外源氨基酸對(duì)廢棄煙草水熱液相香味產(chǎn)物的影響

岳先領(lǐng)，劉克強(qiáng)，關(guān)體青，聶紅資，朱鑫超，梁 淼，張峻松，姜 濤

（1.黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱 150028；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

0 引言

煙草作為特殊的經(jīng)濟(jì)作物在我國(guó)種植廣泛，其主要是被卷煙企業(yè)收購(gòu)用于煙草制品生產(chǎn)，但在煙草的生產(chǎn)及加工過(guò)程中會(huì)不可避免地產(chǎn)生較多的廢次或不適用煙葉[1-3]。這些不適用煙葉的產(chǎn)生不僅耗用企業(yè)庫(kù)存，影響企業(yè)煙葉庫(kù)存循環(huán)和經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也是一種生物質(zhì)資源的浪費(fèi)[4-7]。圍繞不適用煙葉的資源化、價(jià)值化利用問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了廣泛研究，目前對(duì)低、廢次煙葉應(yīng)用問(wèn)題已有諸多研究，如用于制備再造煙葉、分離提取有效活性物質(zhì)等[8-10]，為緩解資源浪費(fèi)提供了方法。

近年來(lái)，利用水熱反應(yīng)技術(shù)處理廢棄生物質(zhì)是一種將其轉(zhuǎn)化為水熱焦及功能化學(xué)品的有效途徑，具有反應(yīng)可控性好、樣品無(wú)需復(fù)雜預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。Cai J 等人[14]利用水熱手段將煙草秸稈轉(zhuǎn)化為熱值較高的生物炭燃料；朱克明，劉燦等人[15-16]針對(duì)云南煙葉和秸稈原料，采用水熱法以乙醇為反應(yīng)溶劑，經(jīng)水熱液相產(chǎn)物萃取分離后獲取致香物質(zhì)，這些研究為以廢棄煙草為底物的水熱反應(yīng)香料制備提供了思路。

水熱反應(yīng)條件下煙草溶出物間的美拉德反應(yīng)是致香物質(zhì)生成的主要因素之一，而通過(guò)外加氨基酸增加反應(yīng)底物濃度，有望提升煙草水熱反應(yīng)香料產(chǎn)率和香韻豐富性?；诖?，以廢次煙葉為原料，在外加脯氨酸和丙氨酸的條件下，考查外加氨基酸對(duì)煙草水熱反應(yīng)液相產(chǎn)物的影響，為廢棄煙葉經(jīng)水熱反應(yīng)技術(shù)制備香料提供參考與借鑒。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

材料與試劑：低次煙葉樣品（牡丹江，CSMA，2018），黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司提供；脯氨酸、丙氨酸（分析純），上海麥克林生化科技有限公司提供；乙酸苯酯（純度＞99%），北京百靈威科技有限公司提供；二氯甲烷（色譜純），北京迪科馬科技有限公司提供；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

儀器：水熱合成反應(yīng)釜，規(guī)格50 mL，北京星德儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DHG-9145A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州利研儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；8890/5977B 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草基水熱液相產(chǎn)物的制備

將煙葉樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取2.00 g 樣品于盛水的反應(yīng)釜中，料液比為1∶10，分別添加0.20 g 脯氨酸或丙氨酸，以不添加氨基酸組為對(duì)照樣品，反應(yīng)釜加蓋密封，放入分別設(shè)定好溫度的電熱鼓風(fēng)干燥箱中（溫度分別為低溫140 ℃，高溫220 ℃），水熱反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為2 h。

共設(shè)置6 個(gè)試驗(yàn)組，分別編號(hào)為140-O（反應(yīng)溫度140 ℃，無(wú)氨基酸引入）、140-P（反應(yīng)溫度140 ℃，脯氨酸引入）、140-A（反應(yīng)溫度140 ℃，丙氨酸引入）、220-O（反應(yīng)溫度220 ℃，無(wú)氨基酸引入）、220-P（反應(yīng)溫度220 ℃，脯氨酸引入）、220-A（反應(yīng)溫度220 ℃，丙氨酸引入）制備煙草水熱液相產(chǎn)物，考查不同水熱溫度下，氨基酸引入對(duì)煙葉水熱液相香味產(chǎn)物的影響。

1.2.2 液相產(chǎn)物的檢測(cè)分析

采用半定量法定量，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)濃縮后煙葉水熱反應(yīng)的液相香味產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，明確液相產(chǎn)物組成及含量。

（1）內(nèi)標(biāo)溶液的配置。準(zhǔn)確稱取0.25 g（精確至0.000 1）乙酸苯乙酯于1 000 mL 容量瓶中，以二氯甲烷為溶劑，定容至刻度，搖勻，配置成質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)溶液。

（2）產(chǎn)物的分離濃縮。待反應(yīng)釜冷卻至室溫，將反應(yīng)產(chǎn)物用三角抽濾漏斗抽濾（必要時(shí)可離心后抽濾），得液相產(chǎn)物。將液相產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至250 mL 分液漏斗中，加入20 mL 二氯甲烷進(jìn)行萃取，重復(fù)3 次，合并萃取液。

向萃取液中加入1 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，于60 ℃條件下加熱濃縮至1 mL，過(guò)0.45 μm 有機(jī)過(guò)濾膜，待上樣分析。

1.2.3 GC-MS 分析條件

色譜柱：HP-5MS 毛細(xì)管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃，載氣為He，載氣流速1 mL/min，分流比為15∶1，升溫程序50 ℃保持5 min，以3 ℃/min 的速率升至280 ℃保持15 min，傳輸線溫度280 ℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍為50～550 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草水熱液相產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析

煙草水熱反應(yīng)液相產(chǎn)物總離子流圖見(jiàn)圖1，煙草水熱反應(yīng)液相產(chǎn)物種類個(gè)數(shù)變化見(jiàn)圖2。

圖1 煙草水熱反應(yīng)液相產(chǎn)物總離子流圖

圖2 煙草水熱反應(yīng)液相產(chǎn)物種類個(gè)數(shù)變化

由圖1 和圖2 可知，不同反應(yīng)條件下共檢測(cè)出包括酮類、醛類、醇類、雜環(huán)類等在內(nèi)的81 種揮發(fā)性成分。試驗(yàn)組140-O，140-P，140-A，220-O，220-P，220-A 中分別檢測(cè)出12，9，15，38，47，48 種。

煙草水熱液相產(chǎn)物主要揮發(fā)性成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 煙草水熱液相產(chǎn)物主要揮發(fā)性成分分析結(jié)果

由表1 可知，反應(yīng)溫度為140 ℃時(shí)，3 個(gè)試驗(yàn)組（即140-O，140-P，140-A）所得產(chǎn)物揮發(fā)性成分種類相對(duì)較少，共有18 種，其中無(wú)氨基酸引入時(shí)有12 種，脯氨酸引入時(shí)有10 種，丙氨酸引入時(shí)為14 種。3-甲基環(huán)戊烷-1,2-二酮、糠醛、糠醇、9-羥基-4,7 -巨豆二烯-3 -酮等為其共有成分，前三者均為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，后者更可能源于煙草自身香味物質(zhì)的溶出。有研究表明[17]，3 -甲基環(huán)戊烷-1,2 -二酮可能由美拉德反應(yīng)高級(jí)階段發(fā)生的2,3 -烯醇化反應(yīng)產(chǎn)生，而糠醛、糠醇則通過(guò)1,2 -烯醇化反應(yīng)產(chǎn)生。3 -甲基環(huán)戊烷-1,2 -二酮具有楓槭香、焦糖樣的甜香及堅(jiān)果類香氣，含量分別為13.09，43.52，10.45 μg/g；糠醇及糠醛類物質(zhì)則具有似焦糖、烘烤和甜香、面包香氣，其含量分別為35.01，135.38，32.77 μg/g。

水熱反應(yīng)溫度為220 ℃時(shí)，3 個(gè)試驗(yàn)組中共檢測(cè)出76 種有效物質(zhì)，試驗(yàn)組220-O，220-P，220-A中分別檢測(cè)出38，46，48 種揮發(fā)性成分，較140 ℃分別增加了26，36，34 種。其中共有物質(zhì)19 種，相對(duì)于140 ℃，該反應(yīng)溫度下新產(chǎn)生物質(zhì)11 種，包括甲基環(huán)戊烯醇酮（MCP）、乙基環(huán)戊烯醇酮（ECP）、麥芽醇、3 -甲基吡啶等麥拉德反應(yīng)產(chǎn)物[18]，以及苯酚、愈創(chuàng)木酚和異煙堿等。其中，酚類物質(zhì)可能源于原料中木質(zhì)素的降解[19]，異煙堿則是煙堿的降解產(chǎn)物。液相產(chǎn)物中的MCP 和ECP 具有類似堅(jiān)果和楓槭樣的焦甜香味，220-O，220-P，220-A 反應(yīng)條件下的含量分別為78.29，160.17，581.59 μg/g 和151.30，195.57，227.81 μg/g；麥芽醇則具有特征性的甜香氣息，各試驗(yàn)組中含量分別為151.30，195.57，227.81 μg/g；愈創(chuàng)木酚具有明顯的煙熏與辛香，其含量為77.68，89.79，93.42 μg/g。

除上述較為典型的香味物質(zhì)外，液相產(chǎn)物中香味物質(zhì)中間體2,3 -二氫-3,5 二羥基-6 -甲基-4（H）-吡喃-4 -酮（DDMP）僅在140 ℃時(shí)可檢測(cè)到，可能是溫度較高時(shí)使其發(fā)生了降解。煙草特有物質(zhì)煙堿在各試驗(yàn)組產(chǎn)物中均被檢出，且其含量隨著溫度升高而增大，可能與較高溫度促進(jìn)了煙堿的溶出有關(guān)。

2.2 不同種類及代表性香味成分變化分析

2.2.1 不同種類香味物質(zhì)變化

將表1 中液相香味成分進(jìn)行分類，對(duì)比分析反應(yīng)溫度和外加氨基酸對(duì)各類香味成分變化的影響。

各試驗(yàn)組煙草水熱液相各種類產(chǎn)物含量見(jiàn)圖3。

圖3 各試驗(yàn)組煙草水熱液相各種類產(chǎn)物含量

液相產(chǎn)物中酮類香味物質(zhì)在140 ℃時(shí)含量較低，其中外加脯氨酸和丙氨酸能夠增加酮類物質(zhì)生成，由表1 可知，酮類物質(zhì)多為環(huán)酮，外加脯氨酸和丙氨酸后酮類物質(zhì)含量分別為377.72，241.84 μg/g。水熱反應(yīng)溫度為220 ℃時(shí)，酮類物質(zhì)含量顯著增加，平均含量為1 722.71 μg/g，平均增幅為632.82%，表明溫度是影響酮類物質(zhì)生成的主要因素，且氨基酸種類對(duì)酮類物質(zhì)含量有一定促進(jìn)作用，各溫度下均以脯氨基酸引入時(shí)的酮類物質(zhì)含量最高，其原因可能與木糖和脯氨酸共裂解機(jī)制類似[20]，脯氨酸的催化作用使得多糖類物質(zhì)裂解反應(yīng)所需活化能降低，促進(jìn)了隨后的美拉德反應(yīng)和酮類物質(zhì)的產(chǎn)生。

反應(yīng)溫度為140 ℃時(shí)，液相產(chǎn)物中幾乎無(wú)酚類物質(zhì)產(chǎn)生，至220 ℃時(shí)始有酚類物質(zhì)產(chǎn)生。外加脯氨酸和丙氨酸后酚類物質(zhì)含量分別為322.01，308.36 μg/g，與空白組相比，其含量分別增加了36.44%和30.66%。表明溫度對(duì)酚類物質(zhì)的產(chǎn)生有較大影響，氨基酸引入一定程度上也促進(jìn)了酚類物質(zhì)的產(chǎn)生。這可能與酚類物質(zhì)產(chǎn)生的來(lái)源有關(guān)[21]，水熱反應(yīng)中酚類物質(zhì)主要由木質(zhì)素在亞臨界水中逐漸降解產(chǎn)生，隨溫度升高和反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，木質(zhì)素降解越完全，使酚類物質(zhì)含量增加。

雜環(huán)類香味物質(zhì)在140 ℃時(shí)幾乎不產(chǎn)生，外加脯氨酸和丙氨酸后分別產(chǎn)生了少量2 -甲基吡嗪和2,5 -二甲基吡嗪。當(dāng)反應(yīng)溫度提高至220 ℃，雜環(huán)類產(chǎn)物含量均明顯增加，空白試驗(yàn)組220-O 從無(wú)至有增加了444.60 μg/g，外加脯氨酸和丙氨酸后分別增加了526.83 和1354.21 μg/g。這表明溫度的升高對(duì)雜環(huán)類產(chǎn)物的產(chǎn)生有較大影響，而氨基酸種類也會(huì)影響雜環(huán)類物質(zhì)含量。其中，引入丙氨酸后雜環(huán)物質(zhì)含量大大高于引入脯氨酸，主要為吡嗪類物質(zhì)的大量增加，Amrani Hemaimi M 等人[22]的研究證實(shí)丙氨酸是吡嗪類物質(zhì)的前體。Rizz G P[23]也認(rèn)為α -氨基酸（丙氨酸為α -氨基丙酸），與酮類物質(zhì)通過(guò)Strecker 降解，可產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)。

綜合來(lái)看，反應(yīng)溫度的提高與氨基酸的引入均能提高煙草水熱液相產(chǎn)物的含量，升高反應(yīng)溫度可明顯增加各類產(chǎn)物含量，尤其是酮類、酚類與雜環(huán)類物質(zhì)。脯氨酸引入主要增加產(chǎn)物中環(huán)酮類物質(zhì)含量，同時(shí)胺類物質(zhì)如N,N -二乙基苯胺含量明顯增加。丙氨酸引入主要提升了產(chǎn)物中雜環(huán)尤其是吡嗪類物質(zhì)的含量，產(chǎn)生了2,5 -二甲基吡嗪、2,3 -二甲基吡嗪、2,3,5 -三甲基吡嗪等一系列吡嗪環(huán)物質(zhì)。

2.2.2 代表性香味成分變化

以液相產(chǎn)物中香味物質(zhì)的含量和香韻特征為依據(jù)，篩選12 種代表性香味成分，進(jìn)一步分析了水熱反應(yīng)溫度和外加氨基酸對(duì)其含量變化的影響。

代表性水熱液相產(chǎn)物含量變化見(jiàn)圖4。

圖4 代表性水熱液相產(chǎn)物含量變化

酮類物質(zhì)中，MCP 僅在高溫反應(yīng)條件下產(chǎn)生，3 -甲基環(huán)戊烷-1,2 -二酮在140 ℃時(shí)含量最低僅為43.52 μg/g，至220 ℃含量最高為629.43 μg/g，隨溫度升高，吡啶吡咯酮平均含量從15.40 μg/g 增加至86.66 μg/g，表明溫度提升有利于此3 種香味物質(zhì)含量的增加。同時(shí)，外加脯氨酸能夠顯著增加此3 種物質(zhì)的含量，可能是脯氨酸催化所致。而外加丙氨酸時(shí)生成的3 -甲基環(huán)戊烷-1,2 -二酮含量較低，可能是丙氨酸對(duì)該物質(zhì)的生成有抑制作用。

醛類產(chǎn)物中，糠醛、5 -甲基呋喃醛和5 -羥甲基糠醛含量均隨反應(yīng)溫度升高而增加，該類物質(zhì)多由糖類物質(zhì)降解反應(yīng)產(chǎn)生，反應(yīng)溫度升高促進(jìn)了糖類物質(zhì)的降解。外加氨基酸會(huì)降低這幾種物質(zhì)的生成，如140 ℃反應(yīng)條件下，引入脯氨酸和丙氨酸后糠醛的含量由62.38 μg/g 分別減少為15.41 和47.07 μg/g，可能與糠醛與氨基酸間的美拉德反應(yīng)消耗底物有關(guān)[24]。

同時(shí)，氨基酸引入對(duì)苯酚、愈創(chuàng)木酚生成的含量影響較小。對(duì)于吡啶和2 -甲基吡嗪等雜環(huán)類香味成分而言，由于該類物質(zhì)的形成主要發(fā)生在美拉德反應(yīng)的最后階段[25]，由氨基化合物與羰基、醛的中間體反應(yīng)產(chǎn)生，因此氨基酸引入可明顯提高二者含量。此外，液相產(chǎn)物中的煙堿含量隨溫度升高而增加，也因氨基酸的引入而增加。將所得液相香味產(chǎn)物進(jìn)行卷煙加香感官評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示試驗(yàn)組220-P所得水熱液相產(chǎn)物加香效果最優(yōu)，表現(xiàn)為降低卷煙刺激性，增加勁頭和香氣飽滿度。140-A 樣品可明顯增加焦糖香韻，醇和煙氣；220-O 樣品主要表現(xiàn)為增加卷煙焦糖烘烤香氣特征。

3 結(jié)論

通過(guò)引入外源氨基酸，研究了氨基酸引入對(duì)煙草水熱液化產(chǎn)物的影響，采用GC-MS 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論，140 ℃和220 ℃反應(yīng)溫度下，煙草水熱液相產(chǎn)物中共檢測(cè)出包括酮類、醛類、醇類、雜環(huán)等在內(nèi)的81 種揮發(fā)性成分，其中主要為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及煙草自身溶出物，如糠醛、糠醇、5 -甲基呋喃醛和2 -甲基吡嗪等小分子雜環(huán)產(chǎn)物。液相產(chǎn)物中揮發(fā)性成分及含量隨反應(yīng)溫度升高而增加，與高溫促進(jìn)了降解反應(yīng)及物質(zhì)溶出有關(guān)；脯氨酸與丙氨酸通過(guò)參與美拉德反應(yīng)提高液相產(chǎn)物含量，其中脯氨酸明顯提高酮類物質(zhì)含量，丙氨酸則明顯提高雜環(huán)類尤其是吡嗪物質(zhì)的含量。試驗(yàn)組220-P，140-A 和220-O 所得液相產(chǎn)物卷煙加香效果較好，可明顯提升卷煙烘烤焦糖香，豐富煙香，進(jìn)而提升卷煙感官品質(zhì)。