六神曲發(fā)酵過程揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化及中藥組分缺失對(duì)其風(fēng)味的影響

殷 嫻，曹 爽，郭慧敏，王家棟，廖永紅*

（1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

中藥發(fā)酵具有悠久的歷史，中藥發(fā)酵是在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，通過微生物的降解和催化作用對(duì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行發(fā)酵，可以改變藥物的原有特性，增強(qiáng)或創(chuàng)造新的效果，擴(kuò)大藥物的用途，滿足臨床用藥的需要[1]。我國(guó)早在4 000多年前就學(xué)會(huì)以高粱、大米、小麥和其他谷物為原料，加入糖化酶（大曲、小曲和麩曲），以固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)形式進(jìn)行釀酒[2]，傳統(tǒng)的食品發(fā)酵微生物大多是混菌發(fā)酵系統(tǒng)，即原來的核心菌體系統(tǒng)在特定的發(fā)酵環(huán)境（溫度、pH值和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等）中經(jīng)過長(zhǎng)期馴化，形成穩(wěn)定的核心菌群，對(duì)混合菌系統(tǒng)的原料轉(zhuǎn)化和風(fēng)味發(fā)展做出貢獻(xiàn)，從而使發(fā)酵食品具有獨(dú)特的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。而后在制酒曲的基礎(chǔ)上加入不同的藥物，經(jīng)發(fā)酵制成藥物曲劑。

神曲的制作始于北魏時(shí)期，其制作方法在《齊民要術(shù)》一書中有描述，此名始載于《藥性論》，明代的李時(shí)珍在《本草綱目》中記述了神曲名字的由來。六神曲是由赤小豆、苦杏仁、青蒿、蒼耳草、辣蓼和面粉按一定比例混勻后發(fā)酵而成的曲劑，具有消食化積的功效[4]。傳統(tǒng)的六神曲炮制在原料上主要分為鮮品入藥和干品入藥，高慧[5]對(duì)鮮草藥和干草藥炮制六神曲的工藝進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，鮮品和干品所制神曲的淀粉酶和蛋白酶活力并無明顯差別。由于鮮草藥需要煎湯，炮制工藝較為繁瑣，且原材料受季節(jié)限制，而使用干草藥不受季節(jié)約束，更符合現(xiàn)代生產(chǎn)要求，因此本試驗(yàn)中采用干草藥的炮制工藝進(jìn)行發(fā)酵。

由于六神曲是采用自然條件下的多菌種混合發(fā)酵[6]，發(fā)酵參數(shù)及質(zhì)量評(píng)價(jià)缺乏統(tǒng)一量化標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)酵過程及質(zhì)量評(píng)價(jià)主要憑經(jīng)驗(yàn)，因此氣味就成為評(píng)判六神曲質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[7-8]。張紅玲等[9]使用新鮮藥材進(jìn)行一步發(fā)酵，利用石油醚回流提取發(fā)酵前后的六神曲樣品，借助氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)在發(fā)酵前后的六神曲中共檢測(cè)到36種成分，有7種酸類、16種酯類成分，其他為少量酚類、烷烴和炔烴，發(fā)酵后揮發(fā)物的種類大量增加，含量增加最多的是亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯及油酸乙酯。吳丹等[10]借助頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，從炒六神曲中鑒定了7種短鏈脂肪酸：乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸和己酸。

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）結(jié)合GC-MS技術(shù)具有運(yùn)行時(shí)間短、樣品量小、無萃取溶劑和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[11]。王暉等[12]從白酒窖泥中分離和篩選乳酸菌對(duì)高粱培養(yǎng)物進(jìn)行發(fā)酵，并分析產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣化合物。樊倩等[13]通過頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）進(jìn)行樣品前處理，利用HS-SPME結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析和比較兩種不同釀造工藝?yán)习赘上阈桶拙频膿]發(fā)性香氣和風(fēng)味成分。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)六神曲發(fā)酵期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)發(fā)酵原料分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁的六神曲進(jìn)行風(fēng)味分析，探究發(fā)酵原料對(duì)六神曲的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，為建立六神曲質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤小豆、青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁：河北省安國(guó)市廣盛商貿(mào)有限公司；中筋面粉：北京古船福興食品有限公司；鄰二氯苯標(biāo)準(zhǔn)品溶液（純度＞99.8%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890 B-5977 A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國(guó)SUPELCO公司；FW-100型粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 六神曲的制備

六神曲發(fā)酵包含赤小豆粥發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。

赤小豆粥發(fā)酵：將赤小豆磨成粗粉，加入4倍左右的60～80 ℃水，攪拌成粥狀，在32 ℃水浴中敞開培養(yǎng)3 d，發(fā)酵得赤小豆粥。

固態(tài)發(fā)酵：取苦杏仁、干辣蓼、干蒼耳秧和干青蒿分別粉碎成粗粉，與面粉和上述發(fā)酵赤小豆粥混勻，制成握之成團(tuán)、擲之即散的軟材，置于發(fā)酵箱中在32 ℃和85%濕度條件下培養(yǎng)3 d，得到六神曲。

固態(tài)發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取樣，編號(hào)分別為B_0 h、B_24 h、B_48 h和B_72 h。在原料缺失實(shí)驗(yàn)時(shí)，缺少青蒿發(fā)酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取樣，編號(hào)分別為b 0、b 24、b 48和b 72；缺少辣蓼發(fā)酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取樣，編號(hào)分別為c 0、c 24、c 48和c 72；缺少蒼耳草發(fā)酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取樣，編號(hào)分別為d 0、d 24、d 48和d 72；缺少苦杏仁發(fā)酵的六神曲在0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)取樣，編號(hào)分別為e 0、e 24、e 48和e 72。所有樣本均凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)及分析[14-15]

稱取1 g樣本于20 mL頂空瓶中，在80 ℃條件下進(jìn)行固相微萃?。?0/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭），吸附時(shí)間40 min，在250 ℃條件下解吸3 min后測(cè)定。

氣質(zhì)分析條件：DB-Wax色譜柱，進(jìn)樣口250 ℃，分流比10∶1，載氣為高純氦氣（He），流速為1 mL/min；升溫程序：40 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至200 ℃后，再以15 ℃/min升至300 ℃保持2 min。離子源溫度220 ℃，接口溫度280 ℃，掃描范圍33～500 m/z。

定性、定量方法[16-17]：結(jié)合揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間和美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù)進(jìn)行檢索定性。在六神曲發(fā)酵樣本中加入內(nèi)標(biāo)物鄰二氯苯溶液（6.46 mg/mL），采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 六神曲發(fā)酵前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

由表1可知，在六神曲樣本B_0 h、B_24 h、B_48 h、B_72 h中共檢測(cè)到33種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括2種酸、6種醇、7種酯、3種醛、11種烴、1種酮和3種其他類化合物，是六神曲風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)者。

表1 六神曲發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化Table 1 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu during fermentation

六神曲發(fā)酵0 h時(shí)可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以苯甲醛為主，含量為2 157.43 μg/mL。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，苯甲醛的含量急劇下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)下降到116.15 μg/mL；苯甲醛下降的同時(shí)，苯甲醇的含量迅速增加，苯甲醇發(fā)酵0 h時(shí)含量為160.08 μg/mL，發(fā)酵72 h時(shí)成為六神曲中的主要風(fēng)味物質(zhì)，含量為703.95 μg/mL，比發(fā)酵前增加了3.4倍，推測(cè)苯甲醛可能在醇脫氫酶的作用下被轉(zhuǎn)化生成苯甲醇[18]。有資料顯示原料苦杏仁中含有苦杏仁苷，在苦杏仁苷酶的催化作用下生成野黑櫻苷，野黑櫻苷在櫻葉酶的作用下生成扁桃腈，扁桃腈被扁桃腈裂解酶催化分解生成苯甲醛[19-21]。FU F Q等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在六神曲的發(fā)酵過程中苯甲醛極不穩(wěn)定，易被微生物降解，并不是六神曲的藥效成分。

本試驗(yàn)共鑒定出6種醇，除苯甲醇之外，還檢測(cè)到正己醇、5-甲基-1-庚醇、（S）-3-乙基-4-甲基戊醇、3-甲基-2-丁醇和苯乙醇。發(fā)酵72 h時(shí)含量較多的是苯甲醇和苯乙醇。其中苯甲醇作為抗菌劑廣泛應(yīng)用，由于它的鎮(zhèn)痛和麻醉特性，經(jīng)常被用作注射藥物的溶劑，如維生素B注射液和鹽酸大黃素的溶劑。同時(shí)，苯甲醇還可作為軟膏或液體的防腐劑，并作為藥物合成的重要中間體[22]。在液體型保健食品中均能檢測(cè)出苯甲醇[23-24]。苯乙醇是一種無色的水溶性液體，有一種令人愉快的氣味，可以從各種物種中提取，如玫瑰、桔子花和風(fēng)笛。傳統(tǒng)上也被用作醫(yī)學(xué)上的抑菌劑，在皮膚護(hù)理產(chǎn)品的保存方面非常重要[25]。

酸類物質(zhì)中鑒定出醋酸和丁酸，其中醋酸在發(fā)酵期間的含量最多。從發(fā)酵1 d開始醋酸含量顯著增加，在發(fā)酵72 h時(shí)含量為252.97 μg/mL，僅次于苯甲醇，相較于發(fā)酵0 h增加了約6.8倍。醋酸在骨科手術(shù)中的應(yīng)用越來越多，由于其無菌特性，也被應(yīng)用于其他領(lǐng)域，如治療軟組織損傷、術(shù)后瘢痕，生物膜的清除（髖關(guān)節(jié)周圍）和清理[26]。吳丹等[10]利用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法從炒神曲中也鑒定出乙酸和丁酸等酸類物質(zhì)。

酯類物質(zhì)共鑒定出7種，分別為草酸丁丙酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙酸甲酯、水楊酸甲酯、鄰苯二甲酸丁基己-3-酯和己醇醋酸酯。發(fā)酵期間的酯類物質(zhì)中含量最多的是苯乙酸甲酯，在發(fā)酵0 h的六神曲中并未檢測(cè)到，隨著發(fā)酵的進(jìn)行其含量迅速增長(zhǎng)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)其含量為143.12 μg/mL，僅次于苯甲醇和醋酸。苯乙酸甲酯具有蜂蜜般甜味并稍帶麝香香氣，可用于日化香精配方和食用香精中。水楊酸甲酯被用于醫(yī)學(xué)，其作用一般是消炎和鎮(zhèn)痛；還作為溶劑和中間體用于制造殺蟲劑、殺菌劑、香水、涂料、化妝品染料和纖維染色助劑[27]。張紅玲[9]在GC-MS結(jié)果中也檢測(cè)出鄰苯二甲酸二丁酯，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其含量也逐漸消失。

香豆素類物質(zhì)含量在六神曲發(fā)酵過程中也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，香豆素是一類具有α-吡喃酮結(jié)構(gòu)的化合物，具有抗腫瘤、抗菌等活性[28]，在甘草[29]、白芷[30]的化學(xué)成分中均可檢測(cè)到香豆素類物質(zhì)。

2.2 六神曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

2.2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分特征值分析

對(duì)發(fā)酵過程中的六神曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，以A、B、C、D分別代表樣本B_0 h、B_24 h、B_48 h、B_72 h。利用SPSS 25對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行主成分分析，并計(jì)算權(quán)重。4種樣本（B_0 h、B_24 h、B_48 h和B_72 h）中7類揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分特征值及貢獻(xiàn)率見表2，主成分的特征向量及載荷分析見表3。由表2和表3可知，提取的2個(gè)主成分的初始特征值均＞1，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)99.89%，丟失的信息較少，可反映樣本的主要特征信息。第一主成分為84.42%，醇類、酸類、酯類和其他類的載荷系數(shù)（0.99、0.99、0.99和0.99）反映了其對(duì)第一主成分的貢獻(xiàn)大，主要由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的物質(zhì)組成。醛類與第一主成分呈負(fù)相關(guān)（-0.99）。第二主成分為15.47%，酮類的載荷系數(shù)（0.97）反映了其對(duì)第二主成分的貢獻(xiàn)。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的載荷大則對(duì)六神曲評(píng)分的影響大，即對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)大。

表2 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalues and variance contribution rates of principle components

表3 主成分特征向量及載荷分析Table 3 Principal component eigenvector and load analysis

2.2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分類模型建立

根據(jù)主成分與特征向量之間的關(guān)系，由表3可得到2個(gè)主成分的表達(dá)式：

Y1=-0.41X1+0.10X2+0.41X3+0.41X4+0.41X5+0.39X6+0.41X7

Y2=-0.13X1+0.93X2+0.09X3-0.14X4-0.05X5-0.30X6+0.01X7

式中X1～X7為原變量標(biāo)準(zhǔn)化變換后的標(biāo)準(zhǔn)變量，各系數(shù)為各風(fēng)味物質(zhì)的特征向量，計(jì)算后可得出4個(gè)樣本各主成分的評(píng)分，Y1、Y2兩個(gè)主成分的各自方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，建立六神曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分類評(píng)價(jià)模型，即Y=0.844 2Y1+0.154 7Y2，經(jīng)計(jì)算可得每種六神曲樣本的綜合評(píng)分Y，結(jié)果見表4。

表4 六神曲各主成分評(píng)分綜合得分Table 4 Each principal component comprehensive score of LiuShen-Qu

由表4可知，A（B_0 h）樣本綜合得分＜0，B（B_24 h）、C（B_48 h）、D（B_72 h）的綜合得分＞0，說明經(jīng)過六神曲中所有風(fēng)味物質(zhì)的PC1、PC2受發(fā)酵時(shí)間的影響顯著。結(jié)合六神曲揮發(fā)性風(fēng)味成分的種類及含量可知，D（B_72 h）樣本中的醇類、酸類和酯類含量較高，說明醇類、酸類和酯類對(duì)六神曲風(fēng)味的貢獻(xiàn)率明顯。六神曲PCA主成分載荷圖見圖1。

圖1 六神曲主成分分析載荷圖Fig.1 Principal component analysis load chart of LiuShen-Qu

由圖1可知，醛類物質(zhì)與兩個(gè)主成分均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，說明醛類物質(zhì)在六神曲發(fā)酵后期其含量顯著降低；醇類、酸類和酯類與第一主成分有較強(qiáng)的正相關(guān)，是六神曲發(fā)酵后期的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。

2.3 原料缺失對(duì)六神曲風(fēng)味的影響

分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁中的一種材料，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵期間的四種六神曲進(jìn)行取樣，進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定。以六神曲發(fā)酵作為對(duì)照組，探究發(fā)酵原料對(duì)六神曲風(fēng)味物質(zhì)的影響。

由表5可知，發(fā)酵原料缺少青蒿的六神曲在發(fā)酵期間共檢測(cè)出27種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，含有3種酸類、6種酯類、4種醛類、2種醇類、7種烴類、1種酮類和4種其他類風(fēng)味物質(zhì)，其中苯甲醛、苯甲醇和丁酸的含量最高。與對(duì)照組相比，酸類物質(zhì)在發(fā)酵0 h時(shí)增加了正戊酸，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸消失，酸類物質(zhì)以丁酸為主，發(fā)酵后的含量增加到364.23 μg/mL，醋酸的含量在發(fā)酵過程中逐漸上升，但遠(yuǎn)低于對(duì)照組的醋酸含量。酯類物質(zhì)中的苯乙酸甲酯含量在發(fā)酵過程中雖也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，但濃度大大降低。醛類物質(zhì)中的苯甲醛隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其含量雖有降低的趨勢(shì)，但下降幅度遠(yuǎn)低于對(duì)照組，推測(cè)青蒿可能對(duì)苯甲醛的分解過程存在影響。醇類物質(zhì)中僅鑒定出4-甲基-1-己醇和苯甲醇，以苯甲醇為主，發(fā)酵期間苯甲醇的含量整體低于對(duì)照組，推測(cè)青蒿對(duì)苯甲醇的產(chǎn)生具有一定的促進(jìn)作用。

表5 發(fā)酵原料缺少青蒿的六神曲發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化Table 5 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with Artemisia annua deficiency during fermentation

由表6可知，發(fā)酵原料缺少辣蓼的六神曲在發(fā)酵期間共檢測(cè)出34種風(fēng)味物質(zhì)，包含4種酸類、9種酯類、3種醛類、4種醇類、9種烴類、2種酮類和3種其他類風(fēng)味物質(zhì)。

表6 發(fā)酵原料缺少辣蓼的六神曲樣本中鑒定的風(fēng)味化合物Table 6 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with Polygonum hydropiper deficiency during fermentation

與對(duì)照組相比，酸類物質(zhì)中增加了正戊酸和鄰羥基肉桂酸（鄰香豆酸），正戊酸隨著發(fā)酵的進(jìn)行而逐漸消失，鄰羥基肉桂酸（鄰香豆酸）在發(fā)酵72 h時(shí)出現(xiàn)，其含量為73.68 μg/mL；酸類物質(zhì)以丁酸為主，隨著發(fā)酵其含量逐漸增加，發(fā)酵72 h時(shí)為334.22 μg/mL，僅次于苯甲醛和苯甲醇；醋酸雖呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，但含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組。酯類物質(zhì)中最多的是苯乙酸甲酯，發(fā)酵72h時(shí)其含量為34.88μg/mL，約為對(duì)照組的1/4，雖隨著發(fā)酵含量逐漸升高，但遠(yuǎn)低于對(duì)照組；發(fā)酵過程中鄰苯二甲酸二丁酯的含量高于對(duì)照組，但隨著發(fā)酵呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，推測(cè)辣蓼可能對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的產(chǎn)生存在抑制作用。醛類物質(zhì)中的苯甲醛含量最高，隨著發(fā)酵過程逐漸降低，發(fā)酵72 h時(shí)下降了1.9倍，下降速度依然低于對(duì)照組。在酮類物質(zhì)中，發(fā)酵0 h檢測(cè)到26.20 μg/mL的蒿酮，但隨著發(fā)酵進(jìn)行逐漸消失。其他類中的香豆素在發(fā)酵0 h、24 h和48 h時(shí)含量逐漸增加，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)未檢測(cè)到該物質(zhì)，推測(cè)辣蓼對(duì)香豆素的穩(wěn)定性有關(guān)。

由表7可知，發(fā)酵原料缺少蒼耳草的六神曲在發(fā)酵期間共檢測(cè)出31種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包含5種酸類、7種酯類、3種醛類、2種醇類、9種烴類、2種酮類和3種其他類風(fēng)味物質(zhì)。

表7 發(fā)酵原料缺少蒼耳草的六神曲樣本中鑒定的風(fēng)味化合物Table 7 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with Xanthium sibiricum deficiency during fermentation

與對(duì)照組相比，酸類物質(zhì)中增加了正戊酸、鄰羥基肉桂酸（鄰香豆酸）和壬酸，正戊酸和壬酸隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸消失；在發(fā)酵72 h時(shí)增加了鄰香豆酸，其含量為78.02 μg/mL；醋酸的含量在發(fā)酵過程中逐漸增加，但遠(yuǎn)低于對(duì)照組含量；酸類以丁酸含量最高，發(fā)酵72 h時(shí)其含量為306.65 μg/mL。酯類物質(zhì)中鄰苯二甲酸二丁酯在發(fā)酵72 h時(shí)含量最高，發(fā)酵期間含量均高于對(duì)照組；其次是苯乙酸甲酯，其含量隨著發(fā)酵過程逐漸增加，發(fā)酵72 h時(shí)其含量為27.92 μg/mL，約為對(duì)照組含量的1/5。醛類物質(zhì)的種類明顯降低，以苯甲醛為主，發(fā)酵72 h時(shí)其含量為1 000.20 μg/mL，下降速度低于對(duì)照組，推測(cè)蒼耳草與苯甲醛的降解有關(guān)。酮類物質(zhì)中的蒿酮，在發(fā)酵0 h時(shí)含量為24.92 μg/mL，隨著發(fā)酵進(jìn)行逐漸下降至消失。其他類中的香豆素在發(fā)酵前期能檢測(cè)出，但發(fā)酵72 h時(shí)并未檢測(cè)到，推測(cè)其在發(fā)酵后期被分解轉(zhuǎn)化。

由表8可知，發(fā)酵原料缺少苦杏仁的六神曲在發(fā)酵期間共檢測(cè)出40種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包含6種酸類、6種酯類、6種醛類、3種醇類、14種烴類、2種酮類和3種其他類風(fēng)味物質(zhì)。

表8 發(fā)酵原料缺少苦杏仁的六神曲樣本中鑒定的風(fēng)味化合物Table 8 Changes of volatile flavor compounds of LiuShen-Qu with bitter apricot kernels deficiency during fermentation

酸類物質(zhì)中丁酸的含量最高，其質(zhì)量濃度高于原料缺少青蒿和蒼耳草的六神曲；在發(fā)酵72 h時(shí)檢測(cè)出了鄰香豆酸，其含量為80.42 μg/mL；醋酸的含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加，其增長(zhǎng)幅度遠(yuǎn)低于對(duì)照組，推測(cè)苦杏仁對(duì)醋酸的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用。

與對(duì)照組相比，酯類以鄰苯二甲酸二丁酯為主，其含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸降低，其次是丁酸丁酯和3-甲基丁酸苯甲酯；未鑒定出對(duì)照組中的苯乙酸甲酯，推測(cè)苦杏仁促進(jìn)苯乙酸甲酯的產(chǎn)生。醛類物質(zhì)中苯甲醛的含量相對(duì)較高，在發(fā)酵0 h時(shí)苯甲醛為101.73 μg/mL，其含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組，約為對(duì)照組含量的1/21，推測(cè)原料苦杏仁與苯甲醛的產(chǎn)生有關(guān)。醇類中的苯甲醇在發(fā)酵0 h時(shí)并未檢測(cè)到，在發(fā)酵期間其含量逐漸增加，但遠(yuǎn)低于對(duì)照組，推測(cè)苯甲醇的產(chǎn)生可能與苦杏仁有關(guān)，且苯甲醇可能大部分由苯甲醛轉(zhuǎn)化而來。酮類中的蒿酮在發(fā)酵0 h時(shí)含量為34.30 μg/mL，隨著發(fā)酵進(jìn)行逐漸下降至消失。在發(fā)酵前期能檢測(cè)出香豆素，但發(fā)酵72 h時(shí)消失。

結(jié)合原料缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁的六神曲發(fā)酵的風(fēng)味分析，當(dāng)發(fā)酵原料缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁中的任何一種藥材時(shí)，丁酸的含量會(huì)極大增加，與此同時(shí)醋酸的含量出現(xiàn)明顯的下降，推測(cè)四種原料對(duì)六神曲中酸類物質(zhì)的形成有關(guān)；酯類物質(zhì)中的苯乙酸甲酯的產(chǎn)生可能與四種原料均有關(guān)，其中苦杏仁對(duì)苯乙酸甲酯的促進(jìn)作用可能更大；通過苯甲醛和苯甲醇的變化，推測(cè)青蒿、辣蓼和蒼耳草均可促進(jìn)苯甲醛到苯甲醇的轉(zhuǎn)化作用，且苦杏仁與苯甲醛的形成密切相關(guān)；推測(cè)青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁均可抑制香豆素的轉(zhuǎn)化分解。

3 結(jié)論

本研究利用GC-MS對(duì)六神曲的可揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后的六神曲中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在較大的變化。其中發(fā)酵0 h以苯甲醛為主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，苯甲醇的含量急劇上升。發(fā)酵72 h的六神曲以苯甲醇、醋酸和苯乙酸甲酯等為主要的風(fēng)味物質(zhì)，豐富的有機(jī)酸和醇類物質(zhì)為六神曲的消食健胃和抗菌性能提供基礎(chǔ)。進(jìn)一步對(duì)原料分別缺少青蒿、辣蓼、蒼耳草和苦杏仁的六神曲進(jìn)行風(fēng)味分析，發(fā)現(xiàn)四種藥材均對(duì)六神曲的風(fēng)味具有不同程度的影響。

本研究在探究發(fā)酵前后六神曲的揮發(fā)性風(fēng)味成分變化的基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵原料對(duì)風(fēng)味的影響進(jìn)行分析，揭示了六神曲主要的可揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與發(fā)酵原料之間的關(guān)系，為六神曲的質(zhì)量控制提供依據(jù)。