植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌微膠囊酸奶的研制

陳 娟，于 斌，郭宗明，王懿千，呂常旭*

（1.煙臺(tái)南山學(xué)院 健康學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265713；2.四川旅游學(xué)院 烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610100）

酸奶是牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成，起源于保加利亞[1]。酸奶是目前國內(nèi)外市場上公認(rèn)的可將乳酸菌攜帶進(jìn)入腸道的主要載體之一，但乳酸菌對(duì)消化道內(nèi)各個(gè)階段復(fù)雜的苛刻生理、生化環(huán)境耐受性比較差，其活性到達(dá)腸道后顯著降低，難以發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的功能，利用微膠囊技術(shù)將乳酸菌包埋保護(hù)起來再添加到酸奶中是提高酸奶益生功能性的重要途徑之一[2-4]。微膠囊技術(shù)是將性能不穩(wěn)定的固體、液體、氣體包裹在由天然或者合成的高分子材料形成的半透性或全密封的微型膠囊的技術(shù)[5]。馬秀霞[6]利用乳清分離蛋白與菊粉對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行包埋，結(jié)果證明微膠囊對(duì)益生菌具有保護(hù)作用；RAJAM R等[7]利用冷凍干燥法處理植物乳桿菌微膠囊，提高微膠囊包埋率和儲(chǔ)存穩(wěn)定性；MI Y等[8]利用羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉制備長雙歧桿菌BIOMA 5920微膠囊，提高了其在腸道中的存活率。金云祥[9]以低甲氧基果膠為包埋材料，利用離子交聯(lián)方法制備短雙歧桿菌微膠囊，制成酸奶后添加到小鼠飼料中，促進(jìn)改善宿主腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫耐受性、提升機(jī)體的抗氧化能力及腸道屏障功能。目前乳酸菌微膠囊的研究大多集中于單一菌種，不能更好的發(fā)揮乳酸菌調(diào)節(jié)腸道的功能，且將微膠囊應(yīng)用于產(chǎn)品的研究較少。因此有必要對(duì)乳酸菌微膠囊在酸奶中的應(yīng)用展開研究。

本研究以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）混合發(fā)酵液為芯材，羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉為壁材，采用擠壓法制成植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌微膠囊，并將其添加到鮮牛乳中，添加發(fā)酵劑制成酸奶，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，采用主成分分析對(duì)產(chǎn)品的酸度、黏度、pH、感官評(píng)分結(jié)果進(jìn)行綜合分析，優(yōu)化酸奶工藝，對(duì)其理化和微生物指標(biāo)進(jìn)行檢測，且通過體外模擬胃腸液試驗(yàn)，探究微膠囊酸奶中乳酸菌的存活率，為新型酸奶食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白砂糖：廣西馱盧東亞糖業(yè)有限公司；鮮牛乳：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌1∶1）：深圳安琪食品有限公司；果膠：沃佳生物科技有限公司；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：煙臺(tái)南山學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；MRS培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純）：深圳市鋮遠(yuǎn)科技有限公司；羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉（均為分析純）：青島美味源生物科技有限公司；氯化鈣（分析純）：西隴化工股份有限公司；胃蛋白酶（≥3 000 U/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市北辰方正試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

YP10002B電子天平：上海力辰儀器科技有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司；NDJ-5S數(shù)顯旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：上海尼潤智能科技有限公司；VS-1300L新穎型標(biāo)準(zhǔn)潔凈工作臺(tái)：廣州深華生物技術(shù)有限公司；MSL-3781L高壓蒸汽滅菌鍋：松下電器（中國）有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；MJ-106B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；FD-A10N-50冷凍干燥機(jī)：上海皓莊儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微膠囊的制備

活化后的嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌按照接種比例1∶1、接種量4%、培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時(shí)間18 h，搖床轉(zhuǎn)速60 r/min培養(yǎng)后的混合發(fā)酵液為芯材[10]，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.90%的羧甲基殼聚糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.10%的海藻酸鈉、濃度為0.20 mol/L的氯化鈣為包埋材料，采用擠壓法制備微膠囊，并進(jìn)行冷凍干燥，即得微膠囊產(chǎn)品。

1.3.2 微膠囊酸奶的發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

鮮牛奶、白砂糖、果膠→混合→均質(zhì)→殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷藏→微膠囊酸奶

操作要點(diǎn)：

混合：以200 mL鮮牛奶為基準(zhǔn)，添加0.2%果膠和8%白砂糖，持續(xù)攪拌5 min，直至充分溶解。

均質(zhì)：將混合液在轉(zhuǎn)速為1 200 r/min條件下均質(zhì)15 min。

殺菌：殺菌溫度為90～95 ℃，殺菌時(shí)間10 min。

接種：向冷卻至44 ℃左右的混合液中先加入0.20%發(fā)酵劑，再加入3%微膠囊，攪拌至混合均勻。

發(fā)酵：發(fā)酵溫度為41 ℃，發(fā)酵時(shí)間9 h[9]。

冷藏：將發(fā)酵完成的酸奶轉(zhuǎn)移到5 ℃冰箱中，放置12 h，即得微膠囊酸奶成品。

1.3.3 微膠囊酸奶配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定微膠囊酸奶的基本條件為：鮮牛乳200 mL、發(fā)酵劑添加量0.20%、果膠添加量0.20%、白砂糖添加量8%、微膠囊添加量3%、發(fā)酵溫度41 ℃、發(fā)酵時(shí)間9 h，以酸度、黏度、pH、感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察微膠囊添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、白砂糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）、發(fā)酵劑添加量（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）對(duì)酸奶黏度、酸度、pH和感官評(píng)分的影響。

1.3.4 微膠囊酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黏度、酸度、pH、感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以微膠囊添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵劑添加量（C）為影響因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，確定酸奶的最佳工藝配方。酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for yogurt formula optimization

1.3.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)的測定

pH的測定：使用pH計(jì)對(duì)酸奶進(jìn)行測定；酸度的測定：參照GB/T 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[11]進(jìn)行測定；黏度的測定：使用NDJ-5S數(shù)顯旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，在室溫下，裝配4號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速調(diào)至30 r/min，測定每組酸奶樣品的黏度值[12-13]。理化和微生物指標(biāo)參照GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》[14]進(jìn)行測定。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

邀請15名具備發(fā)酵乳感官評(píng)定專業(yè)知識(shí)的人員進(jìn)行感官評(píng)定，參考GB/T 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》[14]制定，采用百分制對(duì)酸奶產(chǎn)品的色澤（20分）、滋味和氣味（40分）、組織狀態(tài)（40分）進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of yogurt

1.3.7 體外模擬胃腸液試驗(yàn)

配制人工胃腸液[15-16]，試驗(yàn)分為兩組，對(duì)照組（添加0.20%發(fā)酵劑+2.6%植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌粉）和試驗(yàn)組（添加0.20%發(fā)酵劑+3%植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌微膠囊），使得200 mL牛奶中發(fā)酵前兩組活菌數(shù)相同（5×106CFU），分別取10 g酸奶樣品加入到燒杯中，再加入90 mL人工模擬胃液，放入37 ℃、100 r/min的搖床搖勻1 h，參照GB/T 4789.35—2023《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[17]進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)。然后分別取30 mL經(jīng)胃液消化后的酸奶加入到燒杯中，加入70 mL人工模擬腸液，放入37 ℃、100 r/min的搖床搖勻2 h，計(jì)數(shù)方法同胃液。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS statistics 27軟件，對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用主成分分析對(duì)酸奶的黏度、酸度、pH、感官評(píng)分四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析得出特征值、方差貢獻(xiàn)率及累積方差貢獻(xiàn)率，再結(jié)合公式（1）（2）計(jì)算出酸奶的綜合得分F和規(guī)范化得分Z[18-21]。

式中：F為綜合得分，F(xiàn)1和F2分別為主成分1和主成分2的得分，Y1和Y2為各個(gè)主成分的特征值。Z為規(guī)范化得分，F(xiàn)max為綜合得分的最大值，F(xiàn)min為綜合得分的最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微膠囊添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

微膠囊添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響見表3。由表3可知，隨著微膠囊添加量不斷增加，酸奶黏度逐漸增加，當(dāng)微膠囊添加量為3%時(shí)，酸奶黏度為（374.00±43.36）mPa·s，與添加量1%相比，差異顯著（P＜0.05），此后，隨著微膠囊添加量的增加，黏度變化較小，與添加量3%相比，差異不顯著（P＞0.05）。隨著微膠囊添加量的增加，酸度和pH的變化很小，基本不發(fā)生改變，這主要是由于乳酸菌發(fā)酵的底物鮮牛乳量是相同的[22]；由于黏度增加，口感發(fā)生變化，在微膠囊添加量為3%時(shí)，感官評(píng)分為86.60±5.13分，此時(shí)產(chǎn)品色澤均勻，奶香味濃厚，感官評(píng)分為五組中最高。綜合分析可得，最佳微膠囊添加量為3%。

表3 微膠囊添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響Table 3 Effect of microencapsulation addition on yogurt quality

2.1.2 白砂糖添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

白砂糖添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響見表4。由表4可知，隨著白砂糖添加量的增加，酸奶黏度增加，當(dāng)添加量達(dá)到8%時(shí)，與添加量6%相比，差異不顯著（P＞0.05），白砂糖添加量達(dá)到9%時(shí)，與添加量6%相比，差異顯著（P＜0.05），黏度過大[23-24]；隨著白砂糖添加量的增加，酸度逐漸增大，pH值逐漸降低，當(dāng)添加量為8%時(shí)，感官評(píng)分為87.20±8.46分，此時(shí)產(chǎn)品口感酸甜順滑，甜而不膩，無顆粒感，感官評(píng)分為五組中最高。綜合分析可得，最佳白砂糖的添加量為8%。

表4 白砂糖添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響Table 4 Effect of sugar addition on yogurt quality

2.1.3 發(fā)酵劑添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

發(fā)酵劑添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響見表5。由表5可知，隨著發(fā)酵劑添加量的增加，酸奶黏度不斷增加，與添加量0.10%相比，添加量0.20%時(shí)黏度顯著增加（P＜0.05），但由于過度發(fā)酵使部分乳清析出，酸奶的黏度降低，導(dǎo)致酸奶黏度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[25-26]。因底物鮮牛乳的量一定，隨著發(fā)酵劑添加量的增加，酸度逐漸上升，與添加量0.10%相比，添加量0.20%時(shí)酸度顯著增加（P＜0.05），但后期可被轉(zhuǎn)化的糖不足，酸奶酸度會(huì)保持基本不變，因此酸奶的酸度呈先增加后平穩(wěn)趨勢[27]，pH值相應(yīng)呈降低趨勢。當(dāng)發(fā)酵劑的添加量為0.20%時(shí)，酸奶黏度為（410.00±71.06）mPa·s，酸度為（132.20±6.38）°T，pH值為5.48±0.47，感官評(píng)分為（85.60±6.94）分，此時(shí)產(chǎn)品感官評(píng)分為5組中最高。綜合分析可得，最佳發(fā)酵劑的添加量為0.20%。

表5 發(fā)酵劑添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響Table 5 Effect of starter addition on yogurt quality

2.2 微膠囊酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

2.2.1 主成分分析及規(guī)范化得分計(jì)算

采用IBM SPSS statistics 27軟件，對(duì)成品的黏度、酸度、pH、感官評(píng)分指標(biāo)進(jìn)行主成分分析得出特征值、方差貢獻(xiàn)率及累積方差貢獻(xiàn)率，主成分特征值及貢獻(xiàn)率見表6，提取的主成分矩陣見表7。

表6 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 6 Characteristic value and contribution rate of principle components

表7 主要指標(biāo)的特征向量Table 7 Characteristic vector scale of main indicators

由表6可知，第1主成分方差貢獻(xiàn)率為61.38%（Y1），第2主成分方差貢獻(xiàn)率為26.48%（Y2），前2個(gè)向量累積方差貢獻(xiàn)率為87.87%，根據(jù)累積貢獻(xiàn)率大于85%的原則，表明提取的前2個(gè)主成分能夠全面反映酸奶的綜合品質(zhì)。由表7可知，決定第1主成分的指標(biāo)為酸度；決定第2主成分的是感官評(píng)分。

根據(jù)主成分分析結(jié)果，得出相應(yīng)的F1、F2，再根據(jù)公式（1）和（2）得出主成分分?jǐn)?shù)及規(guī)范化得分，以規(guī)范化得分作為正交試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到主成分得分與四個(gè)變量之間的關(guān)系為：

F1=0.48X1+0.59X2+0.57X3+0.27X4

F2=0.36X1-0.30X2-0.36X3+0.80X4

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

以微膠囊添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵劑添加量（C）為試驗(yàn)因素，以規(guī)范化得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)測定結(jié)果見表8。

表8 酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for yogurt formulaoptimization

從表8中的R值可以得知，對(duì)規(guī)范化得分的影響順序?yàn)镃（發(fā)酵劑添加量）＞B（白砂糖添加量）＞A（微膠囊添加量），酸奶最佳發(fā)酵工藝為A1B2C2，即發(fā)酵劑添加量0.2%，白砂糖添加量8%，微膠囊添加量2%，發(fā)酵時(shí)間9 h，發(fā)酵溫度41℃，在此條件下，酸奶規(guī)范化得分為1.00，黏度為410mPa·s，酸度為137°T，pH為5.2，感官評(píng)分為85，規(guī)范化得分為1.00。

由表9可知，微膠囊的添加量對(duì)黏度的影響極顯著（P＜0.01），對(duì)酸度、感官評(píng)分、pH和規(guī)范化得分的影響不顯著（P＞0.05）。白砂糖的添加量對(duì)黏度的影響極顯著（P＜0.01），對(duì)感官評(píng)分的影響顯著（P＜0.05），對(duì)酸度和規(guī)范化得分的影響不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵劑添加量對(duì)黏度的影響極顯著（P＜0.01），對(duì)酸度、pH、感官評(píng)分和規(guī)范化得分的影響顯著（P＜0.05）。

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests results

2.3 理化和微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

酸奶產(chǎn)品中脂肪含量4 g/100 g，酸度121°T，蛋白質(zhì)含量3.1 g/100 g，乳酸菌2.5×106CFU/mL，大腸菌群、酵母菌、霉菌均未檢出，符合我國乳制品國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》。

2.4 體外模擬胃腸液試驗(yàn)結(jié)果

微膠囊酸奶體外穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 體外模擬胃腸液試驗(yàn)結(jié)果Table 10 Results of simulated gastrointestinal fluid experiments in vitro

由表10可知，在人工胃液中，對(duì)照組乳酸菌存活率為31.39%，試驗(yàn)組乳酸菌存活率為67.60%，存活率增加36.21%。在人工腸液中，對(duì)照組乳酸菌存活率為28.06%，試驗(yàn)組乳酸菌存活率為62.00%，存活率增加33.94%，表明生產(chǎn)酸奶時(shí)添加乳酸菌微膠囊，可大幅提高酸奶中乳酸菌活性。

3 結(jié)論

本研究將植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌微膠囊加入到鮮牛乳中制作酸奶，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，采用主成分分析對(duì)產(chǎn)品的酸度、黏度、pH、感官評(píng)分結(jié)果進(jìn)行綜合分析，優(yōu)化酸奶工藝。確定最佳生產(chǎn)工藝為：發(fā)酵劑添加量0.2%，白砂糖添加量8%，果膠添加量0.2%，微膠囊添加量2%，發(fā)酵溫度41 ℃，發(fā)酵時(shí)間9 h。最終生產(chǎn)的酸奶色澤均勻，質(zhì)地細(xì)膩，組織狀態(tài)均勻，感官評(píng)分為85分，其黏度、酸度、pH分別為410 mPa·s、137°T、5.2，理化和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，且乳酸菌以酸奶為載體到達(dá)腸道后可以保持較高的活性，發(fā)揮益生功能，為新型酸奶食品的研發(fā)提供參考依據(jù)。