桑葉紅茶二次發(fā)酵工藝優(yōu)化

王一迪，孫 聞，王雅妮， 袁懷波

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601；2.六安玫瑰紅茶品有限公司，安徽六安 237299）

桑葉富含氨基酸、微量元素、礦物質(zhì)，以及黃酮類化合物、生物堿、多糖等活性成分[1]，具有利肝通氣、滋陰補(bǔ)血、疏風(fēng)散熱、降壓、降血糖之功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，1 -脫氧野尻霉素（DNJ）是其主要的降血糖、抗病毒功效成分[3]，桑葉中的多糖和黃酮成分在降血糖方面也有相關(guān)研究[4]。在桑葉紅茶制作中，提高功效成分含量是其重要的關(guān)注點(diǎn)。

食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可利用真菌發(fā)酵，以提高食物功效物質(zhì)含量[5]。試驗(yàn)優(yōu)選棘孢曲霉、日本根霉和青霉菌3 種混合發(fā)酵菌種對(duì)桑葉紅茶進(jìn)行二次發(fā)酵研究，以桑葉紅茶活性成分含量和感官品質(zhì)為指標(biāo)，優(yōu)化桑葉紅茶的發(fā)酵工藝，開發(fā)出保健價(jià)值高、滋味優(yōu)良的桑葉紅茶。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葉，安徽省霍山縣桑園基地提供；棘孢曲霉、日本根霉、青霉菌，泰斯拓生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；脫氧野尻霉素（DNJ）標(biāo)準(zhǔn)品，研生生化試劑有限公司提供；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司提供；葡萄糖，源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV755B 型紫外可見分光光度計(jì)，佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；RE-5299 型旋蒸儀，予華儀器有限公司產(chǎn)品；KH-45AS 型鼓風(fēng)干燥箱，德工機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Waters 1525 HPLC，美國(guó)Waters 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

桑葉→分揀→萎凋→揉捻→解塊→一次發(fā)酵→添加菌懸液→復(fù)揉→二次發(fā)酵→干燥。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）萎凋。選擇頂芽下2、3 位的新鮮桑葉作為原料，28 ℃下熱風(fēng)萎凋6 h。

（2）揉捻。按照輕-重-輕原則，揉捻4 min-13 min-3 min，共揉捻20 min。

（3）一次發(fā)酵。發(fā)酵機(jī)參數(shù)設(shè)置為溫度25 ℃，濕度95%，時(shí)長(zhǎng)2 h。

（4）添加菌懸液。將一定比例的黑曲霉、日本根霉和青霉菌液噴灑于揉捻后的桑葉，邊噴灑邊翻拌均勻。

（5）復(fù)揉。輕揉5～10 min。

（6）二次發(fā)酵。控制合適的溫度、時(shí)長(zhǎng)和菌懸液添加量。

1.3.3 測(cè)定方法

（1）DNJ 的測(cè)定。參考文獻(xiàn)方法[6]，以峰面積為Y 值，DNJ 質(zhì)量濃度（μg/mL）為X 值，得到DNJ 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=15 672X-70 189，R2=0.998 06。

（2）黃酮的測(cè)定。將1.0 g 桑葉粉末加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，超聲水浴提?。囟?0 ℃，超聲功率160 W，超聲時(shí)間15 min）。用75%乙醇定容濾液至100 mL。取濾液1.0 mL，采取AlCl3比色法檢測(cè)[7]。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=6.798 1X+0.004 2，R2=0.993 1。

（3）多糖的測(cè)定。參考苯酚-硫酸法[8]，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為X 值，吸光度為Y 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.005 9X+0.080 9，R2=0.990 6。

（4）多酚的測(cè)定。測(cè)定采取福林酚法[9]，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=1.095 9X-0.017，R2=0.991 3。

（5）化學(xué)鑒定評(píng)分。為避免個(gè)人的主觀偏好影響，采用滋味品質(zhì)的化學(xué)鑒定方法。按照參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行具體操作。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

（1）菌液配方測(cè)試。向100 g 桑葉中分別加入不同配比的1.0×107CFU/100 g 棘孢曲霉、日本根霉和青霉菌液10 mL，于28 ℃條件下二次發(fā)酵3 h 生產(chǎn)紅茶，探究其DNJ、黃酮、多酚、多糖含量的變化。

菌種配比分組見表1。

表1 菌種配比分組

（2）二次發(fā)酵溫度的測(cè)試。分別在25，30，35，40，45 ℃發(fā)酵溫度下，將100 g 桑葉中加入接種量為1.0×107CFU/100 g 的菌懸液（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）10 mL 發(fā)酵3 h 生產(chǎn)紅茶，檢測(cè)滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分。

（3）二次發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)測(cè)試。將100 g 桑葉中加入接種量為1.0×107CFU/100 g 的棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉為2∶1∶1 的菌懸液10 mL，桑葉于25 ℃條件下發(fā)酵一定時(shí)間，分別測(cè)定2，3，4，5，6 h 時(shí)的滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分。

（4）菌懸液用量測(cè)試。將100 g 桑葉中分別加入不同接種量（2×107，3×107，4×107，5×107，6×107CFU/100 g）的混合菌懸液（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉為2∶1∶1）10 mL，于25 ℃條件下發(fā)酵3 h，測(cè)定其滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

為提高桑紅茶的綜合品質(zhì)，對(duì)二次發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)。

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

基礎(chǔ)運(yùn)算采用Excel 方差分析、多重比較采用SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌種配比對(duì)桑紅茶DNJ 含量的影響

分別在不同配比下加入接種量為1.0×107CFU/100 g的棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h 發(fā)酵桑紅茶，測(cè)定DNJ 含量。

菌種配比對(duì)桑紅茶DNJ 含量的影響見圖1。

圖1 菌種配比對(duì)桑紅茶DNJ 含量的影響

由圖1 可知，桑葉中添加不同配比混合菌液發(fā)酵均比自然發(fā)酵的DNJ 含量多，其中E 組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）發(fā)酵的桑紅茶中DNJ 含量可達(dá)到152.1 mg/100 g 干質(zhì)量，比自然發(fā)酵A 組增加11.20%。

2.1.2 菌種配比對(duì)桑紅茶黃酮含量的影響

分別在不同配比下加入107CFU/100 g 棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h 發(fā)酵桑紅茶，探究其黃酮含量的變化。

菌種配比對(duì)桑紅茶黃酮含量的影響見圖2。

圖2 菌種配比對(duì)桑紅茶黃酮含量的影響

由圖2 可知，相比于自然發(fā)酵，B、F、G 組發(fā)酵后的桑紅茶中黃酮含量均降低，C、D、E 組黃酮含量分別增加了1.94%，2.18%，4.13%?？梢?，E組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）最利于桑紅茶中黃酮的產(chǎn)生。

2.1.3 菌種配比對(duì)桑紅茶多糖含量的影響

分別在不同配比下加入107CFU/100g 棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h發(fā)酵桑紅茶，檢測(cè)其多糖含量。

菌種配比對(duì)桑紅茶多糖含量的影響見圖3。

圖3 菌種配比對(duì)桑紅茶多糖含量的影響

由圖3 可知，與自然發(fā)酵比較，添加混合菌種發(fā)酵的桑紅茶中多糖含量均減少，其中D 組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=1∶1∶1）發(fā)酵的桑紅茶中多糖含量分別為12.41 g/100 g 干質(zhì)量，降低幅度最小為3.72%。

2.1.4 菌種配比對(duì)桑紅茶茶多酚含量的影響

分別在不同配比下加入107CFU/100 g 棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h 發(fā)酵桑紅茶，探究其茶多酚含量的變化。

菌種配比對(duì)桑紅茶茶多酚含量的影響見圖4。

圖4 菌種配比對(duì)桑紅茶茶多酚含量的影響

由圖4 可知，與自然發(fā)酵比較，除C、E 組外的其余組別發(fā)酵后均導(dǎo)致茶多酚含量下降；與自然發(fā)酵比較，C、E 組多酚含量分別增加3.28%，6.56%；可見，E 組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）促進(jìn)茶多酚合成的效果最好。

2.1.5 菌種比例選擇結(jié)果

上述研究發(fā)現(xiàn)，棘孢曲霉、青霉、日本根霉配比2 ∶1 ∶1（E 組）發(fā)酵的桑紅茶中DNJ 增加11.2%，多糖降低10.63%，黃酮增加4.13%，多酚增加6.56%，綜合品質(zhì)最好。因此，試驗(yàn)選擇棘孢曲霉、青霉和日本根霉2∶1∶1 作為最佳配比。

2.1.6 二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定評(píng)分的影響

二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定得分的影響見圖5。

圖5 二次發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定得分的影響

由圖5 可知，在發(fā)酵4 h 之前，桑紅茶品質(zhì)化學(xué)鑒定評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間的增加而提高，4 h 時(shí)分值最高，隨后評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間增加而下降。因此，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)優(yōu)化區(qū)間選取3，4，5 h。

2.1.7 二次發(fā)酵溫度對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定評(píng)分的影響

二次發(fā)酵溫度對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定得分的影響見圖6。

圖6 二次發(fā)酵溫度對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定得分的影響

由圖6 可知，發(fā)酵溫度小于30 ℃時(shí)，桑紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分隨發(fā)酵溫度上升而增加。溫度超過(guò)30 ℃后，得分下降。因此，發(fā)酵溫度優(yōu)化區(qū)間選取25，30，35 ℃。

2.1.8 菌接種量對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定評(píng)分的影響

菌種接種量對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定得分的影響見圖7。

圖7 菌種接種量對(duì)桑紅茶化學(xué)鑒定得分的影響

由圖7 可知，桑紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分在總體趨勢(shì)上隨著接種量增加而提高，接種量為6×107CFU/100 g 時(shí)，得分略回落。因此，試驗(yàn)采取的菌種接種量?jī)?yōu)化區(qū)間為3×107，4×107，5×107CFU/100 g。

2.2 各因素交互作用響應(yīng)面分析

發(fā)酵時(shí)間及溫度對(duì)桑葉紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵時(shí)間及溫度對(duì)桑葉紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的影響

由圖8 可知，當(dāng)接種量為4×107CFU/100g 時(shí)，隨著X1的變化，感官評(píng)分出現(xiàn)了一個(gè)較大曲面的弧度，其影響作用要大于X2。在發(fā)酵時(shí)間一定的情況下，隨著溫度的提升，發(fā)酵桑紅茶的滋味品質(zhì)得分呈現(xiàn)先增后減態(tài)勢(shì)。發(fā)酵溫度大于30 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，桑紅茶的得分減小，推測(cè)復(fù)合菌種生長(zhǎng)的最適溫度為30 ℃。

發(fā)酵溫度和接種量對(duì)桑葉紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的影響見圖9。

圖9 發(fā)酵溫度和接種量對(duì)桑葉紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的影響

由圖9 可知，發(fā)酵4 h 時(shí)，發(fā)酵溫度和菌種接種量的協(xié)同作用對(duì)桑紅茶的滋味品質(zhì)得分起顯著影響。隨著X1的變化，感官評(píng)分的變化曲線較為陡峭，其影響作用要大于X2。這也印證了發(fā)酵溫度是3 個(gè)因子中對(duì)響應(yīng)值影響作用最顯著的因子。隨著接種量增加，發(fā)酵桑紅茶的滋味品質(zhì)得分先增后降。接種量大于4×107CFU/100 g 時(shí)，菌接種量的增加引起桑紅茶得分下降，這可能是菌種繁殖代謝過(guò)強(qiáng)，大量桑葉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味成分被分解利用。

發(fā)酵時(shí)間和接種量交互作用對(duì)桑紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的影響見圖10。

圖10 發(fā)酵時(shí)間和接種量交互作用對(duì)桑紅茶滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的影響

由圖10 可知，接種量和發(fā)酵時(shí)間2 個(gè)因素與響應(yīng)值之間呈拋物線關(guān)系，但Y 值隨因素變化的趨勢(shì)略緩。當(dāng)發(fā)酵溫度為29.729 7 ℃時(shí)，若發(fā)酵時(shí)間大于4.9 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分出現(xiàn)降低趨勢(shì)。

2.3 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面Box-behnken 試驗(yàn)方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面Box-behnken 試驗(yàn)方案與結(jié)果

采用Design Expert 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元回歸擬合，得出關(guān)于滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分的二次回歸方程。滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分對(duì)發(fā)酵溫度（X1）、發(fā)酵時(shí)間（X2）、接種量（X3）二次多項(xiàng)回歸方程為：

回歸方程方差分析見表4。

表4 回歸方程方差分析

一次項(xiàng)X3顯著（p＜0.05），桑紅茶的滋味得分受到接種量顯著影響。交互項(xiàng)X1X3顯著（p＜0.05）說(shuō)明發(fā)酵溫度和接種量對(duì)桑紅茶的滋味品質(zhì)鑒定得分有顯著影響。二次項(xiàng)X12、X32差異極顯著（p＜0.01），X22顯著差異（p＜0.05）。由F=13.97，p＜0.01 可知，該模型極顯著；失擬項(xiàng)p＞0.05，失擬不顯著；修正相關(guān)系數(shù)平方R2Adj=0.879 4，該模型可說(shuō)明87.94%響應(yīng)值的變化，此模型擬合度較高。模型較好地反映了滋味品質(zhì)化學(xué)鑒定得分與接種量、發(fā)酵溫度及時(shí)間的關(guān)系。因此，可以用此模型分析發(fā)酵桑葉紅茶的滋味品質(zhì)得分。

2.4 發(fā)酵工藝條件的確定和驗(yàn)證

由二次回歸模型的分析得出，有利桑紅茶滋味品質(zhì)的最佳工藝為發(fā)酵溫度30.87 ℃，發(fā)酵時(shí)間4.595 h，菌接種量3.107×107CFU/100 g，在該工藝條件下，模型預(yù)測(cè)的桑紅茶滋味品質(zhì)得分為6.898 分。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用，在發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間4.6 h，接種量3.1×107CFU/100 g 的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到桑紅茶滋味品質(zhì)得分為6.85 分，與優(yōu)化試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值7.075 分相比，吻合度為97.39%，預(yù)測(cè)具較高精度，此模型可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳菌種混合配比并確定發(fā)酵關(guān)鍵因子的中心水平范圍，再結(jié)合響應(yīng)面分析，確定了對(duì)響應(yīng)變量影響顯著的3 個(gè)因子的最佳水平。得出二次發(fā)酵最佳條件為棘孢曲霉、青霉和日本根霉配比2∶1∶1，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間4.6 h，菌接種量3.1×107CFU/100 g。在此條件下發(fā)酵獲得的桑紅茶滋味品質(zhì)佳且生物活性成分（黃酮、DNJ、多糖、茶多酚）含量較高。