• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    頭孢曲松及其雜質(zhì)對斑馬魚肝臟的毒性

    2024-02-27 04:40:30馬媛媛崇小萌劉馨妍謝廣云梁一帆姚尚辰張靖溥
    癌變·畸變·突變 2024年1期
    關(guān)鍵詞:頭孢曲松幼魚斑馬魚

    張 銳,馬媛媛,韓 瑩,崇小萌,劉馨妍,謝廣云,梁一帆,姚尚辰,,張靖溥,

    (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所,北京 100050;2.中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所抗生素室,北京102629;3.中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所,北京 100050)

    模式生物斑馬魚因自身繁殖能力強(qiáng)、生殖周期短、胚胎易獲得、已完成基因組測序及與人類基因的高度保守性等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于藥物篩選和安全性評價(jià)[1-2]。斑馬魚肝臟發(fā)育過程及肝功能均與人類高度相似,斑馬魚肝臟疾病模型已被廣泛應(yīng)用于人類肝毒性評價(jià)實(shí)驗(yàn)中[3-5]。

    頭孢菌素類是以冠頭孢菌培養(yǎng)得到的天然頭孢菌素C 作為原料,經(jīng)半合成改造其側(cè)鏈而得到的一類抗生素,屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素[6]。頭孢曲松是第三代頭孢菌素類藥物,對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)大的抗菌作用。頭孢曲松偶見肝腎功能異常及血液系統(tǒng)改變,如中性粒細(xì)胞下降、血小板下降等,肌注部位可能有疼痛反應(yīng),偶見靜脈炎[7]。由于其藥物合成步驟繁雜,藥物本身不穩(wěn)定較容易產(chǎn)生雜質(zhì),而這些雜質(zhì)與藥物的毒性反應(yīng)相關(guān),容易使藥效降低、抗菌活性減弱,甚至可能會(huì)對人體產(chǎn)生不良反應(yīng)。藥物自身帶入以及降解形成的雜質(zhì)的毒性、安全性等方面的研究是藥品質(zhì)量控制的重要依據(jù)[8]。

    為了評估頭孢曲松及其雜質(zhì)暴露是否會(huì)產(chǎn)生肝臟毒性,本文以AB 品系野生型斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fabp10a:DsRed)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,初步探討頭孢曲松及其雜質(zhì)造成斑馬魚肝損傷的機(jī)制,為深入研究頭孢曲松及其雜質(zhì)造成人肝損傷的機(jī)制提供線索,并為藥物監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 樣品頭孢曲松(純度83.9%)及其雜質(zhì)A(純度100%)、B(純度100%)、C(純度99.3%)、D(純度100%)和E(純度100%),均為白色粉末,且均由中國食品藥品檢定研究院提供,各受試物結(jié)構(gòu)式見表1。油紅O染色試劑購自美國Sigma-Aldrich公司;甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TRIzol 購自美國Invitrogen 公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(M1708)購自美國Promega公司。

    表1 頭孢曲松及其雜質(zhì)A、B、C、D、E的結(jié)構(gòu)式

    1.1.2 溶液的配制及濃度采用新鮮配制的斑馬魚飼養(yǎng)液(1 L純水中加入0.3 g碳酸氫鈉和0.2 g海水晶)為溶劑,頭孢曲松及雜質(zhì)A、B、C、D 每種物質(zhì)均設(shè)置1、2、5 mmol/L 的3 個(gè)不同劑量組;雜質(zhì)E 設(shè)置0.1、0.5、1 mmol/L的3個(gè)劑量組。所有受試物現(xiàn)用現(xiàn)配。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物AB 品系(zebrafish,Danio rerio,AB strain)野生型和肝臟特異性熒光標(biāo)記的Tg(fabp10a:DsRed)轉(zhuǎn)基因斑馬魚嚴(yán)格按照以下條件飼養(yǎng):溫度為(28.5±1) ℃,飼養(yǎng)液電導(dǎo)率為480~550 μs/cm,光照14 h和黑暗10 h循環(huán)進(jìn)行。挑選正常成魚,按雌雄比1∶2的交配方式進(jìn)行繁殖。收集受精后72 h的幼魚,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    實(shí)驗(yàn)分為對照組和受試物組,每組30枚幼魚,受試物組用不同濃度頭孢曲松或雜質(zhì)溶液處理;在正常飼養(yǎng)液中發(fā)育的同批斑馬魚幼魚為對照組。

    1.2.1 野生型斑馬魚肝毒性實(shí)驗(yàn)選取野生型斑馬魚幼魚,分別用頭孢曲松及其雜質(zhì)處理2 d 后,取受精后120 h 的幼魚(每組至少30 枚),顯微鏡下活體觀察幼魚肝臟形態(tài),計(jì)算肝臟的面積尺寸,并通過與對照組比對,用歸一化的肝臟面積百分率判斷頭孢曲松及其雜質(zhì)肝毒性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    歸一化的肝臟面積百分率=受試物組肝面積/對照組肝面積×100%

    1.2.2 轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝毒性實(shí)驗(yàn)選取轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚,分別用不同濃度的頭孢曲松及其雜質(zhì)處理2 d后,取受精后120 h 的幼魚(每組至少30 枚),熒光顯微鏡下活體觀察幼魚肝臟熒光發(fā)光情況,記錄幼魚肝臟熒光強(qiáng)度及面積等數(shù)據(jù),并通過與對照組比對,用歸一化的肝臟面積百分率判斷頭孢曲松及其雜質(zhì)肝毒性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.3 斑馬魚整體油紅O染色實(shí)驗(yàn)選取野生型斑馬魚幼魚,用不同濃度的頭孢曲松及其雜質(zhì)分別處理2 d后,取受精后120 h的幼魚(每組至少20枚)用PBS沖洗3次,轉(zhuǎn)入4%多聚甲醛中,4 ℃下固定過夜;次日將斑馬魚樣品從多聚甲醛中取出,于70%乙醇溶液中漂洗5 s 后放入新鮮配制的油紅O 工作液(油紅O儲(chǔ)備液6 mL,加蒸餾水4 mL,混合,靜置10~20 min,吸取上層液體)中染色5~10 min。用70%乙醇溶液洗去多余染液,PBS 沖洗1 遍,拍照。對幼魚肝臟形態(tài)和脂肪含量變化進(jìn)行觀察,并通過與對照組比對判斷頭孢曲松及其雜質(zhì)肝毒性情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4 斑馬魚轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達(dá)基因篩選頭孢曲松雜質(zhì)B、D和E不易獲得且難溶于水,受試物量不足以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測定,因此只對頭孢曲松、雜質(zhì)A及雜質(zhì)C 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,測序濃度皆為5 mmol/L。取頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 處理2 d 后的野生型斑馬魚幼魚各100 枚,用PBS 清洗3 遍后置于含200 μL RNA later 試劑的EP 管中,隨后置于-20 ℃冰箱備用。用TRIzol 試劑提取總RNA,作為mRNA 測序的建庫起始樣品。建庫測序以及測序數(shù)據(jù)分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

    1.2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析得到差異表達(dá)基因后,為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能,闡述其在分子水平上的作用,利用KOBAS 3.0基于基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路富集分析,Bonferroni校正P<0.05。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用GraphPad Prism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示,應(yīng)用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,組間兩兩比較方差齊性時(shí)用LSD 法,方差不齊時(shí)用Dunnettt檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 頭孢曲松及其雜質(zhì)對野生型斑馬魚肝臟表型的影響

    如圖1 所示,與對照組相比,頭孢曲松及其雜質(zhì)誘導(dǎo)的野生型斑馬魚幼體肝毒性具有劑量-效應(yīng)關(guān)系(r≥0.993,P<0.01)。正常對照組斑馬魚幼魚肝組織結(jié)構(gòu)清晰,呈淺紅色或棕紅色。經(jīng)過不同濃度的受試物處理后,隨著受試物濃度的增加,出現(xiàn)肝臟透明度下降、顏色變暗呈棕色或黑色,肝臟組織紋理無定形及面積改變等現(xiàn)象,顯示頭孢曲松及其雜質(zhì)可導(dǎo)致肝臟變性。

    圖1 頭孢曲松及其雜質(zhì)對野生型斑馬魚肝臟表型的影響

    頭孢曲松及其雜質(zhì)引起的肝毒性表型各不相同。與對照組相比,雜質(zhì)B(r=0.999,P<0.01)、雜質(zhì)D(r=0.993,P<0.01)和雜質(zhì)E(r=0.994,P<0.01)引起斑馬魚肝臟面積隨濃度降低而下降。1 和2 mmol/L 頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和雜質(zhì)C 均導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟面積增大,1 mmol/L 雜質(zhì)C組與對照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而高濃度5 mmol/L 又會(huì)引起斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域減小(均為P<0.01),提示其高濃度下有可能誘發(fā)肝萎縮。歸一化的肝臟面積百分率結(jié)果見圖2。

    圖2 頭孢曲松及其雜質(zhì)處理野生型斑馬魚后的歸一化肝臟面積百分率分析

    2.2 頭孢曲松及其雜質(zhì)對轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟發(fā)育的影響

    如圖3 所示,對照組斑馬魚幼魚健康肝組織結(jié)構(gòu)清晰,形態(tài)正常。與對照組比較,頭孢曲松及其雜質(zhì)均可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼體肝臟形態(tài)發(fā)生改變,其中1 和2 mmol/L 頭孢曲松及雜質(zhì)A 和C 均主要導(dǎo)致斑馬魚肝臟熒光區(qū)擴(kuò)大或熒光強(qiáng)度增強(qiáng),高濃度5 mmol/L組熒光面積減小,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01),提示頭孢曲松及雜質(zhì)A和C有可能在高濃度下誘發(fā)肝萎縮。而雜質(zhì)B、D和E均導(dǎo)致斑馬魚幼魚熒光區(qū)減小或熒光強(qiáng)度減弱(P<0.05 或0.01)。歸一化的肝臟面積百分率結(jié)果見圖4。

    圖3 頭孢曲松及其雜質(zhì)對轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟表型的影響

    圖4 頭孢曲松及其雜質(zhì)處理轉(zhuǎn)基因斑馬魚后的歸一化肝臟面積百分率分析

    2.3 頭孢曲松及其雜質(zhì)對野生型斑馬魚幼魚肝脂肪變性的影響

    油紅O 整體染色法檢測野生型斑馬魚幼魚肝脂肪變性情況如圖5 所示。對照組斑馬魚幼魚肝臟處無染色顏色或顏色較淺,即無脂肪堆積。與對照組相比,頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 可導(dǎo)致幼魚肝臟區(qū)域顏色隨著受試物濃度的升高逐漸加深甚至高濃度組呈現(xiàn)黑色,雜質(zhì)B、D和E處理組肝臟面積減小顏色變暗,脂肪主要堆積在卵黃囊處,且隨給藥濃度的增加現(xiàn)象越明顯。

    圖5 頭孢曲松及其雜質(zhì)對斑馬魚肝臟脂肪含量的影響

    2.4 測序及差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果

    測序結(jié)果如圖6 所示,頭孢曲松給藥組共篩選出735 個(gè)差異表達(dá)基因,其中有553 個(gè)基因表達(dá)上調(diào),182個(gè)基因表達(dá)下調(diào);雜質(zhì)A組共有237個(gè)差異表達(dá)基因,其中93 個(gè)上調(diào),144 個(gè)下調(diào);雜質(zhì)C 組共有237個(gè)差異表達(dá)基因,其中有94 個(gè)上調(diào),143 個(gè)下調(diào)。此結(jié)果表明在給予頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 后,斑馬魚肝臟中基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。

    圖6 頭孢曲松及其雜質(zhì)A和C處理后的差異表達(dá)基因數(shù)量

    2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

    分別對頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 處理組差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析,結(jié)果見圖7。頭孢曲松給藥組主要富集到10條信號(hào)通路,包括代謝途徑、類固醇激素生物合成、卟啉和葉綠素代謝葡萄糖酸鹽的相互轉(zhuǎn)化等相關(guān)通路。雜質(zhì)A 組主要富集到3 條信號(hào)通路,包括代謝途徑、色氨酸代謝和心肌收縮。頭孢曲松雜質(zhì)C 組主要富集到6 條信號(hào)通路,包括MAPK 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、核糖體等相關(guān)通路。

    圖7 頭孢曲松及其雜質(zhì)A和C處理組差異表達(dá)基因的KEGG富集通路直方圖

    3 討 論

    斑馬魚與哺乳動(dòng)物具有相似的生理和功能,可作為篩選候選藥物和化學(xué)品的毒性及安全性評估的體內(nèi)模型[9-10]。斑馬魚同哺乳動(dòng)物模型相比,具有與人類高度遺傳保守性,可以用于篩選藥物在組織中的靶向活性,提供有關(guān)化合物毒性等特性信息[11-12]。

    頭孢曲松屬于第三代頭孢菌素,是世界衛(wèi)生組織基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單中推薦的最安全有效的藥物之一[13]。但由藥物生產(chǎn)工藝或原料帶入的雜質(zhì),或在貯存過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)等可影響藥品的安全性和有效性[14-15]。因此,本文對頭孢曲松及其雜質(zhì)引起的肝毒性進(jìn)行了初步研究。

    結(jié)果顯示,隨著受試物濃度的增加野生型和轉(zhuǎn)基因斑馬魚的肝臟毒性也增加,肝臟發(fā)黑現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重,肝臟面積改變現(xiàn)象逐漸明顯。頭孢曲松及其雜質(zhì)均可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚肝臟形態(tài)發(fā)生改變,頭孢曲松雜質(zhì)B、D和E引起斑馬魚肝臟區(qū)域減小、熒光強(qiáng)度的減弱,肝臟位置顏色變暗,脂肪堆積于卵黃囊處。而1 和2 mmol/L 頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 均導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域增大,熒光面積增大,肝臟區(qū)域顏色變暗;但高濃度5 mmol/L又會(huì)引起斑馬魚幼魚肝臟區(qū)域減小,熒光面積減小,肝臟區(qū)域顏色呈黑色。這些現(xiàn)象提示頭孢曲松及其雜質(zhì)暴露可造成斑馬魚肝臟功能的變化,有可能誘發(fā)肝變性和肝萎縮。

    轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可捕捉不同組織的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化,通過分析不同因素作用下的基因在RNA水平表達(dá)的差異,可將顯著差異表達(dá)的基因與某些生物學(xué)功能聯(lián)系起來,用于檢測早期損傷標(biāo)志物和分子調(diào)控機(jī)制的研究[16]。

    因此本研究進(jìn)一步提取頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C處理組斑馬魚幼魚RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)頭孢曲松給藥組有735 個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生變化,雜質(zhì)A組共有237個(gè)差異表達(dá)基因,雜質(zhì)C組共有237個(gè)差異表達(dá)基因。而分別對頭孢曲松及其雜質(zhì)A 和C 差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn),此3 種不同樣品主要富集通路也存在差異。頭孢曲松給藥組主要富集到10條信號(hào)通路,包括代謝途徑、類固醇激素生物合成、卟啉和葉綠素代謝葡萄糖酸鹽的相互轉(zhuǎn)化等相關(guān)通路;雜質(zhì)A 組主要富集到3 條信號(hào)通路,包括代謝途徑、色氨酸代謝和心肌收縮;雜質(zhì)C 組主要富集到6 條信號(hào)通路,包括MAPK 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、核糖體等相關(guān)通路。

    本研究利用模式生物斑馬魚模型初步評價(jià)頭孢曲松及其雜質(zhì)的肝毒性,結(jié)果表明頭孢曲松及其雜質(zhì)暴露可造成斑馬魚肝臟功能的變化,有可能誘發(fā)肝變性和肝萎縮,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為頭孢曲松及其雜質(zhì)的急性毒理學(xué)分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。鑒于頭孢曲松臨床應(yīng)用可能引起的肝損傷,本研究也為頭孢曲松的藥物監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)評估提供了參考。

    猜你喜歡
    頭孢曲松幼魚斑馬魚
    斑馬魚天生就能辨別數(shù)量
    小斑馬魚歷險(xiǎn)記
    清肺化痰湯聯(lián)合頭孢曲松鈉治療社區(qū)獲得性肺炎(痰熱壅肺證)的臨床觀察
    瓜蔞不同部位對斑馬魚促血管生成及心臟保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    黃顙魚幼魚的賴氨酸需要量
    黃顙魚幼魚對飼料中維生素C的需要量
    不同溫度條件下褐菖鲉幼魚的耗氧率和排氨率
    美羅培南與頭孢曲松鈉國內(nèi)外藥品說明書對比分析
    頭孢曲松鈉與頭孢克肟膠囊序貫治療成人下呼吸道感染42例效果觀察
    幾種石油烴對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)研究
    精品人妻偷拍中文字幕| videossex国产| 亚洲精品色激情综合| 成人国产麻豆网| 亚州av有码| 六月丁香七月| 成年免费大片在线观看| 国产高清三级在线| 亚洲av二区三区四区| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲精品国产成人久久av| 日本欧美国产在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 变态另类丝袜制服| 最近2019中文字幕mv第一页| 97超碰精品成人国产| 久久热精品热| or卡值多少钱| 女人被狂操c到高潮| 日本一本二区三区精品| 日本黄色视频三级网站网址| 久久精品影院6| 男人的好看免费观看在线视频| 国产久久久一区二区三区| 天天一区二区日本电影三级| 26uuu在线亚洲综合色| 日本爱情动作片www.在线观看| 99热全是精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 身体一侧抽搐| 国国产精品蜜臀av免费| 国产日本99.免费观看| 麻豆一二三区av精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 亚洲人成网站高清观看| 女人被狂操c到高潮| 国产乱人偷精品视频| 高清在线视频一区二区三区 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品,欧美在线| 丰满的人妻完整版| 欧美又色又爽又黄视频| 深夜a级毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 麻豆一二三区av精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 黄色欧美视频在线观看| 精品久久久噜噜| 天堂网av新在线| 赤兔流量卡办理| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久这里有精品视频免费| 99久久成人亚洲精品观看| 又爽又黄a免费视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产在视频线在精品| 99热这里只有是精品50| av专区在线播放| 在线a可以看的网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲自拍偷在线| 一级二级三级毛片免费看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 在线观看一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 国产色婷婷99| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 青春草亚洲视频在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产成人a∨麻豆精品| 99久久成人亚洲精品观看| 99视频精品全部免费 在线| 日日撸夜夜添| 最近的中文字幕免费完整| 久久久欧美国产精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 内地一区二区视频在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一边亲一边摸免费视频| 干丝袜人妻中文字幕| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 嫩草影院新地址| 国产v大片淫在线免费观看| 九草在线视频观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产男人的电影天堂91| 少妇熟女欧美另类| 婷婷亚洲欧美| www.色视频.com| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产色爽女视频免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产一级毛片在线| 亚洲av二区三区四区| av免费在线看不卡| 久久久国产成人免费| 波多野结衣巨乳人妻| 日日啪夜夜撸| 夜夜爽天天搞| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产真实伦视频高清在线观看| 日本av手机在线免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产成人精品久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 国产成人aa在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲av熟女| 亚洲第一电影网av| 久久热精品热| 99久久无色码亚洲精品果冻| 黄色欧美视频在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久草成人影院| 国产黄片美女视频| 亚洲精品色激情综合| 51国产日韩欧美| 特级一级黄色大片| 日韩三级伦理在线观看| 国产视频内射| 日本成人三级电影网站| 亚洲无线在线观看| 中出人妻视频一区二区| 日本黄大片高清| 欧美性猛交黑人性爽| 99久国产av精品| 日本成人三级电影网站| 听说在线观看完整版免费高清| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 我的老师免费观看完整版| 成人漫画全彩无遮挡| 如何舔出高潮| 一进一出抽搐gif免费好疼| 嫩草影院精品99| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产成人91sexporn| 麻豆国产av国片精品| 国产精品不卡视频一区二区| 国产一区二区在线观看日韩| 好男人视频免费观看在线| 久久精品久久久久久久性| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精品自拍成人| 国产成人精品婷婷| 69人妻影院| 久久人人爽人人片av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美+日韩+精品| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲精品色激情综合| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日韩亚洲欧美综合| 九九爱精品视频在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品综合久久久久久久免费| www日本黄色视频网| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一区二区三区免费毛片| 美女高潮的动态| 黄色欧美视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲国产精品成人综合色| 日本在线视频免费播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 免费观看精品视频网站| 看非洲黑人一级黄片| 久久九九热精品免费| 色5月婷婷丁香| 亚洲av男天堂| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品久久久久久久电影| 18禁在线播放成人免费| 久久久久久久久久久丰满| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜亚洲福利在线播放| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品电影一区二区三区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 18+在线观看网站| 精品久久久久久久久亚洲| 乱人视频在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产精品1区2区在线观看.| 久久中文看片网| 亚洲高清免费不卡视频| 看黄色毛片网站| 精华霜和精华液先用哪个| 嫩草影院入口| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产高清激情床上av| 久久午夜福利片| 中文字幕久久专区| 26uuu在线亚洲综合色| 禁无遮挡网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 美女大奶头视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 观看免费一级毛片| 国产一区二区三区av在线 | 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产综合懂色| 1000部很黄的大片| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品久久久久久成人av| 寂寞人妻少妇视频99o| 偷拍熟女少妇极品色| 色尼玛亚洲综合影院| 国产免费一级a男人的天堂| av在线播放精品| 观看免费一级毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 在现免费观看毛片| 国产精品一区二区在线观看99 | www.av在线官网国产| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲av不卡在线观看| 欧美三级亚洲精品| 亚洲最大成人av| 国产v大片淫在线免费观看| 高清午夜精品一区二区三区 | 欧美人与善性xxx| 我的女老师完整版在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费看光身美女| 我的女老师完整版在线观看| av女优亚洲男人天堂| 国产伦一二天堂av在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品日产1卡2卡| 亚洲第一区二区三区不卡| 丰满乱子伦码专区| 久久人妻av系列| 久久热精品热| 久久久久九九精品影院| 国产成人a区在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| а√天堂www在线а√下载| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日日啪夜夜撸| 国产精华一区二区三区| 看免费成人av毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 又爽又黄a免费视频| 久久99蜜桃精品久久| 久久国内精品自在自线图片| 成年版毛片免费区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩高清综合在线| .国产精品久久| 亚洲av一区综合| 免费人成在线观看视频色| 亚洲美女视频黄频| 午夜福利成人在线免费观看| 91av网一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲成人av在线免费| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成年免费大片在线观看| 国产乱人视频| 亚洲成人久久爱视频| 精品不卡国产一区二区三区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产伦一二天堂av在线观看| 中国国产av一级| 精品久久久噜噜| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 婷婷亚洲欧美| 超碰av人人做人人爽久久| 久久这里有精品视频免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一本一本综合久久| 熟女电影av网| 97热精品久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 有码 亚洲区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 日日啪夜夜撸| 人妻少妇偷人精品九色| 1000部很黄的大片| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 69av精品久久久久久| 色5月婷婷丁香| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 免费观看精品视频网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 内射极品少妇av片p| 丰满乱子伦码专区| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品国产成人久久av| 中文字幕久久专区| 哪里可以看免费的av片| 欧美一级a爱片免费观看看| 日日撸夜夜添| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 在线观看66精品国产| 91在线精品国自产拍蜜月| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 床上黄色一级片| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人精品一,二区 | 特级一级黄色大片| 国产黄色小视频在线观看| 18+在线观看网站| 国产一区二区激情短视频| 成人综合一区亚洲| 国产男人的电影天堂91| 国产探花在线观看一区二区| 色哟哟·www| 午夜精品一区二区三区免费看| av免费在线看不卡| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日日撸夜夜添| 国产精品永久免费网站| 国产精品久久久久久精品电影| 蜜桃久久精品国产亚洲av| eeuss影院久久| 成人二区视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品无大码| 色视频www国产| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国产精品久久久久久久久免| 黄片wwwwww| 成人二区视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 免费看日本二区| 久久99精品国语久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费在线观看成人毛片| 免费看a级黄色片| 国产日本99.免费观看| 久久久午夜欧美精品| 久久精品夜色国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久99热6这里只有精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 美女高潮的动态| 亚洲欧美精品专区久久| 91精品国产九色| 精华霜和精华液先用哪个| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 级片在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲最大成人av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 中国国产av一级| 日韩成人伦理影院| 国产黄片视频在线免费观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲av二区三区四区| 美女内射精品一级片tv| 亚洲中文字幕日韩| 禁无遮挡网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av中文av极速乱| 美女 人体艺术 gogo| 男人舔奶头视频| 精品无人区乱码1区二区| 只有这里有精品99| 精品日产1卡2卡| 精品国产三级普通话版| 老女人水多毛片| 久久中文看片网| 99久久人妻综合| 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜激情福利司机影院| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美人与善性xxx| 一级二级三级毛片免费看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品一区二区在线观看99 | 26uuu在线亚洲综合色| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本-黄色视频高清免费观看| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品久久久久久av不卡| 国产色婷婷99| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品456在线播放app| 男的添女的下面高潮视频| 日韩欧美精品免费久久| 久久久欧美国产精品| 哪里可以看免费的av片| 99久久成人亚洲精品观看| av国产免费在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产男人的电影天堂91| 午夜久久久久精精品| 色噜噜av男人的天堂激情| 一级av片app| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产麻豆成人av免费视频| 岛国毛片在线播放| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩视频在线欧美| 国产高清激情床上av| 色视频www国产| 在线观看av片永久免费下载| 1024手机看黄色片| 欧美日韩国产亚洲二区| 色综合站精品国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人午夜高清在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| 高清毛片免费看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 在线观看午夜福利视频| 成人永久免费在线观看视频| 波多野结衣高清作品| 久久精品国产亚洲av天美| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产麻豆成人av免费视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久久久国产网址| 成人漫画全彩无遮挡| 久久精品影院6| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日韩强制内射视频| 大香蕉久久网| 精品久久久久久久末码| 1000部很黄的大片| 久久久国产成人精品二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲在久久综合| 成人无遮挡网站| 人体艺术视频欧美日本| 最近的中文字幕免费完整| 深夜a级毛片| av黄色大香蕉| 色综合站精品国产| 国产毛片a区久久久久| 插阴视频在线观看视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99热这里只有精品一区| 国产成人精品婷婷| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中国美女看黄片| ponron亚洲| 啦啦啦啦在线视频资源| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久这里有精品视频免费| 日本免费a在线| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲高清免费不卡视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 老司机福利观看| 亚洲精品色激情综合| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久午夜福利片| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品伦人一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 18+在线观看网站| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品一区二区性色av| 久久精品久久久久久久性| 国产精品久久久久久精品电影| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人午夜高清在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 婷婷色av中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线国产一区二区在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一区二区三区高清视频在线| 91精品国产九色| 国产成年人精品一区二区| 色5月婷婷丁香| 日韩高清综合在线| 国产av在哪里看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品爽爽va在线观看网站| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av一区综合| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久人人爽人人片av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲av熟女| 一区二区三区高清视频在线| 中文字幕免费在线视频6| 欧美精品国产亚洲| 日韩国内少妇激情av| 亚洲av免费高清在线观看| 精品人妻视频免费看| 乱码一卡2卡4卡精品| 嫩草影院精品99| 女同久久另类99精品国产91| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 美女内射精品一级片tv| 2022亚洲国产成人精品| 级片在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 国产午夜福利久久久久久| 成人二区视频| АⅤ资源中文在线天堂| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国内精品宾馆在线| 日韩欧美精品v在线| av在线老鸭窝| 日本爱情动作片www.在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日本熟妇午夜| 麻豆成人午夜福利视频| 热99在线观看视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲天堂国产精品一区在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美区成人在线视频| 美女高潮的动态| 国产男人的电影天堂91| 少妇高潮的动态图| 熟女人妻精品中文字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产成人午夜福利电影在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 村上凉子中文字幕在线| 日本一本二区三区精品| 日本av手机在线免费观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲美女搞黄在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲电影在线观看av| 特大巨黑吊av在线直播| 精品久久国产蜜桃| 国产精品一区二区在线观看99 | 午夜亚洲福利在线播放| 两个人的视频大全免费| 亚洲美女搞黄在线观看| 中国国产av一级| 亚洲欧美精品自产自拍| 99热这里只有精品一区| 舔av片在线| 不卡一级毛片| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲av不卡在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 如何舔出高潮| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲电影在线观看av| 午夜精品国产一区二区电影 | 欧美一级a爱片免费观看看| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 伦精品一区二区三区| 欧美色视频一区免费| 热99在线观看视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产淫片久久久久久久久| 精品一区二区免费观看| 搞女人的毛片| 国产成人aa在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 97超碰精品成人国产| 久久久色成人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲无线观看免费| 在线免费十八禁| 久久精品国产清高在天天线|