結(jié)核分枝桿菌EsxV∕W 融合蛋白對恥垢分枝桿菌表型及巨噬細(xì)胞功能的影響

余海燕，李玉潔，任 芹，楊國平

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種持續(xù)并嚴(yán)重危害公眾健康的慢性傳染病。卡介苗是目前唯一批準(zhǔn)且廣泛用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，但只對兒童具有保護作用，且保護力在80%左右〔1〕，不能保護青少年和成人免受感染〔2〕。因此，迫切需要開發(fā)新的更有效的抗結(jié)核疫苗和闡明MTB 與宿主之間的相互作用機制用于結(jié)核病的預(yù)防和治療。

研究〔3〕顯示MTB 中的基因與卡介苗存在16 個差異區(qū)域（region of difference，RD）1~16，其中11 個MTB 特異性基因組區(qū)域（RD1、RD4~7、RD9~13 和RD15）在所有卡介苗菌株中缺失。MTB 的Rv3619c和Rv3620c分別編碼EsxV 和EsxW 蛋白，位于MTB的RD9 區(qū)，是卡介苗中缺失基因，參與MTB 的毒力發(fā)揮，有利于桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活；此外，研究〔4-6〕發(fā)現(xiàn)EsxV 與EsxW 可誘導(dǎo)Th1 型保護性免疫，是重要的T 細(xì)胞抗原，可調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，提示esxV和esxW是MTB中的毒力基因及與宿主相互作用中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的基因。與同屬于ESAT-6 家族的早期分泌靶抗原6（early secretory anti-gen-6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）在MTB 感染中發(fā)揮的作用相似，研究〔7-9〕表明編碼ESAT-6 及其伴侶CFP-10的Rv3875和Rv3874基因位于MTB 特異性基因組RD1 區(qū)，是卡介苗中的缺失基因及MTB 重要的毒力因子，對MTB 感染中毒力的發(fā)揮和免疫調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。

與卡介苗生長緩慢、基因操作困難、在免疫功能低下人群存在感染的風(fēng)險相比，恥垢分枝桿菌（Mycolicibacterium smegmatis，MS）是一種生長快，與MTB 基因高度同源，能高效表達(dá)外源性基因的非致病性分枝桿菌，被廣泛用于MTB 感染免疫研究的模式替代菌株〔10〕。研究〔11〕還發(fā)現(xiàn)esxV與esxW在MS 基因組中缺失，不表達(dá)EsxV 和EsxW 蛋白，為此本研究構(gòu)建能表達(dá)EsxV∕W 融合蛋白的重組MS，體外模擬構(gòu)建重組MS 入侵巨噬細(xì)胞時面臨的壓力條件，探究其在多種壓力環(huán)境中的耐受情況以及對巨噬細(xì)胞功能的影響，為闡明EsxV∕W 融合蛋白在MTB與宿主相互作用中的功能提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株、載體、細(xì)胞及實驗動物恥垢分枝桿菌mc2155株、穿梭質(zhì)粒pMV261、表達(dá)質(zhì)粒pET-28a、ANA-1巨噬細(xì)胞由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存；6~8 周齡BALB∕c 小鼠，體質(zhì)量18~20 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-004。

1.2 主要試劑質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker、Pro-Light HRP 化學(xué)發(fā)光檢測試劑（天根生化科技有限公司，批號：U9225、U8717、W9319、W9924）；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ及Hind Ⅲ、T4 DNA 連接酶（Thermofisher公司，批號：91282203、9126655、01035784）；小鼠抗組氨酸（histidine，His）標(biāo)簽抗體、蛋白Marker、青∕鏈霉素混合液（100×）、牛血清白蛋白（組分V）、溶菌酶、咪唑、SDS、吐溫-80（Solarbio 公司，批號：20200631、PR1950、20220310、128P05727、423Q049、1224P031、712L031、1114D016）；可顯影蛋白Marker（Servicebio 公司，批號：MPC2209003-1）；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）（peprotech 公司，批號：315-03）；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（博士德生物工程有限公司，批號：BST15F19BG50）；南美血源胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640（Gibco 公司，批號：2176404、8123163）；ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：M230427-102b）；NO 檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：110922230303）；Middlebrook7H9 培養(yǎng)基（美國BD 公司，批號：928045）；胰蛋白胨、酵母提取物（Solarbio 公司，批號：I607BA0035、I606BA0002）。

2 方法

2.1 重組融合基因序列的構(gòu)建及引物的設(shè)計從NCBI 的Gene數(shù)據(jù)庫中獲取Rv3619c和Rv3620c的堿基序列，去掉Rv3619c基因末端終止子和Rv3620c基因啟動子，經(jīng)疏水性Linker連接。選擇合適的酶切位點并加上保護性堿基。使用Primer Premier 5軟件設(shè)計esxV/W重組基因序列的擴增引物，上游引物：5'-GGAATTCATGACCATCAAC-3'，含EcoRⅠ酶切位點；下游引物：5'-CCCAAGCTTTCAGCTGCTG-3'，含Hind Ⅲ酶切位點。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-esxV∕W的基因序列和引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

2.2 重組蛋白EsxV∕W 的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-esxV∕W及表達(dá)載體pET-28a 以形成黏性末端，回收雙酶切產(chǎn)物esxV∕W重組基因和pET-28a，經(jīng)T4 DNA 連接酶連接后熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 固體平板（含50 mg∕mL 卡那霉素），37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取卡那霉素抗性篩選的單克隆菌落經(jīng)PCR 鑒定后，提取菌液中重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-esxV∕W，熱激轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。將鑒定正確的對數(shù)生長期pET-28a-esxV∕W重組BL21 菌株按1∶100 比例接種于LB 培養(yǎng)液，37 ℃、200 r∕min，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6 后加入終濃度為0.8 mmol∕L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG），于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h，冰水浴超聲裂解菌體后收集上清，用吸附鎳柱純化，經(jīng)10、20、30 mmol∕L咪唑溶液洗滌雜蛋白后，用100 mmol∕L 咪唑溶液洗脫目的蛋白EsxV∕W，對純化后的蛋白進行SDSPAGE和Western blot驗證。

2.3 鼠抗EsxV∕W 重組蛋白多克隆抗體的制備純化的EsxV∕W 重組蛋白以50 μg+（GM-CSF 蛋白佐劑）∕只，經(jīng)皮下注射免疫BALB∕c 小鼠，共3 只。對照組3 只注射等體積0.9%氯化鈉溶液（只首次免疫注射）。每2 周免疫1 次，共3 次，第3 次免疫后1 周內(nèi)眥取血，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 esxV/W 融合基因重組MS 的構(gòu)建及表達(dá)鑒定使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-esxV∕W及穿梭載體pMV261，回收雙酶切產(chǎn)物esxV∕W和pMV261，經(jīng)T4 DNA 連接酶連接后熱激轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 固體平板（含50 μg∕mL 卡那霉素），37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取卡那霉素抗性篩選的單克隆菌落經(jīng)PCR 鑒定后，提取陽性菌液中重組表達(dá)質(zhì)粒pMV261-esxV∕W，電擊轉(zhuǎn)入MS 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于2×YT 固體平板（含50 μg∕mL 卡那霉素），挑取篩選陽性的單克隆菌落經(jīng)PCR 鑒定正確后將重組菌命名為MS-EsxV∕W，同時構(gòu)建含空載質(zhì)粒pMV261 的重組菌MS-vec。取對數(shù)期的MS-EsxV∕W 菌液45 ℃熱擊誘導(dǎo)1 h 后于冰上超聲裂解菌體，收集裂解上清液及沉淀，以制備的鼠抗EsxV∕W 融合蛋白多克隆抗體為一抗，HRP-IgG 為二抗，Western blot鑒定重組融合蛋白EsxV∕W 在MS中的表達(dá)。

2.5 重組MS菌落形態(tài)、成膜能力及生長曲線的測定將OD600值一致的MS-vec 與MS-EsxV∕W 重組菌的菌液稀釋后涂布于2×YT固體平板，37 ℃培養(yǎng)3~5 d，觀察重組菌的菌落形態(tài)并拍照；取OD600值一致的MS-vec 與MS-EsxV∕W 重組菌的菌液，接種于含7H9-OADC、蘇通、2×YT、LB 液體培養(yǎng)基的12 孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3~5 d，觀察生物膜的形成情況并拍照；使MS-vec 與MS-EsxV∕W 重組菌的菌液初始OD600=0.02，37 ℃、200 r∕min 振蕩培養(yǎng)，每6 h取菌液測其OD600值并繪制生長曲線。

2.6 菌落計數(shù)法檢測重組MS在不同環(huán)境條件下的耐受力取1.0 mLOD600值一致的對數(shù)期MS-vec、MS-EsxV∕W 重組菌菌液接種于20 mL 2.5 mg∕mL 溶菌酶（處理0、3 h）、1 μg∕mL 孔雀綠（處理0、6 h）、pH 3.0（處理0、3、6 h）、0.02% SDS（處理0、2、4、6 h）、5 mmol∕L H2O2（處理0、3、6 h）及10 mmol∕L NaNO2（處理0、3、6 h）的M7H9 培養(yǎng)基，分別在上述不同時間吸取100 μL 菌液進行10 倍梯度稀釋，取適宜稀釋度的100 μL稀釋菌液涂板，37 ℃倒置培養(yǎng)3~5 d，計算重組MS 的存活率。細(xì)菌存活率=（處理組菌落數(shù)∕對照組菌落數(shù)）×100%。

2.7 重組MS 對ANA-1 細(xì)胞NO、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）釋放的影響取對數(shù)生長期的MS-vec 與MS-EsxV∕W，按10︰1 的感染復(fù)數(shù)侵染ANA-1 細(xì)胞，分別于侵染后12、24、36、48 h 收集培養(yǎng)上清液，Griess 法檢測上清液中NO 的含量，ELISA法檢測上清液中TNF-α及IL-6含量。

2.8 重組MS在ANA-1細(xì)胞中的存活情況分別于MS-vec、MS-EsxV∕W 侵染ANA-1 細(xì)胞24、48、72 h，以終濃度為0.025%的SDS裂解細(xì)胞15 min，將細(xì)胞裂解液均勻涂布于2×YT 固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)3~5 d，計算重組MS 的胞內(nèi)存活率，分析重組菌在胞內(nèi)的存活情況。細(xì)菌胞內(nèi)存活率=（存活菌落數(shù)∕初始菌落數(shù)）×100%。

2.9 統(tǒng)計分析所有實驗均采用3 個及以上獨立樣本數(shù)據(jù)的均值進行比較，使用Graphpad Prism 9.4軟件進行統(tǒng)計分析，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，3 組及3 組以上采用Two-Way ANOVA 進行比較，以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原核表達(dá)載體和MS-EsxV∕W 的構(gòu)建及鑒定重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-esxV∕W經(jīng)內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后，獲得大小約為637 bp 的單一目的條帶。見圖1A。將其克隆至pET-28a載體中，菌落PCR 顯示esxV∕W重組基因成功插入pET-28a 載體。見圖1B。取雙酶切產(chǎn)物esxV∕W基因與穿梭質(zhì)粒pMV261連接后經(jīng)PCR鑒定構(gòu)建的重組穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV261-esxV∕W成功。見圖1C。電轉(zhuǎn)至MS感受態(tài)細(xì)胞中，建立過表達(dá)EsxV∕W 的MS，即MSEsxV∕W，通過PCR 擴增鑒定目的基因esxV∕W的表達(dá)，結(jié)果表明含重組基因的MS-EsxV∕W 構(gòu)建成功。見圖1D。

圖1 esxV∕W融合基因的PCR擴增及重組菌的PCR鑒定電泳圖

3.2 融合蛋白EsxV∕W 的原核誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-esxV∕W的BL21經(jīng)0.8 mmol∕L IPTG、16 ℃、誘導(dǎo)20 h 后，收集裂解細(xì)菌上清液及沉淀，上清液中的EsxV∕W 融合蛋白經(jīng)吸附鎳柱純化，100 mmol∕L 咪唑溶液洗脫獲得大小約為28 kDa 的單一目的條帶，大小與預(yù)期相符。見圖2A。經(jīng)Western blot 檢測，在大小為28 kDa 位置顯現(xiàn)出清晰條帶。見圖2B。表明所得蛋白為EsxV∕W融合蛋白。重組菌MS-EsxV∕W 經(jīng)熱擊誘導(dǎo)后進行Western blot 檢測，結(jié)果顯示重組融合蛋白在22~28 kDa 位置間出現(xiàn)單一條帶。見圖2C。表明重組融合蛋白EsxV∕W 在MS中表達(dá)成功。

圖2 融合蛋白EsxV∕W的誘導(dǎo)表達(dá)、純化電泳及Western blot鑒定圖

3.3 重組MS 的菌落形態(tài)、生物膜的形成及生長曲線檢測結(jié)果單菌落觀察顯示，MS-vec 與MSEsxV∕W 在平板上菌落均呈干燥的淡黃色菜花樣，菌落直徑MS-vec 為（0.95±0.05）cm，MS-EsxV∕W 為（1.00±0.05）cm，大小相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；生物膜檢測結(jié)果顯示，MS-vec、MSEsxV∕W 在M7H9、蘇通、LB 及2×YT 液體培養(yǎng)基中生物膜形成情況基本一致；通過檢測重組菌在不同時間點的生長情況可以看出，MS-vec 與MSEsxV∕W 在生長的各個時間點生長速率無明顯變化（P>0.05）。見圖3。以上結(jié)果表明EsxV∕W 融合蛋白異源表達(dá)于MS，對其菌落形態(tài)、生物膜形成及生長速率無顯著影響。

圖3 MS-vec與MS-EsxV∕W生長曲線

3.4 重組MS在不同環(huán)境條件下存活能力分析結(jié)果顯示，與MS-vec 相比，MS-EsxV∕W 在溶菌酶、孔雀綠及低pH 等環(huán)境條件下存活率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4A~C。在SDS 環(huán)境條件下存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖4D。在H2O2及NaNO2環(huán)境條件下存活率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖4 E~F。表明EsxV∕W 融合蛋白異源表達(dá)于MS后不改變MS 對溶菌酶、孔雀綠及低pH 應(yīng)激環(huán)境的耐受力，但降低對SDS 的耐受力，增強對H2O2及NaNO2環(huán)境的耐受力。

圖4 MS-vec、MS-EsxV∕W在不同環(huán)境條件下存活能力比較

3.5 重組MS 對ANA-1 細(xì)胞NO、TNF-α 及IL-6 釋放的影響檢測結(jié)果表明侵染后與MS-vec 相比，MS-EsxV∕W ANA-1 細(xì)胞NO 釋放量在48 h 顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖5A。TNF-α釋放量在12、24、36 h 均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖5B。IL-6 釋放量在36 h 顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖5C。表明過表達(dá)EsxV∕W 融合蛋白的重組MS 可促進ANA-1 細(xì)胞TNF-α和晚期NO、IL-6的釋放。

圖5 MS-vec、MS-EsxV∕W對ANA-1分泌NO及細(xì)胞因子的影響

3.6 重組MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活菌落計數(shù)法檢測重組MS 在ANA-1 內(nèi)的存活情況，結(jié)果顯示與MS-vec 相比，MS-EsxV∕W 的胞內(nèi)存活率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖6。表明過表達(dá)EsxV∕W融合蛋白可促進重組MS在ANA-1內(nèi)的存活。

圖6 MS-vec、MS-EsxV∕W在ANA-1內(nèi)的存活率

4 討論

存在MTB 基因組而在卡介苗傳代中丟失的RD區(qū)基因被認(rèn)為是卡介苗毒力與免疫原性減弱的原因，并與MTB 的毒力發(fā)揮密切相關(guān)；RD 區(qū)基因編碼蛋白亦是結(jié)核亞單位疫苗及作為卡介苗加強免疫策略的候選優(yōu)勢抗原；此外，RD 區(qū)基因還作為MTB感染的血清學(xué)檢查標(biāo)志物〔12〕。因此對RD 區(qū)基因的功能研究既是分析MTB 致病機理，也是篩選結(jié)核亞單位疫苗候選抗原的有效途徑。

MTB 作為一種胞內(nèi)寄生菌，巨噬細(xì)胞是其主要的宿主細(xì)胞，MTB 感染宿主后分泌的蛋白質(zhì)可被運輸至宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒力和免疫調(diào)節(jié)作用，從而影響宿主的抗MTB 免疫應(yīng)答反應(yīng)，最終逃避宿主細(xì)胞的免疫殺傷并在宿主體內(nèi)繁殖和擴散，建立感染。對MTB 分泌的效應(yīng)蛋白與宿主細(xì)胞之間相互作用過程的研究有助于理解MTB 的致病過程。研究表明MTB 的RD1 區(qū)基因esat-6（esxA）與cfp-10（esxB）參與MTB 的致病過程及MTB 感染中的免疫調(diào)節(jié)作用〔7-9〕。RD7 區(qū)基因esxO（Rv2346c）編碼蛋白可增強卡介苗在感染巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活〔13〕；esxV∕W作為RD9 區(qū)基因，既往研究表明單獨的EsxV 或EsxW 是重要的T 細(xì)胞抗原〔5，14〕，但其與宿主細(xì)胞的相互作用過程不清楚，為此本研究構(gòu)建MTBesxV∕W融合基因在MS 中的異源表達(dá)菌株MS-EsxV∕W，分析其在與宿主細(xì)胞相互作用中發(fā)揮的功能。通過測定重組菌株的菌落形態(tài)、生物膜和生長曲線，發(fā)現(xiàn)EsxV∕W 不影響MS 的菌落形態(tài)、生物膜形成及生長速率。MTB 在入侵巨噬細(xì)胞過程中，巨噬細(xì)胞會對其施加各種不利于菌體生存繁殖的環(huán)境壓力，例如溶菌酶、酸性、表面活性壓力、氧化壓力、活性氮中間體等，來抵御MTB 的感染。本研究體外模擬MTB 在侵染巨噬細(xì)胞過程中遇到的溶菌酶、孔雀綠、低pH、SDS（表面活性壓力）、H2O2（氧化壓力）、NaNO2等環(huán)境壓力條件，發(fā)現(xiàn)EsxV∕W 融合蛋白異源表達(dá)于MS 后沒有明顯改變MS 在溶菌酶、孔雀綠及酸性環(huán)境下的生存能力，但在SDS 表面活性壓力下的抵抗力降低，對H2O2及NaNO2環(huán)境的抵抗力增強。同時檢測重組MS 感染巨噬細(xì)胞后其胞內(nèi)存活情況，發(fā)現(xiàn)EsxV∕W 融合蛋白異源表達(dá)于MS 后可促進MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，這可能與表達(dá)EsxV∕W融合蛋白增強了MS 對巨噬細(xì)胞內(nèi)氧化壓力以及NaNO2惡劣環(huán)境的抵抗力有關(guān)，表明esxV∕W融合基因在MTB感染中的毒力方面發(fā)揮一定作用。

研究還發(fā)現(xiàn)表達(dá)EsxV∕W 融合蛋白的重組MS侵染巨噬細(xì)胞可促進巨噬細(xì)胞NO 的分泌，及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子TNF-α 與IL-6 分泌，具有誘導(dǎo)Th1 型細(xì)胞分化的作用，表明EsxV∕W 參與MTB感染中誘導(dǎo)宿主免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，EsxV∕W 融合蛋白是MTB 中的毒力蛋白及發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，可改變MS 的表型并調(diào)控ANA-1巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，本研究有助于完善對MTB 的esxV∕W融合基因功能的認(rèn)識，為進一步探索MTB 的致病機理，尋求MTB 中的免疫優(yōu)勢抗原和抗結(jié)核疫苗靶抗原奠定基礎(chǔ)，推動新的安全有效的抗結(jié)核疫苗的研發(fā)。