糖萼組分在不同類型抗中性粒細胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎中的變化及其與疾病活動度的關(guān)系

孫若蘭 陳懌鵬 高鵬麗 邢廣群

抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)性血管炎(AAV)是一組累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病,以全身小血管壞死性炎癥為特征。AAV可導致多個器官組織損傷及功能障礙,嚴重影響患者預后[1-2]。目前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖萼(GCX)與AAV的發(fā)生及發(fā)展有著密切聯(lián)系[3]。GCX是覆蓋在血管內(nèi)皮表面的一層多糖-蛋白質(zhì)復合物,在維持血管通透性、參與凝血和血栓形成、調(diào)節(jié)內(nèi)皮和循環(huán)血細胞之間的相互作用等方面具有重要作用。生理狀態(tài)下GCX是動態(tài)變化的,其合成與降解維持相對穩(wěn)態(tài),在受到炎癥、氧化應激、高血壓等病理刺激下會大量降解脫落[4],失去對內(nèi)皮的保護作用。AAV以血管受累為特征,GCX的破壞反映血管內(nèi)皮損傷程度,其片段脫離血管內(nèi)皮入血,動態(tài)影響循環(huán)中糖鏈含量。但由于糖鏈結(jié)構(gòu)復雜多變、種類繁多,檢測技術(shù)受限,臨床應用困難,且用某一種或幾種多糖代表GCX的損傷程度是不全面的。故本研究采用一種新型PCR酸降解衍生法處理糖鏈,形成的降解單糖通過高效液相色譜法(HPLC)進行定量檢測,通過分析單糖組分,間接反映血清中糖鏈組成的變化,這一技術(shù)稱為“糖指紋”[5]?！疤侵讣y技術(shù)”是青島大學附屬醫(yī)院系統(tǒng)生物學實驗室申請的一種檢測血液中單糖組分的專利技術(shù)(CN20140211976.3、CN201710394424.4、CN201810298226),可簡單快捷地進行血清單糖的定性和定量分析。本研究通過檢測AAV患者血清降解單糖組分的變化,反映血管內(nèi)皮的損傷程度,從GCX損傷的角度探尋AAV的發(fā)病機制及病情變化。

對象與方法

1.對象:2020年6月16日～2021年3月12日于我院就診的AAV患者49例作為AAV組。納入標準:(1)符合Chapel Hill共識會議的AAV診斷標準[6];(2)年齡≥18歲。排除標準:合并乙型肝炎、結(jié)核、惡性腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。納入同期于我院體檢中心進行健康體檢、與AAV組患者性別及年齡完全匹配的健康者53例作為對照組。根據(jù)AAV活動度將AAV患者分為非活動組(BVAS=0分)5例、活動組(1分≤BVAS≤15分)33例及高度活動組(BVAS≥16分)11例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核批準(QYFY WZLL 27037),所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)資料收集:兩組受試者的一般臨床資料(包括性別、年齡、BMI、吸煙史、血壓)和實驗室檢查指標[包括兩組受試者的血中性粒細胞計數(shù)、血RBC計數(shù)、白蛋白(Alb)、血肌酐(SCr)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)、血尿酸(SUA)及AAV組患者24 h尿蛋白定量、Hb、尿RBC計數(shù)、C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)、D-二聚體],采用Cockcroft-Gault公式計算AAV患者估算的腎小球濾過率(eGFR)。采用伯明翰血管炎活動評分(BVAS)2003[7]評估AAV活動度;采用血管炎損傷指數(shù)(VDI)評分評估AAV患者不可逆的慢性損傷。

(2)單糖測定:實驗步驟及方法參照Zhang等[8]的方法進行。首先制備不同濃度的單糖標準品并采用PCR儀輔助酸降解法進行血清的酸降解。將標準品及降解后的每個血清樣品經(jīng)過單糖衍生程序、萃取、離心等,最終取50 μl上清液于棕色上樣瓶內(nèi)保存。隨后用HPLC分析出每種單糖標準品的峰面積并繪制峰面積-濃度標準曲線,將每種單糖各自的峰面積帶入標準曲線后即可得到血清樣品中降解單糖水平。

結(jié) 果

1.AAV組和對照組受試者一般臨床資料及實驗室檢查指標比較:AAV組有吸煙史受試者比例、收縮壓、舒張壓、血中性粒細胞計數(shù)、SCr及SUA水平均高于對照組,血RBC計數(shù)和Alb均低于對照組(P<0.05),而兩組受試者性別、年齡、BMI、LDL-C、TG及FPG水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 AAV組和對照組受試者一般臨床資料及實驗室檢查指標比較[M(P25,P75)]

2.AAV患者的臨床特征:40例(81.6%)患者檢測到MPO-ANCA(MPO-ANCA組),8例(16.3%)患者檢測到蛋白酶3(PR3)-ANCA(PR3-ANCA組),MPO-ANCA組和PR3-ANCA組BVAS比較差異無統(tǒng)計學意義[6.0(2.3,13.8)分比16.5(3.5,20.0)分,Z=-1.400,P=0.161]。1例(2.0%)患者同時檢測到MPO-ANCA和PR3-ANCA,其BVAS為24.0分。39例(79.6%)患者診斷為顯微鏡下多血管炎(MPA,MPA組),9例(18.4%)患者診斷為肉芽腫性多血管炎(GPA,GPA組),MPA組和GPA組BVAS比較差異無統(tǒng)計學意義[6.0(2.0,14.0)分比19.0(4.0,22.0)分,Z=-1.800,P=0.072]。1例(2%)患者診斷為嗜酸性肉芽腫性多血管炎(EGPA),其BVAS為6.0分。49例AAV患者的BVAS為6.0(3.0,15.0)分,VDI評分為(4.38±2.17)分。

3.AAV組和對照組受試者血清降解單糖水平比較:AAV組受試者血清降解巖藻糖(Fuc_de)、降解半乳糖胺(GalN_de)、降解葡萄糖(Glc_de)、降解甘露糖(Man_de)及總血清降解單糖水平均高于對照組(P<0.05),而兩組受試者降解半乳糖(Gal_de)及降解葡萄糖胺(GlcN_de)水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 AAV組和對照組受試者血清降解單糖水平比較[mmol/L,M(P25,P75)]

4.AAV患者血清降解單糖水平與各臨床指標的相關(guān)性:Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,AAV患者血清Fuc_de與血中性粒細胞計數(shù)及ESR均呈負相關(guān),Glc_de、Man_de及總血清降解單糖水平與ESR及CRP均呈正相關(guān)(P<0.05),而其他血清降解單糖水平與其他臨床指標均無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 AAV患者血清降解單糖水平與各臨床指標的Spearman相關(guān)分析結(jié)果

5.MPA組和GPA組患者血清降解單糖水平比較:由于EGPA患者僅1例,因此只比較MPA組和GPA組患者血清降解單糖水平。MPA組患者總血清降解單糖水平高于GPA組(P<0.05),而兩組患者其他血清降解單糖水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 MPA組和GPA組患者血清降解單糖水平比較[mmol/L,M(P25,P75)]

6.MPO-ANCA組和PR3-ANCA組患者血清降解單糖水平比較:MPO-ANCA組患者總血清降解單糖水平高于PR3-ANCA組(P<0.05),而兩組患者其他血清降解單糖水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 MPO-ANCA組和PR3-ANCA組患者血清降解單糖水平比較[mmol/L,M(P25,P75)]

7.不同疾病活動度AAV患者血清降解單糖水平比較:非活動組、活動組及高度活動組AAV患者血清GalN_de水平比較差異有統(tǒng)計學意義,其中高度活動組高于非活動組(P<0.05);而3組AAV患者其他血清降解單糖水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 不同疾病活動度AAV患者血清降解單糖水平比較[mmol/L,M(P25,P75)]

8.不同疾病活動度的MPO-ANCA陽性AAV患者血清降解單糖水平比較:40例MPO-ANCA陽性AAV患者中,非AAV活動患者4例(非活動組),AAV活動患者30例(活動組),AAV高度活動患者6例(高度活動組),3組血清GalN_de水平比較差異有統(tǒng)計學意義,其中高度活動組高于非活動組(P<0.05);而3組其他血清降解單糖水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 不同疾病活動度的MPO-ANCA陽性AAV患者血清降解單糖水平比較[mmol/L,M(P25,P75)]

9.血清GalN_de水平對MPO-ANCA陽性AAV患者疾病高度活動的預測價值:ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清GalN_de水平預測MPO-ANCA陽性AAV疾病高度活動的ROC曲線下面積(AUC)為0.838(95%CI0.695～0.982,P=0.009),當血清GalN_de水平取最佳截斷值0.204 mmol/L時,對應的敏感度為83.3%,特異度為79.4%,具有良好的預測價值。

討 論

本研究結(jié)果顯示,AAV組受試者Fuc_de、GalN_de、Glc_de、Man_de及總血清降解單糖水平均高于對照組,提示AAV患者體內(nèi)存在明顯的GCX破壞與脫落。血管損傷后不僅存在GCX的脫落,也伴隨著GCX的合成,但當損傷嚴重時,其脫落損傷的速率會遠遠大于合成修復的速度,這與AAV的發(fā)病機制有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細胞可不斷感知細胞外環(huán)境并進行自我調(diào)節(jié),但強炎癥刺激下內(nèi)皮細胞會出現(xiàn)活化、調(diào)節(jié)失衡和內(nèi)皮屏障功能喪失,這是全身炎癥期間免疫反應過度的特征標志[9]?；罨膬?nèi)皮特異性巖藻糖基化的表達可促進白細胞與L-選擇素的相互作用進而促進炎癥反應。本研究結(jié)果顯示,AAV患者血清Glc_de、Man_de及總血清降解單糖水平與ESR及CRP均呈正相關(guān),Fuc_de也與ESR存在相關(guān)性。上述研究結(jié)果支持了血管GCX的破壞與機體炎癥狀態(tài)存在密切關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示,MPA組患者總血清降解單糖水平高于GPA組,這與兩種疾病類型的發(fā)病機制有關(guān)。雖然GPA和MPA均可發(fā)生全身小血管的免疫性壞死性血管炎,但GPA常出現(xiàn)壞死性肉芽腫性炎癥,通常累及上呼吸道[10]。MPA最常表現(xiàn)為壞死性血管炎,無肉芽腫形成,血管內(nèi)皮損傷相對嚴重[11]。表明兩種疾病中血管內(nèi)皮GCX的損傷程度不同,再次從血管損傷的角度揭示了二者發(fā)病機制上的差異。

GalN_de是由血清中N-乙酰氨基半乳糖胺水解、乙酰氨基脫落而形成,后者則是構(gòu)成糖胺聚糖中硫酸軟骨素的重復二糖單元之一[12]。本研究結(jié)果顯示,高度活動組AAV患者血清GalN_de水平高于非活動組,提示血清GalN_de水平與AAV疾病活動度相關(guān),AAV疾病高度活動狀態(tài)下,GCX大量脫落和降解,血管內(nèi)皮遭到嚴重破壞。同時,高度活動組MPO-ANCA陽性AAV患者血清GalN_de水平高于非活動組,ROC曲線分析進一步發(fā)現(xiàn)血清GalN_de水平對MPO-ANCA陽性AAV患者疾病高度活動有較好的預測價值。因此,GalN_de有望成為評估AAV疾病活動的潛在生物標志物[13]。

GCX的破壞是AAV患者血管損傷及功能障礙的重要過程,本研究通過對血清糖鏈的單糖組分進行定量分析來反映GCX的改變,對揭示疾病的損傷機制及評估病情具有重要意義。但本研究仍存在不足之處,首先,本研究樣本量少且為單中心研究;其次,本研究局限于橫斷面研究,未進行縱向動態(tài)觀察血清單糖組分與AAV病情發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,后期將會繼續(xù)擴大樣本量并進行前瞻性研究。

綜上,AAV患者血管內(nèi)皮受損和GCX脫落后,血清單糖組分與患者的疾病狀態(tài)密切相關(guān),在揭示AAV發(fā)病機制和評估AAV病情嚴重程度中具有一定作用。