弱精子癥合并超重人群精液PRDX2的表達變化與運動能力的相關性分析

胥國麟，葉曉林，錢體軍，王云濤，趙文珍

（大理大學基礎醫(yī)學院，云南 大理 671000）

不孕不育群體的人群數(shù)量逐年增加，其中男性因素導致的不育達到50%〔1〕。對于男性不育而言，弱精子癥是目前較為關注的疾病之一，導致弱精子癥的原因很多，其中活性氧損傷被認為是最主要的原因之一〔2〕。目前，隨著超重人數(shù)的增加，超重人群與弱精子癥之間的關系被廣泛關注，肥胖癥是一種慢性代謝性疾病，能形成過量的活性氧造成慢性全身性損傷，可能會導致精子活力降低及精子畸形率增加〔3〕。過氧化物還原酶家族成員過氧化物還原酶2（peroxiredoxin 2，PRDX2），在卵巢、睪丸、附睪及哺乳動物精子中均有表達，該家族被認為是清除活性氧最有效的家族之一，能夠維持細胞穩(wěn)態(tài)平衡〔4〕。既往研究〔5-6〕證實，PRDX2能與Lgals9共同調節(jié)超重引起的肥胖癥，能減緩冷凍精子活力的下降，與精子DNA 損傷程度相關，雖然該研究證實PRDX2 的抗氧化作用與精子活力有一定的相關性，但缺乏臨床證據描述PRDX2與超重者之間的相關性，尤其是弱精子癥合并超重者精子中PRDX2 的表達情況尚未見報道，故本研究通過收集弱精子癥合并超重人群的精液標本，分析PRDX2 在其精子中表達差異，初步探究PRDX2 與弱精子癥合并體質量超重之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：BX53）；PRDX2 抗體（Abcam 公司，批號：ab109367）；Alexa Flour 488 標記的山羊抗兔IgG（Abcam 公司，批號：ab6712）；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS，實驗室自制）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，Sigma 公司，批號：V900933-100G）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）熒光染料（碧云天生物技術公司，批號：C1002）。

1.2 研究對象收集2021年1月至12月大理大學第一附屬醫(yī)院生殖中心精液常規(guī)檢查的101 份精液標本進行研究。精液樣本的使用經大理大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過，所有實驗根據相關指南和規(guī)定進行，精液提供者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 精液標本準備本研究中精液檢查者需滿足以下條件：①禁欲3~7 d；②年齡20~47歲；③無長期服藥史，無高血壓、糖尿病等慢性疾病，無精索靜脈曲張等先天性生殖系統(tǒng)疾病或后天生殖系統(tǒng)疾病。精液常規(guī)參數(shù)由大理大學第一附屬醫(yī)院生殖中心檢驗科提供。弱精子癥診斷標準：按照WHO《人類精液檢驗與處理的實驗室手冊》（第5 版）中的標準，將精液標本中前向運動精子百分數(shù)（progressive motility，PR）小于<32%者確定為弱精子癥。依據體重指數(shù)（body mass index，BMI）將受試者分為：正常體重者（18 kg∕m2≤BMI<25 kg∕m2）、超重者（BMI≥25 kg∕m2）和肥胖者（BMI≥30 kg∕m2）。將同時符合正常體重及正常活力精子的精液標本納入正常組（60份），將同時符合超重或肥胖及弱精子癥的精液標本納入弱精超重組（41份）。

1.4 參數(shù)檢測通過精液計算機輔助分析系統(tǒng)檢測精液常規(guī)參數(shù)，包括：精子密度、精子活率、PR、直線速率（straight-line（rectilinear）velocity，VSL）、平均軌道速率（average path velocity，VAP）、曲線速率（curvilinear velocity，VCL）、直向（straightness，VSL∕VAP，STR）、擺動（wobble，VAP∕VCL，WOB）、線性（linearity，LIN）、頭側擺幅度（amplitude of lateral head displacement，ALH）、交打頻率（beat-cross frequency，BCF）等。

1.5 免疫熒光檢測新鮮精液標本800g，4 ℃條件下離心10 min，取精子沉淀物用PBS 洗滌3 次制成精子涂片，-80 ℃長期保存。4%多聚甲醛固定精子涂片30 min，PBS 洗滌3 次，0.1%Triton X-100 打孔10 min，再次PBS 洗滌3 次；5% BSA 室溫封閉1 h，一抗PRDX2（1：200 稀釋），陰性對照用PBS 取代，4 ℃孵育過夜；二抗IgG（1：500）室溫避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每次5 min，使用帶DAPI 的防熒光淬滅劑封片，予以相同曝光時間及曝光度進行熒光顯微鏡拍照。

1.6 統(tǒng)計分析采用SPSS 21.0、Image J 及Prsim 8軟件進行統(tǒng)計學分析和作圖，符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，組間差異分析使用t檢驗；使用Pearson 相關分析探討PRDX2 表達量與精液參數(shù)的相關性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 組人群一般資料比較與正常組人群比較，弱精超重組患者的BMI 顯著升高，精子密度、精子活率、PR、STR、LIN、VCL、VSL、VAP等參數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；2 組人群年齡，WOB、ALH、BCF 等參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 2組人群一般資料比較（±s）

表1 2組人群一般資料比較（±s）

注：與正常組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

項目正常組（n=60）弱精超重組（n=41）項目正常組（n=60）弱精超重組（n=41）年齡∕歲BMI∕（kg∕m2）精子密度∕（107個∕mL）精子活率∕%PR∕%STR∕%LIN∕%31.90±5.15 21.46±1.68 38.18±31.58 72.46±14.64 57.18±14.28 85.69±5.07 64.90±8.95 33.07±7.71 27.06±2.64**26.55±25.22*31.47±18.98**17.55±9.96**79.21±16.76*59.34±17.17*WOB∕%VCL∕（μm∕s）VSL∕（μm∕s）VAP∕（μm∕s）ALH∕μm BCF∕Hz 73.33±7.48 49.10±11.48 33.01±8.92 37.04±9.25 2.81±1.38 4.96±1.13 69.28±15.91 36.90±14.68**22.49±10.55**25.75±11.04**2.41±5.53 5.26±2.21

2.2 精子中PRDX2 的定位與表達免疫熒光結果顯示，PRDX2主要定位于精子的中段線粒體處及部分頭核處，弱精超重組精液中PRDX2的熒光表達量顯著低于正常組（P<0.001）。見圖1。

圖1 PRDX2在2組精子中的定位與表達

2.3 PRDX2 熒光表達量與精液參數(shù)的相關性分析相關性分析結果顯示，PRDX2熒光表達量與BMI呈負相關（r=-0.857，P=0.002），與PR 呈正相關（r=0.827，P=0.003），與年齡及其他精液參數(shù)無相關性。見表2。

表2 PRDX2熒光表達量與精液參數(shù)的相關性分析

3 討論

全球男性生育率的下降與精子密度減少及其活力下降密切相關。肥胖、飲食、慢性病、吸煙以及環(huán)境毒素等因素都可能是導致男性不育的主要因素〔7〕。其中，弱精子癥是目前男性不育的主要疾病之一，其病因多種多樣，通常包括泌尿系統(tǒng)感染、免疫反應、染色體異常等原因，有時病因也可能不明確。研究〔8〕表明，肥胖與精子質量下降之間存在密切關聯(lián)。肥胖不僅會導致雄性激素分泌減少和雌激素轉化增加，還可能引起脂肪酸積累和活性氧水平升高，對精液質量和機體造成氧化應激損害。

過氧化物酶家族最初是在酵母中發(fā)現(xiàn)的，如今已證實其在哺乳動物中有成員存在。這個家族的成員主要用于清除由H2O2引起的活性氧，以維護細胞環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡〔9〕。過氧化物酶家族包括6 個成員，分別是PRDX1~PRDX6〔10〕。其中，PRDX2 是典型的2-Cys 成員，其結構與其他成員有所不同。在正常的生理條件下，PRDX2為十聚體和二聚體之間的平衡狀態(tài)，從而導致其更容易被氧化〔11〕。Li 等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，PRDX2 可以作為活性氧清除劑，通過MAPK 通路來抑制動脈粥樣硬化的進展。此外，Talwar 等〔13〕的研究證實，PRDX2 能與轉錄因子STAT3形成復合體，從而對H2O2進行還原。而Duan等〔14〕的研究發(fā)現(xiàn)，PRDX2有助于清除睪丸間質細胞受到的活性氧損傷，維持睪丸激素的分泌，進而保持精子的正常發(fā)育。前期研究〔14〕表明，PRDX2與細胞內環(huán)境的氧化平衡密切相關，能通過清除H2O2維持細胞的正常發(fā)育。因此，推測PRDX2可能在合并肥胖的弱精子癥中發(fā)揮重要作用。

本研究使用精液樣本進行了一般資料分析，對比了正常組和弱精超重組的數(shù)據。結果顯示，在BMI、精子密度、精子活率以及PR方面，2組之間差異具有統(tǒng)計學意義，此外，弱精超重組的VCL、VSL 和VAP顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。有研究〔12〕發(fā)現(xiàn)VCL、VSL 和VAP 與受精能力呈正相關。據報道〔10〕，精子運動能力下降的主要原因包括ATP 水平降低和氧化應激的增加。上述結果提示超重弱精子癥患者存在氧化應激水平增加的情況。免疫熒光結果顯示PRDX2 定位于人精子的部分頭核和中間線粒體處，推測PRDX2 可能參與維護精子的正常形態(tài)和保護精子DNA 免受氧化侵害，對精子后續(xù)的受精能力產生影響。既往研究〔15〕表明，PRDX2能夠在相對較低的H2O2濃度下進行氧化還原反應，有效地維持細胞的氧化還原平衡。初步免疫熒光檢測表明，弱精超重組的PRDX2 熒光表達量明顯降低，與Liu 等〔16〕研究中發(fā)現(xiàn)的PRDX2在弱精子癥中表達下調一致，提示PRDX2 的抗氧化能力可能受損。

相關性分析結果顯示，PRDX2 的熒光表達量與BMI 呈顯著負相關，與PR 呈顯著正相關，但與精子密度等無顯著相關性。再次驗證了免疫熒光結果的可靠性，同時表明PRDX2的表達變化與精子細胞內活性氧水平的變化有關。通過本研究可知，弱精超重組中PRDX2 的表達降低表明其抗氧化能力下降，提示PRDX2 是存在于人精子中的抗氧化酶，推測PRDX2 可能損耗自身能力去維持精子的正?；盍?。此外，PRDX2 的表達與BMI 呈負相關，這提示PRDX2 與肥胖引起的活性氧增加有關，因此，可以推測PRDX2 的變化與精子受氧化應激而導致精子活力降低有關。然而，本研究的局限之處在于只是初步探討了PRDX2 在超重合并弱精子癥人群中的表達情況。另外，對于PRDX2在此類弱精子癥中如何進行調節(jié)的分子機制仍需要深入研究。

綜上所述，本研究再次驗證了肥胖與弱精子癥之間的相關性，并首次在超重人群的弱精子癥患者的精子中描述了PRDX2 的表達情況，提示其PRDX2 的改變與精子活力低下之間可能通過調節(jié)活性氧影響體質量來實現(xiàn)，為進一步研究超重弱精子癥治療提供基礎。