包頭地區(qū)295例VVC分離株的菌種分布及藥物敏感性分析*

王 娜,張利霞,胡同平,王占黎,石繼海,郭麗娜,易星馳,李宏雨

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2020級(jí)研究生,內(nèi)蒙古包頭 014040;2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院;3.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是由念珠菌感染所致的陰道炎,也稱霉菌性陰道炎。70%～75%的女性在其一生中至少會(huì)感染1次,其中50%的人會(huì)經(jīng)歷復(fù)發(fā),有研究表明,15至50歲的女性中有8%感染并復(fù)發(fā)。每年復(fù)發(fā)≥3次稱為復(fù)發(fā)性外陰陰道念珠菌病(RVVC)[1]。在大多數(shù)研究中,與其他念珠菌[2-3]相比,白念珠菌被報(bào)道為這種感染最常見的原因。本研究對(duì)2021年包頭地區(qū)295例VVC患者標(biāo)本分離的念珠菌培養(yǎng)、鑒定及藥敏情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2021年1月至2021年12月在包頭地區(qū)某三甲醫(yī)院婦科及產(chǎn)科門診就診的女性患者陰道分泌物分離到的295株念珠菌進(jìn)行了研究。所有患者均依據(jù)臨床癥狀和陰道分泌物直接鏡檢及培養(yǎng)陽性診斷為VVC。本研究通過倫理委員會(huì)審查,患者知情同意。

1.2標(biāo)本采集及鏡檢 由專業(yè)的婦科醫(yī)生借助擴(kuò)陰器,用專用一次性無菌拭子于患者陰道后穹窿處采集陰道分泌物,置于無菌培養(yǎng)試管,立即送檢。將陰道分泌物加少量生理鹽水制備成濕片,采用革蘭氏染色方法,通過光學(xué)顯微鏡觀察,若觀察到卵圓形芽生孢子或假菌絲則視為鏡檢陽性。

1.3分離培養(yǎng)及鑒定 采集的陰道分泌物及時(shí)接種于沙保羅平板上,置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,觀察培養(yǎng)結(jié)果并進(jìn)行保存。白念珠菌的鑒定多采用MALDI-TOF MS,難以鑒定的菌株采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌種鑒定。PCR擴(kuò)增使用的引物選用ITS1和ITS4,序列為ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序由上海生工完成,結(jié)果上傳至Genebank進(jìn)行BLAST堿基比對(duì)后分析確定菌株的種別。

1.4藥敏試驗(yàn)及判斷 采用微量肉湯稀釋法對(duì)所有菌株進(jìn)行9種抗真菌藥物體外敏感性試驗(yàn),藥敏試驗(yàn)檢測(cè)的抗真菌藥物包括氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、兩性霉素B、特比奈芬、制菌霉素、5-氟胞嘧啶和卡泊芬凈。所有藥物均來自Sigma公司,C.parapsilosis ATCC 22019和C. krusei ATCC 6258作為質(zhì)控菌株判讀參考CLSI M60[4]。所有分離株于沙保羅傳代后置于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h,確保其活力和純度。菌落懸浮于無菌生理鹽水中,通過血球計(jì)數(shù)板在高倍顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù),用RPMI 1640培養(yǎng)基將菌懸液的最終濃度調(diào)整為1×103～5×103CFU/mL。加入菌液和藥液各100 μL于96孔板中35 ℃下孵育24 h或48 h,根據(jù)CLSI參考指南M27-S4[5]、M59[6]和流行病學(xué)界值進(jìn)行結(jié)果判讀,測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)患者年齡、菌種分布及藥敏情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)分析用SPSS軟件處理,計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1VVC患者年齡分布情況 295例患者13～84歲、平均年齡32.8歲,以31～35歲的年齡段患者百分比最高(30.85%),其次是26～30歲年齡段(20.34%)和21～25歲年齡段(16.27%),在這些患者中,21～40歲年齡段比例達(dá)到82.04%,231例(78.31%)有正常的性生活,36例正處于妊娠狀態(tài),21例長(zhǎng)期口服避孕藥,9例有基礎(chǔ)疾病糖尿病,6例有雌激素用藥史,見表1。

表1 陰道念珠菌感染患者年齡及易感因素分布(n=295)

2.2分子生物學(xué)方法鑒定少見菌種 部分MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果見圖1,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見圖2,其中MALDI-TOF MS鑒定中得分>2分,ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果上傳至Genebank進(jìn)行BLAST堿基比對(duì)同源性達(dá)到99%,為可接受的結(jié)果。

圖1 菌株14號(hào)MALDI-TOF MS結(jié)果圖

圖2 菌株14號(hào)ITS區(qū)基因測(cè)序圖與BLAST比對(duì)圖

2.3VVC致病菌菌種分布 2021年1月至12月共收集到295份確診為VVC患者的標(biāo)本,經(jīng)分離培養(yǎng)鑒定其中白念珠菌分離率居首位,非白念珠菌中以光滑念珠菌和克柔念珠菌為主,見表2。

表2 VVC菌種分布情況

2.4藥敏情況

2.4.1白念珠菌的藥敏情況 白念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的敏感性分別為71.4%和72.2%,對(duì)泊沙康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈和5-氟胞嘧啶的敏感性最高(表3),因制霉菌素和特比奈芬暫無判讀折點(diǎn)只列出具體MIC值分布。制霉菌素的MIC值均集中在0.031 3-0.125 μg/mL之間(不再列出其他值),但特比奈芬的MIC值有119株為>64 μg/mL,占比達(dá)到50.9%(119/234),且MIC值≥2 μg/mL占比達(dá)到92.3%(216/234),耐藥率最高(表4)。

表3 白念珠菌藥物敏感性判讀結(jié)果(μg/mL)

表4 白念珠菌和非白念珠菌對(duì)特比奈芬和制霉菌素的具體MIC值數(shù)量分布

2.4.2非白念珠菌藥敏情況 非白念珠菌中光滑念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性高達(dá)97.6%,只有1株為SDD,反而卡泊芬凈的敏感性不如氟康唑?？巳崮钪榫谐霈F(xiàn)1株伏立康唑耐藥株和1株卡泊芬凈耐藥株(表5),同樣經(jīng)統(tǒng)計(jì)兩者對(duì)特比奈芬的耐藥率最高。少見念珠菌的具體MIC值見表6。

表5 非白念珠菌藥物敏感性判讀結(jié)果(μg/mL)

表6 少見念珠菌對(duì)9種藥物的MIC值(μg/mL)

2.5白念珠菌與非白念珠菌的比較 白念珠菌與非白念珠菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥性相差較大,χ2檢驗(yàn)比較分析發(fā)現(xiàn),白念珠菌對(duì)伊曲康唑的耐藥率高于非白念珠菌(P<0.01),而非白念珠菌對(duì)卡泊芬凈和5-氟胞嘧啶的耐藥率要比白念珠菌高(P<0.01),見表7。

表7 白念珠菌與非白念珠菌耐藥性比較

3 討論

研究表明,陰道內(nèi)乳酸桿菌缺失或菌種比例失調(diào)(產(chǎn)過氧化氫的卷曲乳桿菌減少,幾乎不產(chǎn)過氧化氫的惰性乳桿菌增加)、陰道局部?jī)?nèi)分泌功能的改變(妊娠、口服避孕藥、糖尿病等)及宿主陰道解剖結(jié)構(gòu)和黏膜免疫功能異常是念珠菌過度繁殖、影響VVC發(fā)生發(fā)展的4個(gè)重要方面[7]。本研究標(biāo)本來源于包頭地區(qū)幾所綜合型三甲醫(yī)院,病例診斷通過查詢各院信息系統(tǒng)獲得,培養(yǎng)鑒定及藥敏結(jié)果在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的微生物室完成,該室是全國(guó)真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的成員單位,質(zhì)量控制體系完善,且每年全國(guó)室間質(zhì)評(píng)成績(jī)優(yōu)秀,為本實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)支撐。資料顯示,295例患者中,21～40歲是VVC的高發(fā)年齡,糖尿病、妊娠、避孕藥的使用是排在前三位的易感因素,這些誘因改變了陰道微環(huán)境,打破了微生態(tài)平衡,使念珠菌成為致病菌。

目前發(fā)現(xiàn)可引起VVC的念珠菌菌種已達(dá)15種以上[8]。VVC的病原譜流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明,在不同國(guó)家和同一國(guó)家的不同地區(qū)存在差異,美國(guó)、歐洲和西班牙的研究顯示白念珠菌占70%～89%,光滑念珠菌占3.4%～20%[9]。在亞非地區(qū)(尼日利亞、布基納法索、伊朗、印度等)白念珠菌的比例較低,非白念珠菌的比例較高,尤其是光滑念珠菌比例高達(dá)30%～50%[10]。我國(guó)的多數(shù)研究結(jié)果顯示,引起VVC的病原菌以白念珠菌為主,且占比與美國(guó)某些地區(qū)報(bào)道相近[11-12]。本研究主要通過MALDI-TOF MS的方法鑒定,對(duì)于該法提示的“無鑒定結(jié)果”或鑒定結(jié)果不可靠的分離株,則使用核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)間PCR及DNA序列測(cè)定比對(duì)法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,本地區(qū)VVC常見的病原菌為白念珠菌(占比79.32%),其次是光滑念珠菌(占比13.90%)、克柔念珠菌(占比4.41%),另外尼瓦利亞念珠菌、挪威念珠菌、布加拉念珠菌等少見菌株各1株。中國(guó)真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHIF-NET)數(shù)據(jù)表明,非白念珠菌引起的侵襲性感染逐年增加,其中光滑念珠菌復(fù)合體是主要占比之一,而復(fù)合體中的尼瓦利亞念珠菌的分離株報(bào)道逐漸增多[11]。少見念珠菌存在多重耐藥、致病力強(qiáng)和鑒定困難等特點(diǎn),少見念珠菌已開始在部分地區(qū)迅速流行,這也必將影響陰道念珠菌病原譜的改變。由于不同念珠菌物種具有不同的侵襲性、致病力與耐藥性,因此明確感染部位的念珠菌菌種分布十分必要。

唑類藥物具有價(jià)格便宜、毒性低、使用方便的優(yōu)點(diǎn),常作為治療念珠菌感染的首選藥物。既往多數(shù)文獻(xiàn)表明氟康唑?qū)碜訴VC的白念珠菌分離株具有較高的活性[12-13]。如在美國(guó)、巴西、阿根廷、土耳其、意大利的多項(xiàng)研究表明,氟康唑?qū)VC中白念珠菌分離株的敏感性為90%～100%[14-15]。但在中國(guó),除來自深圳某研究數(shù)據(jù)(98.1% S和88.3% S)[16]與西方國(guó)家有相似的敏感性報(bào)告以外,大多數(shù)報(bào)告顯示敏感率較低[17]。我們的研究報(bào)告顯示,白念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性(71.4%)低于西方報(bào)道,與國(guó)內(nèi)報(bào)道基本相一致,且SDD占比也較多,可能與該地區(qū)臨床用藥習(xí)慣或患者自行用藥有關(guān)。

本研究中白念珠菌對(duì)唑類中的伊曲康唑耐藥率達(dá)38.9%,遠(yuǎn)高于其他唑類藥物。這與Ghaddar等[18]在黎巴嫩(西南亞國(guó)家)的研究結(jié)果相差較大,可能與我們臨床的用藥習(xí)慣不同有關(guān),雖沒有我國(guó)學(xué)者王鳳捐等[19-20]報(bào)道的51.5%高,但仍值得關(guān)注。致伊曲康唑較低活性這一情況可能與我國(guó)臨床使用頻率相對(duì)較高有關(guān),所以我國(guó)在面對(duì)這種情況更需臨床醫(yī)生注意,更要關(guān)注耐藥情況。我們的結(jié)果還表明,20株氟康唑耐藥菌株中有4株對(duì)伏立康唑耐藥,有17株為中介。此外,對(duì)氟康唑敏感性降低的分離株對(duì)伊曲康唑和伏立康唑表現(xiàn)為交叉耐藥,18株對(duì)氟康唑和伊曲康唑均耐藥,4株對(duì)氟康唑和伏立康唑均耐藥。此外,有4株對(duì)氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑均耐藥。念珠菌監(jiān)測(cè)研究表明,對(duì)氟康唑的耐藥性是對(duì)伏立康唑耐藥性的高度預(yù)測(cè)[21],本研究中的多數(shù)氟康唑耐藥株同時(shí)對(duì)伏立康唑的敏感性降低或出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,與念珠菌監(jiān)測(cè)中的高度預(yù)測(cè)較一致,提示在臨床用藥中如氟康唑出現(xiàn)耐藥情況,盡量不考慮使用伏立康唑和伊曲康唑。上述研究中對(duì)氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的耐藥性的增加可歸因于散發(fā)性VVC的頻繁經(jīng)驗(yàn)性治療和病人私自給藥,這可能導(dǎo)致耐藥性白念珠菌引起VVC感染復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。

許多研究已證明,新三唑(泊沙康唑、伊沙康唑和拉夫康唑)對(duì)白念珠菌分離株導(dǎo)致的侵襲性感染有良好體外活性[22],同樣我們的研究中白念珠菌對(duì)泊沙康唑的敏感性高達(dá)95%以上,同時(shí)證實(shí)了兩性霉素B和5-氟胞嘧啶對(duì)VVC中白念珠菌分離株的良好體外活性(對(duì)5-氟胞嘧啶達(dá)95%以上,對(duì)兩性霉素B的敏感性達(dá)到100%)。5-氟胞嘧啶耐藥的分離株對(duì)其他8種抗真菌藥物沒有交叉耐藥性,這與雷巖等[12]的研究一致。雖目前制霉菌素和特比奈芬暫無判讀折點(diǎn),根據(jù)本研究中得到兩藥的具體MIC值分布可看出,本地區(qū)白念珠菌對(duì)制霉菌素表現(xiàn)出良好的藥物活性,但對(duì)特比奈芬而言,其MIC值多數(shù)為>64 μg/mL,提示此藥物可能無效。棘白菌素因其毒性低,且與唑類藥物無交叉耐藥,已被廣泛應(yīng)用于侵襲性念珠菌病[23]。Boikov等[17]從VVC分離的60株白念珠菌對(duì)卡泊芬凈表現(xiàn)出良好的活性,Sharifynia等[24]也報(bào)道了從伊朗RVVC患者中分離出的26株白念珠菌對(duì)卡泊芬凈具有良好的活性。我們的研究中,陰道白念珠菌分離株中對(duì)卡泊芬凈的敏感率大于95%,這與分離自身體其他部位的白念珠菌藥敏報(bào)道一致[25]。

此外需要指出的是,非白念珠菌對(duì)氟康唑有固有的耐藥性,對(duì)抗真菌藥物的耐藥性增加可能會(huì)產(chǎn)生重大后果,導(dǎo)致VVC婦女患者的不良結(jié)果和更多的慢性感染。Yassin等[26]證實(shí)了類似的結(jié)果,報(bào)道了光滑念珠菌對(duì)最常用的抗真菌藥物如氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素和特比萘芬表現(xiàn)出耐藥性,本研究中(表4)光滑念珠菌只有1株氟康唑耐藥株、2株伏立康唑耐藥株、1株泊沙康唑耐藥株和2株卡泊芬凈耐藥株。相比較光滑念珠菌,克柔念珠菌除有1株伏立康唑和卡泊芬凈耐藥株外表現(xiàn)出不一樣的耐藥現(xiàn)象,全部為5-氟胞嘧啶耐藥。但兩者對(duì)特比奈芬均為高耐藥性,提示在臨床治療中特比奈芬的無效。少見念珠菌的耐藥情況現(xiàn)如今越來越得到重視,真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHIF-NET)數(shù)據(jù)顯示其有較高的MIC值且易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[11]。本研究中7株少見菌株大多對(duì)特比奈芬耐藥和平常念珠菌對(duì)氟康唑有相對(duì)較大的MIC值外,其余均為敏感。但本次實(shí)驗(yàn)中少見念珠菌數(shù)量少,不足以說明情況,然而鑒于報(bào)道的VVC數(shù)據(jù)而言,不可忽視其少見念珠菌耐藥所帶來的后果。所以隨著抗真菌藥物在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用,需要重視外陰陰道念珠菌屬的抗真菌敏感性。

綜上所述,包頭地區(qū)VVC病原菌菌種雖仍以白念珠菌為主,但氟康唑的經(jīng)驗(yàn)性治療已受到挑戰(zhàn),尤其是復(fù)發(fā)性VVC。鑒于不同念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性具有差異,臨床應(yīng)及時(shí)進(jìn)行病原學(xué)送檢,根據(jù)感染念珠菌特點(diǎn),參照藥敏結(jié)果合理用藥,為臨床醫(yī)生成功治療VVC的方法選擇提供指導(dǎo),以提高療效減少耐藥菌株的產(chǎn)生。