產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的篩選、耐酸性馴化及蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)分析

張 璋，趙騰飛，李紅霞，宋露露

（茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

白酒是我國(guó)特有的蒸餾酒，具有悠久的歷史和獨(dú)有的特點(diǎn)，在世界蒸餾酒中別樹(shù)一幟。白酒釀造原料中的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶降解可以形成氨基酸和多肽類物質(zhì)。這些水解產(chǎn)物為釀酒功能微生物提供有機(jī)氮源促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖及代謝，有益于發(fā)酵進(jìn)程；同時(shí)，也是形成白酒風(fēng)味的重要前體物質(zhì)[1-2]，白酒生產(chǎn)中蛋白酶的存在對(duì)白酒的產(chǎn)量和風(fēng)味有著重要意義。蛋白酶在自然界中廣泛存在，因其在食品、化學(xué)品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等不同行業(yè)領(lǐng)域的普遍應(yīng)用而得到廣泛認(rèn)可[3]。據(jù)估計(jì)，至2020年全球工業(yè)酶市場(chǎng)總額達(dá)到近62億美元[4]，其中蛋白酶占全球工業(yè)酶市場(chǎng)的60%以上[5]。

芽孢桿菌屬（Bacillussp.）屬于便于培養(yǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，易于進(jìn)行基因操作和表達(dá)性質(zhì)各異的多種酶類，適合于實(shí)驗(yàn)室研究及工業(yè)生產(chǎn)中多個(gè)方面的應(yīng)用[5]。參與蛋白酶生產(chǎn)的芽孢桿菌包括蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等[5-6]，它們具有豐富的水解酶系統(tǒng)，可分泌大量淀粉酶和蛋白酶，在白酒釀造中有著舉足輕重的地位，也是不同香型大曲中共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種[7-8]。有研究表明，酒醅中的枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶的能力最強(qiáng)，巨大芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力最強(qiáng)[9]。芽孢桿菌在白酒發(fā)酵過(guò)程中主要的優(yōu)勢(shì)代謝產(chǎn)物是乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）、2,3-丁二醇和酯類等芳香化合物，為醬香型白酒的復(fù)雜風(fēng)味體系提供了前體物質(zhì)，對(duì)白酒質(zhì)量的穩(wěn)定起到關(guān)鍵的作用[10]。

醬香型白酒傳統(tǒng)窖池發(fā)酵過(guò)程中，窖池內(nèi)的酸性物質(zhì)隨發(fā)酵的進(jìn)行不斷產(chǎn)生和積累，使pH值呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。在窖池酸度下降到一定程度后，微生物的生理活動(dòng)會(huì)受到嚴(yán)重抑制，發(fā)酵能力逐漸下降，從而對(duì)原料轉(zhuǎn)化利用的效率顯著降低，乃至停止[11-12]。因此，針對(duì)白酒發(fā)酵后期高酸度環(huán)境下、仍有旺盛的生理代謝活動(dòng)及較高的原料轉(zhuǎn)化利用率的典型功能微生物的深入研究，不僅對(duì)提升白酒的質(zhì)與量有關(guān)的工藝優(yōu)化有著至關(guān)重要的意義，也是對(duì)此類釀造功能微生物后續(xù)深度開(kāi)發(fā)和利用的必要環(huán)節(jié)。

本研究采用福林酚-酪蛋白透明圈法對(duì)貴州仁懷茅臺(tái)鎮(zhèn)當(dāng)?shù)氐尼u香型白酒大曲中的芽孢桿菌進(jìn)行分離篩選，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察以及16S rDNA序列測(cè)定對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，對(duì)所得菌株進(jìn)行耐酸性馴化，并以蛋白酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，針對(duì)耐酸性馴化前后菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探討，同時(shí)探索了馴化后菌種對(duì)乙醇、葡萄糖、NaCl和乳酸的耐受性，以研究耐酸性馴化對(duì)菌株所產(chǎn)蛋白酶的影響以及在白酒發(fā)酵酒糟降解中的應(yīng)用潛能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬香型白酒大曲樣品：貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠。

1.1.2 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、干酪素：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物、PCR預(yù)混液：生工生物工程（上海）股份有限公司；氫氧化鈉、碳酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、乳酸、L-酪氨酸、福林酚、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇等試劑（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、瓊脂2 g，加入100 mL超純水后混勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB奶粉培養(yǎng)基[13]：酵母浸粉0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、瓊脂2 g、奶粉1 g，加入100 mL超純水后混勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：葡萄糖1 g，硫酸銨0.15 g，磷酸氫二鉀0.15 g、磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.02 g，氯化鈉0.05 g，脫脂奶粉1 g，加入100 mL超純水后充分溶解，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司；DHP-9402型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BSD-YX3200型立式智能精密搖床、YXQ-100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：常州潤(rùn)華電器有限公司；JNOEC XS-212-202型電子顯微鏡：上海圓派科學(xué)儀器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技公司；FA2004N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；UV-5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；PHS-3E型pH校對(duì)儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SIGMA-1-14型低溫離心機(jī)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一生物科技有限公司；S1000TM型PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的分離及初篩[15]

稱取1 g曲樣置于15 mL離心管中，加入10 mL生理鹽水混勻，然后將其置于80 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，期間每隔2 min振蕩混勻。水浴結(jié)束后取上清液用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。選取稀釋度分別為10-5、10-6、10-7、10-8的上清液，以四區(qū)劃線法接種至LB奶粉培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h。觀察篩選平板上單菌落的透明水解圈，并比較透明圈（D）和菌落（d）直徑之間的比值（D/d），挑取比值大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.2 高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌的復(fù)篩

將挑取的菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h，作為種子液。將種子液稀釋到OD600nm值為0.6，按照2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至含有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后12 000 r/min離心10 min，收集發(fā)酵上清液。測(cè)定發(fā)酵上清液中蛋白酶的活力，對(duì)產(chǎn)高活性蛋白酶菌株進(jìn)行篩選。

1.3.3 蛋白酶活力測(cè)定

采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性[16]。蛋白酶活定義：1 mL蛋白酶液在40 ℃、pH 7.2的條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位（U/mL）。

1.3.4 高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將產(chǎn)蛋白酶菌株接種至LB固體培養(yǎng)基上，在30 ℃條件下培養(yǎng)2 d后，挑取單菌落觀察菌落形態(tài)，并將其接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

分子生物學(xué)鑒定：采用苯酚氯仿抽提法[17]對(duì)目標(biāo)菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進(jìn)行提取，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：DNA 0.5 μL，rTaq聚合酶0.5 μL，10×buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL，引物27F和1492各2 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次；72 ℃再延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果使用MEGA 11.0生物學(xué)軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[18-19]，確定菌株的種屬。

1.3.5 高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌耐酸性馴化

馴化點(diǎn)的確定：將篩選得到的高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h進(jìn)行活化，以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于pH值分別為7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0的液體發(fā)酵培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，在發(fā)酵3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、26 h、40 h、48 h、60 h、72 h時(shí)取樣，使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定菌液的OD600nm值，并測(cè)定蛋白酶活力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定三次，繪制生長(zhǎng)曲線及酶活力曲線。

耐酸性馴化：確定馴化點(diǎn)pH后，將篩選菌株從馴化點(diǎn)pH的液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6時(shí)，以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入低于馴化點(diǎn)pH 0.5的100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6時(shí)，再以2%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接入低于馴化點(diǎn)pH 1.0的100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、26 h、40 h、48 h、60 h、72 h時(shí)菌液的OD600nm值，并測(cè)定蛋白酶活力，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定三次，繪制生長(zhǎng)曲線及蛋白酶酶活力曲線。

1.3.6 耐酸性馴化菌株的耐受性分析

參照文獻(xiàn)[20-21]對(duì)馴化后的菌株進(jìn)行乙醇耐受性、葡萄糖耐受性、NaCl耐受性和乳酸耐受性的測(cè)定。

1.3.7 蛋白酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[22-25]

pH對(duì)蛋白酶活力的影響：將底物用不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0）的緩沖液溶解配制，測(cè)定蛋白酶活力，考察pH對(duì)蛋白酶活力的影響。

蛋白酶的pH穩(wěn)定性：將酶液用最適pH值緩沖液稀釋后，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，然后在最適反應(yīng)pH條件下測(cè)定殘余酶活。

溫度對(duì)酶活力的影響：分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下測(cè)蛋白酶的活力，考察溫度對(duì)蛋白酶活力的影響。

蛋白酶的溫度穩(wěn)定性：將酶液在最適溫度條件下保溫，在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，然后在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定殘余酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)蛋白酶菌株的分離及篩選

從醬香型白酒大曲中共分離得到純培養(yǎng)菌株350株，以菌落的透明圈為依據(jù)進(jìn)行初篩，結(jié)果篩選到160株產(chǎn)蛋白酶水解透明圈的菌株，其中D/d較大的17株菌株見(jiàn)表1。由表1可知，17株菌株的D/d為1.39～2.13，其中菌株3#的D/d最高，為2.13，其次為5#和17#，D/d分別為1.90、1.86。因此，將菌株3#、5#及17#作為初篩菌株。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株的透明圈及菌落直徑比值Table 1 Transparent circle and colony diameter ratio of proteaseproducing strains

進(jìn)一步對(duì)3株初篩菌株的產(chǎn)蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定，篩選高產(chǎn)蛋白酶活力菌株，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 初篩菌株產(chǎn)蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of protease activity produced by primary screening strains

由圖1可知，菌株3#的的蛋白酶活力較高，其次為菌株5#，與初篩結(jié)果一致。菌株3#在培養(yǎng)前6 h時(shí)蛋白酶活力上升較為迅速，在培養(yǎng)6～10 h時(shí)酶活力上升變得平緩，在培養(yǎng)14 h時(shí)具有最高酶活力，達(dá)到516.0 U/mL。菌株5#在培養(yǎng)前6 h活性有明顯上升，之后活性變化趨于平緩，在培養(yǎng)10 h時(shí)達(dá)到最高酶活，為201.8 U/mL。菌株17#在培養(yǎng)過(guò)程中蛋白酶活性總體較低，在培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到峰值，為55.6 U/mL。因此，選菌株3#為高產(chǎn)蛋白酶活力的目標(biāo)菌株進(jìn)行研究，并命名為菌株Cy3。

2.2 菌株Cy3的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株Cy3的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株Cy3在LB奶粉培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)白色至乳白色的不透明狀態(tài)，表面有褶皺，邊緣無(wú)規(guī)則不平滑，菌落內(nèi)部濕潤(rùn)且不易被挑起。菌株Cy3經(jīng)革蘭氏染色后結(jié)果呈陽(yáng)性，細(xì)胞形態(tài)為桿狀，單細(xì)胞或多細(xì)胞，可形成橢圓形或兩端鈍圓的芽孢。根據(jù)菌株Cy3的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，初步判定菌株Cy3為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株Cy3的菌落（A）和細(xì)胞（B）形態(tài)特征Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphological characteristics of strain Cy3

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株Cy3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株Cy3與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YHNG19聚于同一分支，具有最高的序列同源性。結(jié)合形態(tài)特征，最終鑒定菌株Cy3為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株Cy3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain Cy3 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株Cy3的耐酸性馴化

2.3.1 菌株Cy3在不同pH環(huán)境下的生長(zhǎng)情況及蛋白酶活力變化

環(huán)境pH值對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝有較大的影響[26]，在白酒發(fā)酵過(guò)程中，由于原料在分解過(guò)程中產(chǎn)生酸性的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致釀造環(huán)境隨著發(fā)酵的進(jìn)行pH趨于下降的趨勢(shì)，這就要求菌株具有一定的耐酸性，從而適應(yīng)發(fā)酵過(guò)程中pH的不斷降低[27]。菌株Cy3在不同pH條件下的生長(zhǎng)曲線及酶活力曲線見(jiàn)圖4。由圖4A可知，菌株Cy3在pH 1～4范圍內(nèi)生長(zhǎng)困難，在pH值為5時(shí)，生長(zhǎng)活力有一定的提高，在pH值為6時(shí)具有最高的生長(zhǎng)活力，而在pH為7時(shí)，OD600nm值又有所下降，但下降幅度不大。菌株Cy3所產(chǎn)蛋白酶酶活力和其生長(zhǎng)活力具有相同的趨勢(shì)，由圖4B可知，在pH為1～4時(shí)，菌株Cy3所產(chǎn)蛋白酶酶活力極低，在pH值為5時(shí)，酶活力有一定的提升，在pH值為6時(shí)酶活力有顯著的提升，在培養(yǎng)至15 h時(shí)可達(dá)到最高酶活505.0 U/mL。因此，選擇將菌株Cy3的最適生長(zhǎng)pH從pH 6馴化至pH 5，以期獲得在較低pH環(huán)境下具有較高生長(zhǎng)活力的馴化菌株。

圖4 不同pH下菌株Cy3的生長(zhǎng)情況（A）及蛋白酶活力（B）變化Fig.4 Changes of growth (A) and protease activity (B) of strain Cy3 under different pH conditions

2.3.2 菌株Cy3耐酸性馴化后的生長(zhǎng)情況及蛋白酶活力變化

微生物的生長(zhǎng)離不開(kāi)合適的pH環(huán)境，pH會(huì)嚴(yán)重影響微生物生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生的酶促反應(yīng)。培養(yǎng)環(huán)境pH的急劇改變，容易引起菌種的快速死亡。因此，可使用pH緩慢改變的策略，幫助微生物逐漸適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境。利用梯度pH降低的逐步馴化方式，將菌株Cy3從pH 6培養(yǎng)環(huán)境馴化至pH 5培養(yǎng)環(huán)境，其在馴化前后的生長(zhǎng)曲線及酶活力曲線見(jiàn)圖5。

圖5 耐酸性馴化前后菌株Cy3的生長(zhǎng)情況（A）及蛋白酶活力（B）變化Fig.5 Changes of growth (A) and protease activity (B) of strain Cy3 before and after acid tolerance acclimation

由圖5可知，經(jīng)過(guò)馴化，成功提高了菌株Cy3在pH 5環(huán)境下的生長(zhǎng)活性，生物量有了顯著的增加。在培養(yǎng)15 h時(shí)達(dá)到最大生物量，OD600nm值為1.764±0.042，是馴化前的2.54倍。然而，所產(chǎn)蛋白酶活力有一定程度的降低，在15 h出現(xiàn)最大酶活，為232.9 U/mL，是馴化前最高酶活的85.5%。酶促反應(yīng)的效率和pH條件有極大的關(guān)系，較低的pH環(huán)境不僅可能導(dǎo)致酶促反應(yīng)的速率降低，甚至可能導(dǎo)致酶這一蛋白質(zhì)類物質(zhì)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變性從而完全喪失活性。馴化后菌株Cy3所產(chǎn)蛋白酶酶活相比馴化前有所降低，極有可能是由于長(zhǎng)期處于較低的pH環(huán)境所引起的。生長(zhǎng)量的顯著增加雖然導(dǎo)致酶活力微略下降，但對(duì)于促進(jìn)低pH環(huán)境下菌種對(duì)原料的利用和轉(zhuǎn)化，仍舊具有一定的積極意義。將馴化后的菌株Cy3命名為菌株Cy3-馴。

2.4 菌株Cy3及Cy3-馴產(chǎn)蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)分析

在白酒發(fā)酵過(guò)程，尤其是醬香型白酒發(fā)酵工藝中，高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵是整個(gè)工藝中的獨(dú)特點(diǎn)及關(guān)鍵點(diǎn)[28]。而溫度、pH等環(huán)境因素的改變對(duì)于酶的酶學(xué)性質(zhì)也起著決定性的影響[29-30]。菌株Cy3、Cy3-馴產(chǎn)蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)見(jiàn)圖6。

圖6 菌株Cy3及Cy3-馴所產(chǎn)蛋白酶粗酶酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 Enzymatic characteristics of crude protease produced by strain Cy3 and Cy3-acclimation

由圖6A可知，菌株Cy3-馴所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度從60 ℃提高至70 ℃，在60～80 ℃范圍內(nèi)仍保留有60%以上的活性。由圖6B可知，菌株Cy3-馴所產(chǎn)蛋白酶為中性蛋白酶，且所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)pH在馴化前后沒(méi)有發(fā)生明顯改變，但在較低pH（pH 5）下的酶活提高了約4倍。有研究表明，pH能夠驅(qū)動(dòng)蛋白在不同狀態(tài)之間切換[31]。因此可能是因?yàn)檩^低的培養(yǎng)pH在一定程度上導(dǎo)致Cy3-馴菌株所產(chǎn)蛋白酶在酸性環(huán)境培養(yǎng)條件下酶的構(gòu)象上產(chǎn)生微弱的改變，從而導(dǎo)致酶活性有較為明顯的提高。由圖6C和圖6D可知，雖然菌株Cy3-馴所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度有一定的提高，但是該酶的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性都有一定的下降。菌株Cy3所產(chǎn)蛋白酶在60 ℃保溫20 h仍保留60%左右的活性，但菌株Cy3-馴在1 h內(nèi)活性就基本喪失，可能是因?yàn)樵?0 ℃的最適溫度下長(zhǎng)時(shí)間的保溫后，較高的溫度對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)有較嚴(yán)重的破壞，從而導(dǎo)致活性快速的喪失。pH穩(wěn)定性也出現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)，菌株Cy3-馴所產(chǎn)蛋白酶在pH 7條件下保溫1 h內(nèi)活性基本喪失，與pH 6條件下保溫60 h仍能保留20%以上活性相比，有了明顯的差異。造成這種現(xiàn)象的原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的低pH培養(yǎng)條件，對(duì)蛋白酶產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的損傷[31]。但是結(jié)合菌株Cy3-馴在較低pH下能夠有較高的生長(zhǎng)活力來(lái)看，雖然損失了部分穩(wěn)定性，但較高的生長(zhǎng)活性對(duì)原料的利用，乃至后期在酸性較大的酒糟的降解應(yīng)用上，仍舊具有一定的價(jià)值。

2.5 菌株Cy3-馴的生物學(xué)特性分析

在白酒發(fā)酵過(guò)程中，菌株對(duì)于滲透壓、乙醇、有機(jī)酸和葡萄糖的耐受性，直接影響了菌株對(duì)原料的利用和轉(zhuǎn)化。鹽濃度越高，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的滲透壓越大，越容易引起細(xì)胞水分甚至結(jié)構(gòu)的變化，從而影響菌株的生物活性[32]。淀粉質(zhì)原料在發(fā)酵過(guò)程中，經(jīng)過(guò)淀粉酶的水解會(huì)生成較高濃度的糖，而過(guò)高的糖類也會(huì)產(chǎn)生較高的滲透壓，從而對(duì)菌株產(chǎn)生危害[32]。乙醇是白酒發(fā)酵過(guò)程中非常重要的代謝產(chǎn)物，過(guò)高的乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)抑制細(xì)胞活性，甚至導(dǎo)致菌株的死亡[33]。同時(shí)，在白酒發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸類物質(zhì)會(huì)大量累積。有機(jī)酸是酯類等風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，但是有機(jī)酸含量過(guò)高又會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重毒害[34]。因此，白酒發(fā)酵過(guò)程中菌株對(duì)于滲透壓、乙醇以及有機(jī)酸的耐受性，對(duì)發(fā)酵的效率和質(zhì)量有著直接的影響。而且有研究發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒酒糟中乳酸的含量高達(dá)1.84%[35]。因此以乳酸為代表考查菌株Cy3-馴對(duì)有機(jī)酸的耐受性，更有利于拓展其后期在酒糟降解中的應(yīng)用。菌株Cy3-馴對(duì)NaCl、葡萄糖、乙醇及乳酸的耐受性見(jiàn)圖7。

圖7 菌株Cy3-馴對(duì)NaCl（A）、葡萄糖（B）、乙醇（C）及乳酸（D）的耐受性Fig.7 Tolerance of strain Cy3-acclimation to NaCl (A), glucose (B), ethanol (C) and lactic acid (D)

由圖7A可知，隨著NaCl含量的逐漸增大，菌株Cy3-馴生長(zhǎng)所受到的抑制也逐漸增加，但其可耐受的NaCl含量可達(dá)15%，說(shuō)明菌株Cy3-馴具有較好的耐鹽性。由圖7B可知，隨著葡萄糖含量的不斷增大，菌株Cy3-馴的生長(zhǎng)受到一定的抑制，說(shuō)明高滲透壓對(duì)其生物活性產(chǎn)生了負(fù)面的影響，但其在葡萄糖含量達(dá)到60%～80%時(shí)，仍具有一定的生命活動(dòng)，說(shuō)明菌株Cy3-馴具有良好的葡萄糖耐受性，可耐受60%的葡萄糖，有利于快速適應(yīng)白酒釀造復(fù)雜的釀造環(huán)境，具有良好的應(yīng)用前景。由圖7C可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株Cy3-馴的生長(zhǎng)速度逐漸下降，尤其在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到4%以后，下降的速率明顯增加，但菌株Cy3-馴在乙醇體積分?jǐn)?shù)12%內(nèi)能夠生長(zhǎng)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%內(nèi)具有較好的生長(zhǎng)，這說(shuō)明該菌株具有較好的乙醇耐受性，可耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)8%，能夠在釀造環(huán)境中發(fā)揮較好的作用。由圖7D可知，菌株Cy3-馴在乳酸體積分?jǐn)?shù)4%以內(nèi)，隨著乳酸體積分?jǐn)?shù)的增加，生長(zhǎng)速率呈下降趨勢(shì)，但在乳酸體積分?jǐn)?shù)3%之內(nèi)具有較好的生命活力，在3%～4%仍能生長(zhǎng)，可見(jiàn)該菌株具有一定的乳酸耐受性，可耐受3%的乳酸，在白酒釀造及副產(chǎn)物降解利用中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

該研究利用透明圈法及蛋白酶活力測(cè)定從醬香型高溫大曲中分離篩選到一株高產(chǎn)蛋白酶活力的菌株Cy3，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察以及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。菌株Cy3的最適生長(zhǎng)pH為6，在此條件下所產(chǎn)蛋白酶活性為505.0 U/mL。通過(guò)對(duì)菌株Cy3進(jìn)行耐酸性馴化后，得到菌株Cy3-馴，其在pH 5環(huán)境下生長(zhǎng)活力相比馴化前有了較大幅度的提升，培養(yǎng)15 h時(shí)OD600nm值提高了2.54倍；其所產(chǎn)蛋白酶最適反應(yīng)pH為pH 6，最適反應(yīng)溫度從60 ℃提高至70 ℃，但酶活及穩(wěn)定性受到酸性培養(yǎng)環(huán)境的影響有一定的降低。菌株Cy3-馴具有較好的NaCl耐受性及葡萄糖耐受性，最高耐受含量分別為15%和60%，同時(shí)在乙醇體積分?jǐn)?shù)8%及乳酸體積分?jǐn)?shù)3%下仍能生長(zhǎng)。本研究對(duì)挖掘該菌株在白酒發(fā)酵乃至酒糟降解等工業(yè)應(yīng)用方面奠定了一定的科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。