高溫大曲中葡萄球菌多樣性解析及其分離株鑒定

程馳新笑，賀子豪，郭 壯，田龍新，周加平，劉菊珍，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441614）

高溫大曲又稱為醬香大曲或茅臺(tái)大曲，是以茅臺(tái)為代表的醬香型白酒釀造過程中重要的糖化劑和發(fā)酵劑[1]。傳統(tǒng)高溫大曲以純小麥作為主要原料，采用人工踩曲的方式完成曲胚的制作，并在相對(duì)開放的環(huán)境中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，富集了制曲環(huán)境、原料和曲母來源的微生物以及制曲工具和踩曲工人攜帶的微生物，經(jīng)過較長時(shí)間的堆積發(fā)酵形成獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)[2]。高溫大曲堆積發(fā)酵過程中，曲心溫度最高可達(dá)到65 ℃，且由于不同曲塊在曲房中的位置不同，各個(gè)曲塊所處的溫度、濕度、氧含量等微環(huán)境有所不同，從而導(dǎo)致成品曲塊的顏色存在差異[3]。其中，分布于上層和邊層的曲塊，與空氣接觸較多且水分散發(fā)快，主要呈現(xiàn)白色，位于中層的曲塊，可利用氧濃度較低、溫度較高且濕度較大，主要呈現(xiàn)黑色，位于下層的曲塊則多呈現(xiàn)為黃色。SHI W等[3]對(duì)同一車間黑色、黃色和白色高溫大曲微生物菌群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬（Staphylococcus）在所有大曲中均存在，且與大多數(shù)含量豐富的揮發(fā)物呈現(xiàn)正相關(guān)。SHANG C H等[4]對(duì)高溫大曲和酒醅中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析亦發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus是高溫大曲和酒醅樣品的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之一。由此可知，Staphylococcus在高溫大曲中分布較為廣泛，進(jìn)一步探究不同顏色高溫大曲中Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)是很有必要的。

Staphylococcus大多數(shù)為非致病菌，少數(shù)為致病菌，在自然界中分布廣泛，尤其適宜在家禽動(dòng)物的體表、腸道黏膜以及飼養(yǎng)加工環(huán)境中生長繁殖[5]。因此，Staphylococcus是大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中較為常見的細(xì)菌微生物之一，且對(duì)食品的色澤、風(fēng)味和滋味品質(zhì)以及安全性具有不可忽視的作用[6-7]。胡傳旺等[8]從日式醬油發(fā)酵的醬醪體系中分離出耐鹽的Staphylococcussp.，其在高鹽條件下代謝產(chǎn)生更多的揮發(fā)性物質(zhì)。龍強(qiáng)等[9]通過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus不僅可以作為肉制品產(chǎn)良好風(fēng)味的發(fā)酵劑，而且還具有降低生物胺含量、促進(jìn)肉制品安全發(fā)酵的特性。生物胺廣泛存在于葡萄酒、啤酒和白酒等發(fā)酵酒中，其含量過高會(huì)導(dǎo)致攝入者產(chǎn)生呼吸紊亂、頭痛心悸等一系列不良應(yīng)激反應(yīng)，嚴(yán)重情況下可能引起大腦出血，甚至呼吸驟停[10]。因此，進(jìn)一步探究高溫大曲中Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)及其物種分布，對(duì)白酒的風(fēng)味品質(zhì)及其安全性可能具有一定的積極作用。

本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)采集自湖北襄陽地區(qū)的黑色、黃色和白色高溫大曲細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus在不同顏色高溫大曲中分布廣泛，且是其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之一?；诖?，本研究篩選出葡萄球菌相對(duì)含量＞10%的大曲樣品，對(duì)黑色、黃色和白色大曲中Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，并采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)高溫大曲中可培養(yǎng)Staphylococcus進(jìn)行分離鑒定，以期為襄陽地區(qū)高溫大曲核心微生物的解析以及白酒風(fēng)味品質(zhì)的提升提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲（黑色、黃色和白色大曲各10份）：采自湖北省襄陽市某醬香型白酒廠。從中篩選出優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬Staphylococcus相對(duì)含量＞10%的樣品，共獲得13份高溫大曲樣品。其中，黑色高溫大曲7份，編號(hào)為H1、H3、H4、H6、H7、H8和H10，黃色高溫大曲4份，編號(hào)為Y2、Y4、Y5和Y7，白色高溫大曲2份，編號(hào)為B1和B7。

1.1.2 化學(xué)試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物27F/1495R和M13F/M14R：天一輝遠(yuǎn)（武漢）生物科技有限公司；10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Buffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）Mix、DNA聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；2×PCR Buffer、rTaq酶和克隆載體pMDR18-T Vecto：寶生物工程大連有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

800Y粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；Veriti FAST梯度PCR儀：美國ABI公司；DYCP-31DN型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Power Edge R930架式服務(wù)器：美國DELL公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺(tái)：美國Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

采用實(shí)驗(yàn)室自編腳本，將納入本研究的13份高溫大曲樣品中隸屬于Staphylococcus的測序序列提取出來，經(jīng)過合并處理后使用QIIME（v1.9.1）平臺(tái)對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，主要流程包括序列校準(zhǔn)與質(zhì)控、操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分與物種注釋以及Staphylococcus群落α多樣性與β多樣性分析[11-13]。

1.3.2 高溫大曲中葡萄球菌的分離鑒定

參考QI N S等[14]的方法并略做修改，稱取10 g高溫大曲樣品于裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分混勻后進(jìn)行倍比稀釋。取梯度（10-5、10-6和10-7）稀釋液100 μL涂布于LB固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h觀察其菌落形態(tài)，挑取疑似葡萄球菌的單菌落進(jìn)行2～3次純化，使用30%甘油于-80 ℃條件下凍存。

參考ZHANG Z D等[15]的方法，對(duì)分離株進(jìn)行DNA提取和16SrDNAPCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25μL）：DNA模板1μL，rTaq酶0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mix 2 μL，5 μmol/L 27F和1495R各0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，用雙蒸水（ddH2O）將體系補(bǔ)充到25 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)擴(kuò)增合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔、連接和轉(zhuǎn)化，之后挑選陽性克隆子送往上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行鑒定，將測序返回的有效序列上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與可視化分析

使用Excel2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用Past3軟件中Kruskal-Wallis檢驗(yàn)對(duì)不同顏色高溫大曲之間的α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，應(yīng)用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對(duì)不同顏色高溫大曲中的Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，使用R（v4.1.0）軟件和Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析，使用BioEdit7.2和MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同高溫大曲樣品的葡萄球菌多樣性分析

本研究首先利用UPARSE算法按照97%相似度閾值對(duì)高溫大曲樣品中所有Staphylococcus序列進(jìn)行OTU劃分，并使用QIIME軟件對(duì)大曲中Staphylococcus的α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，包括Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)。其中，Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)常用于樣品中群落豐富度的評(píng)估，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)常用于樣品中群落多樣性的評(píng)估，數(shù)值越大表明群落豐富度或多樣性越高[16]。13份高溫大曲樣品中Staphylococcus的序列統(tǒng)計(jì)和α多樣性指數(shù)見表1。

表1 高溫大曲樣品中Staphylococcus的序列統(tǒng)計(jì)和α多樣性指數(shù)分析Table 1 Sequence statistics and α diversity index analysis of Staphylococcus in high-temperature Daqu samples

由表1可知，13份高溫大曲樣品中Staphylococcus基因序列相對(duì)豐度占所有原核生物的13.76%～74.19%，可用于后續(xù)Staphylococcus多樣性分析。由表1亦可知，當(dāng)測序量為4 010條序列時(shí)，黑色大曲中Staphylococcus的Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均明顯偏高，其次是黃色大曲和白色大曲。經(jīng)過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種顏色高溫大曲中Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)差異均顯著（P＜0.05）。由此表明，黑色大曲樣品中Staphylococcus豐富度和多樣性均顯著偏高（P＜0.05）。

為探究不同顏色高溫大曲中Staphylococcus的分布情況，本研究基于OTU加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），進(jìn)一步對(duì)黑色、黃色和白色大曲樣品進(jìn)行了空間排布，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，基于加權(quán)UniFrac距離PCoA1和PCoA2的方差貢獻(xiàn)率分別為86.71%和4.98%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率高達(dá)91.69%，可有效解釋樣品之間的差異。由圖1亦可知，黑色大曲和黃色大曲樣品之間具有明顯的分離趨勢(shì)，而白色大曲與其他兩組樣品之間均具有重疊。經(jīng)過多元方差分析發(fā)現(xiàn)，三種顏色高溫大曲中Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)差異顯著（P＜0.05）。由此表明，與上述α多樣性分析結(jié)果一致，不同顏色高溫大曲中Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

本研究團(tuán)隊(duì)前期通過對(duì)黑色、黃色和白色大曲中細(xì)菌類群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Staphylococcus在不同顏色高溫大曲中平均相對(duì)含量均＞10%，是高溫大曲中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬，且Staphylococcus亦是黑色大曲中細(xì)菌群落的生物標(biāo)志物[17]。周志立[18]通過對(duì)紹興黃酒生麥曲的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，較之機(jī)制曲，手工曲在發(fā)酵初期Staphylococcus豐度更高，這主要與手工曲制作過程中踩曲工人腳部攜帶的細(xì)菌相關(guān)，這可能也是導(dǎo)致納入本研究的不同顏色高溫大曲中富含Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)的重要原因。此外，Staphylococcus作為一類需氧型或兼性厭氧型革蘭氏陽性球菌，具有較強(qiáng)的抵抗力和耐受性[19]，而曲房中間層的溫度更高且氧氣含量更低，對(duì)大部分不耐高溫和需氧型微生物的生長繁殖具有一定的抑制作用，從而可能對(duì)分布于曲房中間層黑色大曲中Staphylococcus的含量產(chǎn)生影響。

2.2 不同顏色高溫大曲中葡萄球菌的OTU分析

通過選取OTU中具有代表性的基因序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，從而實(shí)現(xiàn)OTU水平的物種分類。若某一個(gè)OTU在所有樣品中均存在，則將其定義為核心OTU[20]。黑色、黃色和白色大曲樣品中隸屬于Staphylococcus的OTU分布情況見圖2，高溫大曲中核心OTU及其平均相對(duì)含量見圖3。

圖2 基于OTU水平的高溫大曲樣品中Staphylococcus花瓣圖Fig.2 Petal map of Staphylococcus in high-temperature Daqu samples based on OTU level

圖3 基于核心OTU的高溫大曲樣品中Staphylococcus瀑布圖Fig.3 Waterfall diagram of Staphylococcus in high-temperature Daqu samples based on core OTU

由圖2可知，黑色大曲樣品中OTU數(shù)最高，在273～438個(gè)之間，黃色大曲中OTU數(shù)在57～274個(gè)之間，白色大曲中OTU數(shù)分別為57個(gè)和256個(gè)。經(jīng)過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三種顏色高溫大曲中OTU數(shù)差異顯著（P＜0.05）。已有研究顯示，OTU數(shù)目可以用來評(píng)估樣品中群落物種豐富度，OTU數(shù)目越多，表明群落物種豐富度越高[21]。由此表明，與表1分析結(jié)果一致，黑色大曲中Staphylococcus豐富度顯著偏高（P＜0.05）。由圖2亦可知，13份高溫大曲中共有5個(gè)核心OTU。

由圖3可知，高溫大曲中隸屬于Staphylococcus的5個(gè)核心OTU分別為OTU31、OTU3625、OTU5700、OTU7011和OTU8265，平均相對(duì)含量分別為90.68%、0.19%、0.07%、0.19%和0.25%，累計(jì)平均相對(duì)含量達(dá)到91.38%。其中，OTU31可被鑒定到種水平，隸屬于腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。通常情況下，生物學(xué)分類系統(tǒng)包括界、門、綱、目、科、屬和種共7個(gè)分類水平，且分類細(xì)致程度逐漸提高。然而，基于16S rRNA基因序列僅能夠精確分類到屬水平，對(duì)于種水平的分類卻不夠可信[22]。由此表明，15份高溫大曲中存在大量共有的Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)，推測其可能主要隸屬于S.saprophyticus。

值得一提的是，本研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)OTU僅存在于黑色大曲中，包含的序列數(shù)僅占總序列數(shù)的0.02%，亦發(fā)現(xiàn)2個(gè)OTU僅存在于白色大曲中，包含的序列數(shù)不到總序列數(shù)的0.01%，未發(fā)現(xiàn)僅在黃色大曲中出現(xiàn)的OTU。由此表明，黑色和白色大曲中亦存在少量特有的Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)。這與上述α多樣性分析結(jié)果一致，不同顏色高溫大曲中Staphylococcus多樣性差異明顯，且黑色和白色大曲中Staphylococcus多樣性明顯高于黃色大曲。

2.3 不同顏色高溫大曲中葡萄球菌的分離鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

為進(jìn)一步明確高溫大曲中可培養(yǎng)Staphylococcus的構(gòu)成，本研究采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)高溫大曲中Staphylococcus進(jìn)行了分離鑒定。通過對(duì)分離株的菌落形態(tài)和顯微鏡形態(tài)進(jìn)行觀察，將已純化菌株中革蘭氏染色為陽性且鏡檢形態(tài)為球形或橢圓形的分離株初步判定為Staphylococcus。13份高溫大曲樣品中共分離出14株疑似Staphylococcus的分離株，部分菌株菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖4。

圖4 部分疑似葡萄球菌分離株的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.4 Colony (a) and cell (b) morphology of some suspected Staphylococcus isolated strains

由圖4可知，分離株的菌落形態(tài)單一，大多呈現(xiàn)為白色，表面光滑、凸起且圓潤，細(xì)胞形態(tài)均呈圓形，如葡萄狀排列，基本符合Staphylococcus的形態(tài)特征。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

本研究進(jìn)一步對(duì)14株疑似Staphylococcus的分離株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI），通過將各分離株的測序數(shù)據(jù)與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對(duì)，將分離株鑒定到種水平，并下載與分離株同源性不小于99%的標(biāo)準(zhǔn)菌株參比序列，基于鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。

圖5 基于16S rDNA基因序列高溫大曲中葡萄球菌分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of isolated Staphylococcus strains from high-temperature Daqu based on 16S rDNA gene sequences

由圖5可知，從所有高溫大曲中共分離出的14株Staphylococcus中 分 離 株HBUAS51562、HBUAS51564 和HBUAS51568等共9株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株Staphylococcus sapro-phyticussubsp.saprophyticusATCC 15305聚在同一分支，故將其鑒定為腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），同理，分離株HBUAS51561被鑒定為雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum），分離株HBUAS51609和HBUAS51611被鑒定為克氏葡萄球菌（Staphylococcus kloosii），分離株HBUAS51588被鑒定為小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus），分離株HBUAS51592 被鑒定為緩慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus），其中S.saprophyticus占分離株總數(shù)的64.29%，表明S.saprophyticus為高溫大曲中Staphylococcus的主要可培養(yǎng)菌種，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述OTU種水平分析結(jié)果。

由圖5亦可知，從黑色大曲中分離出8株Staphylococcus，分別為S.saprophyticus（75%）、S.gallinarum（12.5%）和S.kloosii（12.5%），從黃色大曲中分離出4株Staphylococcus，分別為S.saprophyticus（50%）、S.kloosii（25%）和S.vitulinus（25%），從白色大曲中分離出2株Staphylococcus，分別為S.saprophyticus（50%）和S.lentus（50%）。由此表明，S.saprophyticus是三種顏色高溫大曲中共有的優(yōu)勢(shì)可培養(yǎng)Staphylococcus，S.gallinarum、S.vitulinus和S.lentus分別是黑色、黃色和白色大曲中特有的可培養(yǎng)Staphylococcus，且相對(duì)含量較高的S.saprophyticus在不同顏色高溫大曲中具有明顯差異，與上述PCoA分析結(jié)果一致。

已有研究報(bào)道，Staphylococcus在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中具有重要作用。S.saprophyticus可以顯著提升白腐乳氨基酸態(tài)氮含量，加快產(chǎn)香速度[23]。Staphylococcus是中國傳統(tǒng)酸肉中重要的微生物類群之一[24]，木糖葡萄球菌（Staphylococ-cus xylosus）可以根據(jù)其生物胺氧化酶活性降低發(fā)酵香腸中生物胺含量[25]，S.xylosus、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）和馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）在發(fā)酵肉制品中可以產(chǎn)生多種香氣化合物[26]。S.saprophyticus可以產(chǎn)生脲酶，從而能夠降低了酒醅中尿素含量，對(duì)控制或減少白酒中氨基甲酸乙酯的含量具有重要作用[27]。由此可知，Staphylococcus對(duì)白酒風(fēng)味品質(zhì)以及酒體安全性方面可能具有一定的積極作用。

3 結(jié)論

不同顏色高溫大曲樣品Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，較之黃色和白色大曲，黑色大曲中Staphylococcus豐富度和多樣性更高。三種顏色高溫大曲中存在大量共有的OTU序列，累積平均相對(duì)含量高達(dá)91.38%，且黑色和白色大曲中亦存在少量特有的Staphylococcus群落結(jié)構(gòu)。通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)，從黑色、黃色和白色大曲中各分離鑒定出8株、4株和2株葡萄球菌，其中S.saprophyticus在三種高溫大曲中均存在，是高溫大曲中Staphylococcus的主要可培養(yǎng)菌種。綜上可知，較之黃色和白色大曲，黑色大曲Staphylococcus豐富度和多樣性更高，且腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）為高溫大曲中Staphylococcus的主要可培養(yǎng)菌種。