釀酒污水資源化應(yīng)用性能及風(fēng)險(xiǎn)分析

何 靜，柏 松，謝光杰，羅 玲，黃治國，衛(wèi)春會

（1.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 川酒學(xué)院，四川 瀘州 646300；2.四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 黨政辦公室，四川 瀘州 646300；3.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 643002）

氮污染容易導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化[1]。而城鎮(zhèn)污水處理廠的尾水氮素排放是導(dǎo)致河流等受納水體氮素積累的主要原因[2]。一些未達(dá)標(biāo)的污水處理廠被要求進(jìn)行提標(biāo)改造，以實(shí)現(xiàn)尾水中的氮素低于排放標(biāo)準(zhǔn)[3]。然而，我國部分地區(qū)的城市生活污水逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈吞嫉龋–/N）[4]。特別是西南地區(qū)（如成都、重慶、瀘州等）污水的C/N僅為4左右。碳源不足導(dǎo)致氮素去除過程缺少充足的有機(jī)物和電子供體，削弱了微生物活性，從而降低了脫氮性能[5]。因此，污水的低C/N特性給污水處理廠的提標(biāo)改造帶來了更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。為此，污水處理廠采取了外加碳源（如葡萄糖[6]、乙酸鈉等[7]）的措施以強(qiáng)化氮素去除性能。盡管這些方法提高了工藝脫氮效果，但是無疑增加了運(yùn)行成本。

釀酒污水是釀酒過程的主要廢棄物，是釀酒過程中產(chǎn)生的沖洗廢水、冷卻水、窖底水等的總稱，富含多糖、有機(jī)酸、乙醇、甘油等有機(jī)物，具有有機(jī)物濃度高、氨氮濃度高、懸浮物濃度高的特點(diǎn)[8]。相對于可以用作飼料的酒糟而言，其目前的利用率還比較低，缺乏有效的利用手段[9]。但若不加以利用或者處理，直接排放將對環(huán)境造成嚴(yán)重危害[10]。需要指出是，釀酒污水的高濃度有機(jī)物特性可以滿足污水處理廠缺少碳源的需求，若將其用作污水處理的碳源，將不僅可以實(shí)現(xiàn)釀酒污水的資源化利用，而且可以實(shí)現(xiàn)對污水的處理。此外，釀酒污水的定量投加，可以避免外加碳源導(dǎo)致的出水有機(jī)物超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。但是釀酒污水用于城鎮(zhèn)污水處理廠尾水處理的應(yīng)用還未得到評估，此外，釀酒污水的資源化微生物機(jī)制也需要揭示。

因此，本研究利用釀酒污水作為碳源，評估了其對低碳污水的處理性能；通過參數(shù)優(yōu)化獲得了最優(yōu)運(yùn)行條件，分析了釀酒污水資源化利用過程的微生物機(jī)制，以期為釀酒污水的資源化利用提供理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

移動床生物膜反應(yīng)器（反應(yīng)器由內(nèi)外雙層構(gòu)成，內(nèi)層為反應(yīng)區(qū)，外層為水浴保溫層，通過循環(huán)水浴控制反應(yīng)器溫度。反應(yīng)區(qū)有效體積1L，內(nèi)填充聚氨酯，填充密度為30%）：上海龍菲有機(jī)玻璃定制加工制作廠；有機(jī)玻璃：北京景天偉藝裝飾工程有限公司；聚氨酯（polyurethane，PU）：江西耐可化工設(shè)備填料有限公司。

釀酒污水：瀘州市某釀酒廠實(shí)際釀酒污水；低C/N污水：模擬污水。兩種污水水質(zhì)參數(shù)包括總氮（total nitrogen，TN）、銨態(tài)氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽氮（NO3--N）、化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD），具體質(zhì)量濃度見表1。為保證微生物正常生長，加入5 mL/L微量元素混合液（3 g/L MnSO4，3 g/L ZnSO4·7H2O，0.3 g/L FeSO4·7H2O，0.6 g/L CaCl2·2H2O，0.5 g/L H3BO3，3 g/L CuSO4·5H2O）[11]。

表1 釀酒污水水質(zhì)參數(shù)測定結(jié)果Table 1 Determination results of brewing wastewater quality parameters

1.2 儀器與設(shè)備

LQ-LC電子天平：蘇州正峰電子科技有限公司；SH-6600紫外可見分光光度計(jì)：江蘇盛奧華環(huán)境科技有限公司；BT100LY+YZ15蠕動泵：保定融柏恒流泵制造有限公司；ACO-9720曝氣泵：廣東海利有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前，采用總懸浮固體（total suspended solid，TSS）質(zhì)量濃度為4.4 g/L的活性污泥對PU載體進(jìn)行掛膜，掛膜結(jié)束后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。釀酒污水與低C/N污水按照體積比500∶1進(jìn)行混合[11]。高添加比例會導(dǎo)致低C/N污水中COD大量剩余，低添加比例會導(dǎo)致低C/N污水中有機(jī)物濃度無法滿足微生物需求，本實(shí)驗(yàn)采用適中比例500∶1。運(yùn)行期間（共65 d），溫度控制在30 ℃左右，溶解氧（dissolved oxygen，DO）為4 mg/L，初始水力停留時(shí)間（hydraulic retention time，HRT）為36 h，隨后依次縮短至24 h、12 h、6 h以進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。每個(gè)HRT優(yōu)化階段結(jié)束后，取PU附著的生物膜進(jìn)行微生物學(xué)分析，分別命名為HRT 36 h、HRT 24 h、HRT 12 h、HRT 6 h。每天固定時(shí)間取水樣進(jìn)行水質(zhì)分析，檢測色度、TN、NH4+-N、NO3--N、COD變化。

1.3.2 測定方法[12]

NH4+-N采用納氏試劑分光光度法分析；NO3--N采用酚二磺酸光度法分析；TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法分析；色度采用光電比色法分析；COD 采用重鉻酸鉀快速法分析。

1.3.3 釀酒污水細(xì)菌結(jié)構(gòu)分析

高通量測序方法如下[13]：先用試劑盒對獲得的生物樣品進(jìn)行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取，隨后送至美吉（上海）進(jìn)行DNA質(zhì)檢、純化。純化后，使用TBS-380（Turner Biosystems，美國）對16S rRNA V3-V4區(qū)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物進(jìn)行定量。由Miseq平臺對16S rRNA基因高變區(qū)序列進(jìn)行測序，測序區(qū)域選擇V3-V4區(qū)，測序片段為468 bp，測序引物為338F-806R，使用Trimmomatic、FLASH軟件對Miseq測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理獲得干凈數(shù)據(jù)，在Usearch軟件平臺中使用uparse方法將序列按照彼此相似性為97%分歸為許多小組，一個(gè)小組為一個(gè)操作分類單元（operationaltaxonomicunits，OTU），從而得到OTU的代表序列。然后，使用uchime檢測PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的嵌合體序列并從OTU中去除，再用usearch_global方法將優(yōu)化序列map比對回OTU代表序列，最終得到OTU各樣品序列豐度統(tǒng)計(jì)表。BugBase（https：//bugbase.cs.umn.edu/index.html）是一種微生物組分析工具，可以確定微生物組樣本中存在的高水平表型，能夠進(jìn)行表型預(yù)測。BugBase首先通過預(yù)測的16S拷貝數(shù)對OTU進(jìn)行歸一化，然后使用提供的預(yù)先計(jì)算的文件預(yù)測微生物表型。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

水質(zhì)檢測數(shù)據(jù)由Origin 2017進(jìn)行處理、繪圖。微生物多樣性數(shù)據(jù)由美吉平臺（https：//cloud.majorbio.com/）進(jìn)行處理、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒污水強(qiáng)化低C/N污水處理性能與參數(shù)優(yōu)化

將釀酒污水與低C/N污水按照500∶1的比例混合后，反應(yīng)器進(jìn)水質(zhì)量濃度為：COD 301.29 mg/L、NH4+-N 1.99 mg/L、NO3--N 17.23 mg/L、TN 19.7 mg/L。色度被稀釋后為23?？梢姡琋H4+-N質(zhì)量濃度是低于污水處理廠的排放標(biāo)準(zhǔn)5 mg/L，因此，重點(diǎn)考察實(shí)驗(yàn)裝置中的色度、COD、NO3--N、TN的質(zhì)量濃度變化。結(jié)果見圖1。

如圖1（a）所示，每個(gè)階段結(jié)束后分析了出水色度，HRT由36 h依次降低至24 h、12 h、6 h的過程中，色度值逐漸遞增，分別由HRT 36 h的12.8增加為13.5、15.4、19.3。這說明HRT的降低導(dǎo)致了色度去除效果的減弱，這主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)裝置中的微生物的吸附作用時(shí)間縮短導(dǎo)致的[14]。由于釀酒污水提供碳源，因此實(shí)際配水的COD達(dá)到了301.29 mg/L，但是其利用效果還需要評估。圖1（b）顯示了在不同的HRT參數(shù)階段的COD變化。在HRT為36 h的條件下，初始存在濃度波動，由于微生物未能適應(yīng)含有釀酒污水的配水。經(jīng)過一周后，COD逐漸穩(wěn)定，并在最后5 d實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定出水，其平均COD為33.5 mg/L，低于污水處理廠排放濃度閾值。但是，隨著HRT降低，COD呈現(xiàn)上升趨勢，在HRT為24 h、12 h、6 h的條件下，穩(wěn)定后的COD平均值分別為38.8 mg/L、49.12 mg/L、74.72 mg/L，這說明在HRT為6 h的條件下存在COD超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。釀酒污水中的有機(jī)物多為小分子有機(jī)物，包含被水解后形成的脂肪酸、乙醇等，因而可以直接被微生物利用，不存在難以降解和出水濃度超標(biāo)的情況[11]，在HRT為36 h、24 h、12 h的條件下均可以實(shí)現(xiàn)有效利用。但是過短的HRT會導(dǎo)致更高的水利剪切力和更短的微生物接觸時(shí)間，這是導(dǎo)致出水COD高的主要原因[15]。此外，NO3--N是污水處理廠尾水的主要污染物，為了評價(jià)釀酒污水對低C/N污水處理的強(qiáng)化效果，監(jiān)測了各個(gè)參數(shù)條件下的質(zhì)量濃度變化。如圖1（c）所示，NO3--N在初始進(jìn)水質(zhì)量濃度為17.23 mg/L、HRT為36 h的條件下，出水穩(wěn)定后的NO3--N平均質(zhì)量濃度僅為2.62 mg/L。長的HRT更利于實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)形成穩(wěn)定的厭氧區(qū)域，從而保證了反硝化過程的穩(wěn)定性，去除NO3--N。但是HRT的縮短也導(dǎo)致了更高的出水濃度，在HRT為24 h、12 h、6 h的條件下，穩(wěn)定后的NO3--N出水質(zhì)量濃度分別為3.88 mg/L、5.46 mg/L、6.74 mg/L。在HRT縮短至12 h和6 h的時(shí)候，出水濃度上升更顯著，說明36 h和24 h更適合反硝化過程。為了評價(jià)氮素濃度是否超過污水處理廠排放閾值，還連續(xù)監(jiān)測了TN濃度變化。如圖1（d）所示，TN的濃度趨勢與NO3--N一致，這說明實(shí)驗(yàn)過程并未出現(xiàn)更多的NH4+-N。這是由于釀酒污水中的大分子蛋白都幾乎被水解，因而實(shí)驗(yàn)過程未發(fā)生蛋白質(zhì)水解和釋放NH4+-N的過程。在HRT為36 h、24 h、12 h、6 h的條件下，穩(wěn)定后的出水TN質(zhì)量濃度分別為4.96 mg/L、6.32 mg/L、8.02 mg/L、9.24 mg/L，均低于污水處理廠排放閾值15 mg/L。

因此，利用釀酒污水作為碳源提高低C/N污水氮素去除性能的方法被證實(shí)是可行、有效的。這為釀酒污水的處理處置提供了一種新的思路和方法。此外，通過參數(shù)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)HRT為36～12 h均可以滿足污水處理廠的要求。

2.2 不同水力停留時(shí)間釀酒污水下的細(xì)菌菌群差異

氮素去除性能和有機(jī)物利用效果受到菌群調(diào)控。不同的HRT參數(shù)造成菌群差異，從而影響了性能。如圖2（a）所示，在4個(gè)條件下，HRT 36 h、24 h、12 h、6 h的OTU分別為397個(gè)、307個(gè)、335個(gè)、402個(gè)，四個(gè)菌群具有177個(gè)共有OTU。在HRT為24 h和12 h的條件下，可能富集了高豐度的優(yōu)勢菌屬。優(yōu)勢菌屬的高豐度富集可以更利于污染物去除[16]，并鑒別主要的功能菌屬，從菌群富集角度來說，HRT為24 h和12 h可能更利于氮素去除。除了菌屬數(shù)量差異，還利用主成分分析評價(jià)了HRT變化對菌群結(jié)構(gòu)的影響。如圖2（b）所示，HRT為36 h和24 h條件下的樣本距離最近，這說明二者菌群結(jié)構(gòu)是相似的。這也說明主要的優(yōu)勢菌屬可能是相似的，但是需要進(jìn)一步分析菌群組成證實(shí)。HRT 12 h和HRT 6 h條件下的樣本距離最遠(yuǎn)，持續(xù)縮短HRT導(dǎo)致富集的菌群是不同的。因此，HRT的變化會導(dǎo)致菌群差異，推測在HRT為36 h和24 h條件下的優(yōu)勢菌群可能是相似的。

圖2 不同水力停留時(shí)間釀酒污水的菌群韋恩圖（a）和三維主成分分析（b）Fig.2 Venn diagram (a) and three-dimensional principal component analysis (b) of microbial community of brewing wastewater with different hydraulic retention time

2.3 不同參數(shù)下的菌屬組成

為了確定主要的功能菌屬，對菌屬組成進(jìn)行了鑒定。如圖3（a）所示，在HRT為36 h的條件下，主要的優(yōu)勢菌屬為食酸菌屬（Acidovorax）（42.98%）、絲狀菌（Meganema）（16.45%）、因赫拉菌屬（Inhella）（6.95%）、叢毛單胞菌科unclassified_Comamonadaceae（6.18%）、腐螺旋菌科norank_ Saprospiraceae（2.85%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（2.08%）、赫黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）（1.61%）、根瘤菌目unclassified_Rhizobiales（1.26%）。其中Acidovorax的高豐度富集導(dǎo)致了最高的TN去除性能，這表明具有異養(yǎng)反硝化功能的Acidovorax是關(guān)鍵菌屬[17]。圖3（b）中顯示了被檢測菌屬的種族關(guān)系，與異養(yǎng)反硝化菌屬unclassified_Comamonadaceae[18]功能相近的Inhella[19]、噬氫菌屬（Hydrogenophaga）[20]等菌屬協(xié)同進(jìn)行了氮素去除。HRT為24 h條件下的菌群主要由Acidovorax（36.16%）、unclassified_Comamonadaceae（10.27%）、Meganema（6.85%）、Inhella（6.60%）、Pseudomonas（4.59%）、Haliangium（2.34%）、norank_Saprospiraceae（2.21%）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）（1.88%）構(gòu)成。這與圖2的結(jié)論一致，即HRT 36 h和HRT 24 h條件下的優(yōu)勢菌屬是一致的，均為Acidovorax。但是Acidovorax、Meganema、Inhella的豐度出現(xiàn)了降低，這可能是導(dǎo)致低的反硝化性能和COD去除性能的主要原因。此外，在HRT降至12 h時(shí)，菌群組成變化顯著。除了Acidovorax（19.75%）、unclassified_Comamonadaceae（9.41%），還新增了陶厄氏菌屬（Thauera）（6.97%）、Hydrogenophaga（4.98%）、固氮弧菌（Azovibrio）（4.25%）、苯基桿菌屬（Phenylobacterium）（4.02%）。圖3（b）顯示這些菌屬為反硝化菌屬。雖然一些反硝化菌屬豐度增加，但是與TN的去除性能變化趨勢不一致，這進(jìn)一步證實(shí)Acidovorax是主要的反硝化菌屬。當(dāng)HRT持續(xù)降低至6 h時(shí)，主要的優(yōu)勢菌屬由Acidovorax變?yōu)樨S度為15.75%的Hydrogenophaga，此時(shí)Acidovorax豐度僅為9.91%，說明在短的HRT條件是不利于該菌屬優(yōu)勢富集的?？梢缘贸?，HRT降低導(dǎo)致水力剪切力增加，削弱了Acidovorax豐度，從而導(dǎo)致反硝化性能降低。此階段，還監(jiān)測到一些低豐度的反硝化菌屬，比如Meganema（11.89%）、Thauera（9.99%）、脫硫球菌屬（Desulfobulbus）（2.88%）、unclassified_Comamonadaceae（2.63%）、脫氯菌屬（Dechloromonas）（2.17%），這些菌屬對污染物去除起到協(xié)同作用。

圖3 不同水力停留時(shí)間釀酒污水的細(xì)菌菌屬豐度（a）和系統(tǒng)發(fā)育樹（b）Fig.3 Bacterial genera abundance (a) and phylogenetic tree (b) of brewing wastewater with different hydraulic retention time

因此，在釀酒污水作為碳源的移動床生物膜反應(yīng)器中，Acidovorax是主要的異養(yǎng)反硝化菌屬，同步去除NO3--N和COD，此外，長的HRT更利于該菌屬優(yōu)勢富集。

2.4 不同水力停留時(shí)間釀酒污水的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測分析

盡管釀酒污水被證實(shí)可以為低C/N污水反硝化過程提供碳源，但是該技術(shù)的潛在影響還需要進(jìn)一步評估。在釀酒污水的資源化過程，微生物起主要作用。根據(jù)BugBase進(jìn)行了表型分析[21]。如圖4（a）所示，比較了不同HRT條件下的菌群致病表型的豐度。豐度越高，則污水處理過程中存在的致病風(fēng)險(xiǎn)越高。HRT從36 h依次變?yōu)?4 h、12 h、6 h時(shí)，致病表型豐度由40.36%變?yōu)?4.65%、8.07%、3.70%，說明雖然長的HRT利于反硝化過程，但是存在更高的致病風(fēng)險(xiǎn)。這主要是由于攜帶致病表型的細(xì)菌[變形菌門（Proteobacteria）]也實(shí)現(xiàn)了高豐度富集。Proteobacteria攜帶氮素去除功能基因，但是也攜帶了致病基因[22]。致病表型的傳播風(fēng)險(xiǎn)一般由移動元件表型決定。移動元件表型的豐度越高，則細(xì)菌的傳播力越強(qiáng)。圖4（b）分析了不同HRT條件下的移動元件表型豐度值和攜帶細(xì)菌。移動元件的攜帶細(xì)菌主要為變形菌門（Proteobacteria）[23]、厚壁菌門（Firmicutes）[24]、放線菌門（Actinobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）。后三者似乎受到HRT的影響較小，這導(dǎo)致移動元件表型的分布規(guī)律與致病表型的不一致，在HRT為36h、24h、12 h、6h的條件下，其豐度分別為40.53%、33.86%、19.95%、58.01%。這說明過長或者過短的HRT都利于移動元件表型富集，其傳播風(fēng)險(xiǎn)也更大[25]。一般而言，需要綜合考慮二者的富集特點(diǎn)，結(jié)果表明，在HRT為12 h時(shí)污水處理過程的微生物綜合風(fēng)險(xiǎn)因素最低，該條件被視為最佳運(yùn)行條件。

圖4 不同水力停留時(shí)間釀酒污水細(xì)菌的致病表型豐度（a）和移動元件表型豐度（b）Fig.4 Pathogenic phenotype abundance (a) and mobile element phenotype abundance (b) of brewing wastewater with different hydraulic retention time

3 結(jié)論

本研究利用釀酒污水作為微生物碳源，實(shí)現(xiàn)了釀酒污水的資源化利用，并進(jìn)行了HRT優(yōu)化，得出以下結(jié)論：

釀酒污水用作碳源可以強(qiáng)化低C/N污水處理性能。經(jīng)處理后，在HRT為36～12 h的條件下均可以滿足城鎮(zhèn)污水處理廠尾水排放標(biāo)準(zhǔn)。該技術(shù)為釀酒污水資源化提供了新思路，有一定指導(dǎo)意義。在不同的HRT條件下，微生物菌群發(fā)生變化，在HRT為24 h和12 h條件下更利于富集高豐度菌屬。食酸菌屬（Acidovorax）是主要的異養(yǎng)反硝化菌屬，實(shí)現(xiàn)有機(jī)物和NO3--N同步去除。但是其富集受到HRT的調(diào)控，越長富集程度越高。在HRT為12 h時(shí)更利于釀酒污水的資源化過程，此時(shí)微生物致病和傳播風(fēng)險(xiǎn)最低。后續(xù)還應(yīng)對釀酒污水資源化應(yīng)用過程的碳排放、成本等進(jìn)行綜合評價(jià)，此外，溶解氧、填料比等參數(shù)也需要進(jìn)行優(yōu)化。