo6000轉染試劑,輕輕吹打使之混勻,室溫靜置5 min,另向250 μl的高糖培養(yǎng)基中分別加入5 μl miR-16-5p NC/mimics/inhibitor,輕輕吹打混勻,將含有l(wèi)ipo6000的高糖培養(yǎng)基分別與含有miR-16-5p NC/mimics/inhibitor的高糖培養(yǎng)基混合配置成轉染復合物并充分混勻,室溫靜置20 min。將六孔板接種好的細胞更換為無血清培養(yǎng)基,分別將轉染復合物加入對應六孔板的各個孔中,培養(yǎng)4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基,加入LPS誘導為M1型巨噬細胞,繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h。

(4)qRT-PCR檢測:巨噬細胞分別轉染miR-16-5p NC、miR-16-5p mimics、miR-16-5p inhibitor 48 h后,trizol提取總RNA并測定濃度及純度,按照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書操作將其逆轉錄為cDNA,進行定量PCR擴增,以U6為內(nèi)參基因,各引物序列如表1所示。每個樣品均設3個復孔,以2-ΔΔCt法計算miR-16-5p相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

(5)外泌體的提取及鑒定:收取各組細胞上清液,采用超速離心法收集外泌體,4 ℃低溫冷凍離心機中以300 g離心10 min,去除沉淀;2 000 g離心10 min,去除沉淀;10 000 g離心30 min,收集上清液,用濾過膜過濾后,以100 000 g離心2 h,收集沉淀,加入適量PBS重懸。采用透射電鏡法鑒定外泌體,將外泌體重懸液用2.5%戊二醛在4 ℃冰箱固定過夜,將樣本滴置在碳支持膜銅網(wǎng)上3～5 min,濾紙吸掉多余的液體,滴加2%磷鎢酸在碳支持膜銅網(wǎng)上靜置2～3 min,用濾紙吸去多余液體,室溫干燥,透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài),并采集圖像。采用蛋白質免疫印記法(Western blot)檢測外泌體標志蛋白CD81和TSG101。

(6)HL-1細胞快速起搏及分組:采用快速電刺激構建房顫細胞模型,用電烙鐵在培養(yǎng)皿蓋兩側打孔,將滅菌的碳電極(直徑0.5 mm)分別置入兩側孔中,電極一側與培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基接觸,另一端連接刺激系(Master 8以色列),以1.0 V/cm的電壓、10 Hz頻率刺激HL-1細胞48 h建立房顫細胞模型。起搏HL-1細胞分為5組:A組(起搏HL-1細胞+LPS組外泌體)、B組(起搏HL-1細胞+miR-16-5p NC組外泌體)、C組(起搏HL-1細胞+miR-16-5p mimics組外泌體)、D組(起搏HL-1細胞+miR-16-5p inhibitor組外泌體)、E組(起搏HL-1細胞+LPS+GW4869組外泌體)。將提取的各組外泌體與對應分組的HL-1細胞共培養(yǎng)48 h。

(7)全細胞膜片鉗檢測HL-1細胞動作電位:首先用水平電極拉制儀(PB-7,日本Narishige公司)拉伸玻璃電極,從尾部灌充電極內(nèi)液,入水電阻約為4～10 MΩ。在顯微鏡下選取合適細胞后,通過微操縱器將微電極推向細胞并緊貼細胞表面,同時觀測微電極電阻變化,待細胞與微電極形成巨阻封接,破膜后可形成全細胞記錄方式。將膜片鉗設定為電流鉗模式,記錄HL-1細胞動作電位時限,測量復極化達50%和90%的動作電位時限(APD50、APD90)。

(8)Western blot檢測各組心房肌細胞PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達水平:將各組心房肌細胞用PBS清洗1～2次,加入RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法進行蛋白定量。各組等樣上量,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白條帶分離后電轉至硝酸纖維素膜上,室溫下用無血清快速封閉液封閉30 min,洗膜3次,孵育對應一抗過夜,再次洗膜3次,孵育對應二抗,洗膜后使用化學發(fā)光試劑盒進行顯影拍照,采用Image J軟件進行條帶灰度值分析。

結 果

1.M1型巨噬細胞的鑒定:未分化RAW264.7細胞在倒置顯微鏡下為圓形,經(jīng)過LPS誘導為M1型巨噬細胞后,細胞生出偽足,形態(tài)發(fā)生變化。免疫熒光檢測M1型巨噬細胞標記物結果顯示,相對于未分化巨噬細胞,LPS誘導后M1型巨噬細胞特異性標志物熒光強度明顯增高。見圖1。PCR檢測LPS誘導后M1型巨噬細胞表面特異性受體TNF-α和iNOS的mRNA表達水平均高于未分化巨噬細胞(4.79±0.93比1.13±0.07;3.80±0.37比0.98±0.04,P均<0.01)。

圖1 巨噬細胞免疫熒光檢測結果[A～D依次為未分化巨噬細胞的細胞核(DAPI)、F4/80、iNOS、Merge,×400;E～H依次為LPS誘導后M1型巨噬巨噬細胞的DAPI、F4/80、iNOS、Merge,×400,圖H中箭頭所示為M1型巨噬細胞生出偽足]

2.miR-16-5p NC組、miR-16-5p mimics組及miR-16-5p inhibitor組巨噬細胞miR-16-5p相對表達水平比較:miR-16-5p NC組、miR-16-5p mimics組及miR-16-5p inhibitor組巨噬細胞miR-16-5p相對表達水平分別為1.03±0.04、13.92±3.34、0.42±0.05,其中miR-16-5p mimics組高于miR-16-5p NC組(P<0.001),而miR-16-5p inhibitor組低于miR-16-5p NC組(P<0.05)。

3.外泌體的鑒定:各組外泌體呈球狀囊泡樣結構,大小為20～200 nm,見圖2,符合外泌體的形態(tài)特征。各組外泌體采用Western blot檢測其標志蛋白CD81和TSG101表達水平,二者均明顯表達,提取的外泌體可供后續(xù)實驗使用。

圖2 外泌體電鏡圖(×10 000)

4.A組、B組、C組、D組及E組HL-1細胞動作電位比較:A組和B組HL-1細胞APD50和APD90比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);C組HL-1細胞APD50和APD90均短于A組(P<0.05);D組及E組HL-1細胞APD50和APD90均長于A組(P<0.01)。見圖3和表2。

圖3 A組、B組、C組、D組及E組HL-1細胞典型動作電位

表2 A組、B組、C組、D組及E組HL-1細胞動作電位比較

5.A組、B組、C組、D組及E組HL-1細胞相關蛋白表達水平比較:A組和B組HL-1細胞PI3K表達水平、p-AKT/AKT比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);C組HL-1細胞PI3K表達水平、p-AKT/AKT均低于A組(P<0.001);D組及E組HL-1細胞PI3K表達水平、p-AKT/AKT均高于A組(P<0.001);5組HL-1細胞AKT表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 A組、B組、C組、D組及E組HL-1細胞相關蛋白表達水平比較

討 論

心臟不同類型細胞分泌的外泌體通過介導各種信號轉導參與心房重構及炎癥反應,形成房顫發(fā)生的重要病理基質。Li等[7]發(fā)現(xiàn)成纖維細胞來源的外泌體通過降低L型鈣通道Cav1.2蛋白的表達來增加房顫的易感性。Shaihov等[8]發(fā)現(xiàn)心外膜脂肪源性外泌體可縮短多能干細胞源性心肌細胞的動作電位持續(xù)時間,使其發(fā)生電重構。我們前期研究發(fā)現(xiàn),快速心房起搏犬心外膜脂肪組織存在大量促炎型巨噬細胞浸潤,向心外膜脂肪組織注射氯膦酸二鈉脂質體后,心房周圍巨噬細胞浸潤明顯減少,房顫不易誘發(fā),且維持時間縮短[6]。快速心房起搏犬心房組織和靜脈血中外泌體含量升高,靜脈注射外泌體抑制劑可減輕心房纖維化及炎癥反應,降低房顫的易感性[9]。為探討M1型巨噬細胞來源的外泌體對心房肌細胞電生理的影響及具體機制,我們將各組巨噬細胞外泌體與快速起搏心房肌細胞共培養(yǎng)并使用全膜片鉗記錄動作電位,結果發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞來源的外泌體使心房肌細胞動作電位時限明顯縮短,而加入GW4869抑制外泌體分泌使心房肌細胞動作電位時限相對延長。miRNA是外泌體介導細胞間信號通訊的重要功能分子。已有研究表明,M1巨噬細胞來源的外泌體miR-29a介導心肌細胞NOD樣受體熱蛋白結構域蛋白3(NLRP3)的激活[10],而心肌細胞NLRP3的激活可上調Ryanodine受體2(RyR2)的表達,促進肌漿網(wǎng)異常的鈣釋放。Toro等[4]證實miR-16-5p的過表達促進心肌細胞的氧化應激,靶向miR-16-5p可能在內(nèi)質網(wǎng)應激介導的心臟損傷中發(fā)揮心臟保護作用。為進一步研究M1型巨噬細胞外泌體中miR-16-5p對心房肌動作電位的影響,我們通過向巨噬細胞轉染miR-16-5p,發(fā)現(xiàn)miR-16-5p過表達使起搏心房肌細胞動作電位時限縮短,而沉默miR-16-5p基因則使起搏心房肌細胞動作電位時限相對延長,以上結果表明M1型巨噬細胞來源的外泌體miR-16-5p可縮短心房肌細胞動作電位時限。

已有研究證實PI3K是miR-16-5p的直接靶點,miR-16-5p可負向調控PI3K的表達,進而影響其下游蛋白表達,促進細胞自噬和調亡[11-12]。張飛龍等[13]研究發(fā)現(xiàn)下調PI3K/AKT/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路可增加糖尿病大鼠房顫的易感性。Ko等[14]研究發(fā)現(xiàn)快速起搏HL-1細胞中PI3K/Akt信號轉導降低,通過影響心房肌細胞的晚鈉電流參與心肌電重構。本研究分別檢測5組起搏HL-1細胞PI3K及其下游蛋白AKT、p-AKT表達情況,結果顯示miR-16-5p過表達下調PI3K和p-Akt的表達水平,而對細胞中總Akt的影響可忽略不計,使用miR-16-5p抑制物可上調PI3K和p-Akt的表達水平。

綜上所述,M1型巨噬細胞外泌體miR-16-5p可縮短心房肌細胞動作電位時限,可能與抑制PI3K/AKT通路有關。抑制M1型巨噬細胞外泌體分泌或抑制miR-16-5p表達可減緩快速起搏心房肌細胞電重構的發(fā)生,但對電重構相關離子通道是否有影響及具體機制需進一步深入研究。