臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對干燥綜合征患者外周血的免疫調(diào)控研究*

王思博,吳 濤,龐春艷,王 慧

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古包頭 014010)

干燥綜合征(Sj?gren's syndrome,SS)是一種自身免疫性的彌漫性結(jié)締組織病。常見表現(xiàn)有淚腺和唾液腺受累、分泌物減少、組織淋巴細(xì)胞浸潤、免疫系統(tǒng)異常等[1]。臨床的典型癥狀是干燥性角結(jié)膜炎和口干燥癥,發(fā)展嚴(yán)重后可累及多種臟器,甚至累及全身器官[2]。目前SS的發(fā)病原因和作用機制仍不是十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)SS是免疫介導(dǎo)的炎性外分泌病,以外周血T細(xì)胞減少、B細(xì)胞過度增殖為特征[3]。目前臨床上針對臟器尚未受損的病患常輔以代替或?qū)ΠY治療,而較為嚴(yán)重的患者如臟器已有損害的,可配合免疫調(diào)節(jié)治療以減緩病情?？偟膩碚f,目前本病尚無具體根治手段。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells , MSCs)除在特定情況下具有自我更新特性和潛在分化能力外,也具備一定免疫調(diào)節(jié)的作用,被普遍認(rèn)為是一種治療各種免疫疾病的潛在藥物[4]?，F(xiàn)已有實驗證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stromal cells , BM-MSCs)可以用于治療多種自身免疫性疾病,其中就包括BM-MSCs用于SS的治療[5-6]。而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells , UC-MSCs)具備來源豐富,且較容易獲取和被大眾接受的特點,將來可能成為BM-MSCs的替代物,用作自身免疫性疾病的治療研究。但目前UC-MSCs在SS中是否發(fā)揮以及怎樣發(fā)揮控制作用尚不完全清楚,故本研究將提取SS患者外周血的單核細(xì)胞與UC-MSCs進行共培養(yǎng),觀察其對SS治療的作用和機制。

1 對象與方法

1.1對象 經(jīng)過初篩比對2018年1月至2018年12月內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就醫(yī)患者的檢查記錄,選取20例疾病活動期的SS患者作為試驗對象,試驗對象滿足:(1)對照美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)[7]聯(lián)合發(fā)起的原發(fā)性干燥綜合征分類新標(biāo)準(zhǔn)(2016版)合格。未見其他免疫系統(tǒng)疾病,且被診斷為pSS的;(2)EULAR干燥綜合征疾病活動指數(shù)(ESSDAI)評分>8分;(3)年齡在20 ～70歲;(4)能配合完成檢測,臨床資料記錄完整有效。實驗組研究對象排除標(biāo)準(zhǔn)如下:具有頭頸部放射病史、PCR檢測確診丙肝病毒感染(活動性)的;患良性淋巴肉芽腫病和AIDS的;以及確診GVHD、苔蘚樣和皮疹淀粉樣變、IgG4相關(guān)性疾病的。征求待產(chǎn)婦及家屬知情同意后,由包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦新生兒臍帶。無菌條件下取臍帶15 ～20 cm。HBV、HCV、HIV及EB化驗結(jié)果全部陰性。新生兒臍帶離體后放置在50 mL的無菌PBS緩沖液中浸泡。

1.2材料與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)采購自Gibco公司(美國);人外周血淋巴細(xì)胞分離液購于灝洋華科生物科技有限責(zé)任公司(天津);CD11C-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC以及同型對照均購自BD公司(美國);CCK-8試劑盒購于碧云天生物科技有限公司(上海);6-color TBNK Reagent試劑盒購自BD公司(美國);PMA購自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司(杭州);流式細(xì)胞儀BD FACSCantoTM Ⅱ型購自BD公司(美國);酶標(biāo)儀購自雷杜公司(美國)。

1.3實驗方法

1.3.1UC-MSCs的分離與培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下操作取出新生兒臍帶組織,放置在超凈臺內(nèi)用含有青鏈霉素的PBS緩沖液洗滌至無殘血。剔除組織上臍動靜脈,并剝離出凝膠狀的華通氏膠,用組織剪將其分解成1 mm3的樣塊備用。將分解好的樣塊接種到DMEM/F12培養(yǎng)基(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗)的培養(yǎng)皿中,37 ℃的孵箱(體積分?jǐn)?shù)5% CO2)中培育,培養(yǎng)液3～4 d置換1次。細(xì)胞培育至80%～90%,胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng),取第2代UC-MSCs進行后續(xù)實驗。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)鑒定UC-MSCs 將培養(yǎng)獲得的第2代UC-MSCs消化制備成單細(xì)胞懸液,取鼠抗人CD11C、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105單克隆抗體各5 μL加入細(xì)胞懸液。室溫避光孵育0.5 h。PBS洗滌并重懸,之后上流式細(xì)胞儀檢測UC-MSCs表面蛋白表達(dá)。

1.3.3密度梯度離心法提取SS患者的PBMCs 取全血和PBS各2 mL等體積混勻緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上層,淋巴細(xì)胞分離液與被分離液體積為1∶2,2 000 r/min離心20 min,用吸管取出離心后位于中間的白膜層,加入PBS吹打至完全混合;1 500 r/min離心7 min,倒掉上層液體,加入PBS重復(fù)吹打至完全混勻;1 500 r/min離心7 min,棄去上清液,細(xì)胞沉淀備用。

1.3.4CCK-8篩選UC-MSCs與PBMC共培養(yǎng)的最佳比值 取2代UC-MSCs,消化計數(shù)接種96孔板,待細(xì)胞完全貼壁后棄上清,加入PBMC,UC-MSCs與PBMC的比例分別為105∶103、104∶103、103∶102、102∶102、101∶102、102∶103、103∶104、103∶105,分別加入終濃度為(1μM)的刺激因子PMA,共培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,37 ℃恒溫下孵育2 h,450 nm處后測量吸光度(A)值,計算出細(xì)胞存活率,公式如下:存活率=(實驗組A值-空白孔A值)/(對照組A值-空白孔A值)×100%。每組5個復(fù)孔。

1.3.5UC-MSCs與PBMCs共培養(yǎng)及淋巴細(xì)胞亞群的檢測 UC-MSCs與PBMC兩者的細(xì)胞濃度比為103∶102,接種6孔板。實驗分為2組:PBMC+刺激因子PMA組(P+P)、PBMC+UC-MSCs+PMA組(P+P+M),共培養(yǎng)24 h、48 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD16+CD56+淋巴細(xì)胞亞群的比例。

2 結(jié)果

2.1UC-MSCs的形態(tài)以及UC-MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

2.1.1UC-MSCs的形態(tài) 貼壁培育法培養(yǎng)初代組織,細(xì)胞呈梭形或三角形,分散于整個培養(yǎng)皿中,平鋪生長。間充質(zhì)干細(xì)胞在經(jīng)過2代培養(yǎng)后,細(xì)胞為長梭形,整體為旋渦狀,顯微鏡下觀察細(xì)胞純凈均一,數(shù)量豐富。見圖1。

圖1 UC-MSCs生物顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.1.2UC-MSCs表面標(biāo)志物的表達(dá) 標(biāo)志物CD105表達(dá)率96.90%、CD90表達(dá)率99.80%、CD44表達(dá)率為91.30%;陰性標(biāo)志物CD34、CD45及CD11C的表達(dá)率為0.10%、0.10%、0.00%。見圖2。

圖2 UC-MSCs流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型結(jié)果

2.2CCK-8法檢測UC-MSCs與PBMC共培養(yǎng)后,PBMC的增殖情況 UC-MSCs∶PBMC按比例為105∶103、104∶103、103∶102、102∶102、101∶102、102∶103、103∶104、103∶105分別共培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞存活率分別為32.50%、39.59%、68.30%、24.84%、15.67%、24.26%、23.99%、68.30%。與103∶105比較,103∶102細(xì)胞存活率最高,用作后續(xù)實驗培養(yǎng),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 CCK-8法篩選UC-MSCs生長的最適濃度

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測UC-MSCs和PBMCs共培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞亞群的變化 記錄流式細(xì)胞術(shù)檢測UC-MSCs和PBMCs共培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞亞群比例。CD3+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞的比例減少(P<0.05),CD16+CD56+NK細(xì)胞的比例、CD3+CD4+T細(xì)胞的比例、CD4+/CD8+無明顯變化(P>0.05)。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測UC-MSCs和PBMCs

3 討論

目前SS的發(fā)病機制尚不完全明確,近年來多項研究表明SS的發(fā)病與T細(xì)胞亞群相關(guān)。在SS患者的唾液腺中有大量CD4+T和B細(xì)胞浸潤,早期大部分為CD4+T細(xì)胞,而B細(xì)胞的積累發(fā)生在疾病后期[8]?；罨腡細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和誘導(dǎo)B細(xì)胞活化介導(dǎo)了疾病的發(fā)生發(fā)展[9]。有研究顯示,與健康人相比,SS患者CD8+T細(xì)胞比例升高,CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞比例降低[10]。本實驗將SS患者外周血T細(xì)胞與UC-MSCs共培養(yǎng)后,患者外周血殺傷性T淋巴細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞百分比降低,而輔助性T細(xì)胞變化無意義。殺傷性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞可積極參與到調(diào)節(jié)SS患者的自身免疫過程中,能夠改變SS患者唾液腺組織病理的表達(dá)[11]。我們的研究發(fā)現(xiàn)UC-MSCs細(xì)胞對SS患者免疫T細(xì)胞的作用體現(xiàn)于UC-MSCs能夠抑制T細(xì)胞的表達(dá),本實驗結(jié)果補充證實了UC-MSCs通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的百分比,或可發(fā)揮緩解SS患者疾病進展的作用。

SS患者存在的B淋巴細(xì)胞過度活化情況,可作為診斷疾病的特殊標(biāo)志[12]。B細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物表達(dá)量和表型產(chǎn)生改變,導(dǎo)致其作用能力發(fā)生偏倚,從而引起免疫異常反應(yīng)[13]。本實驗還觀察到經(jīng)過共培養(yǎng)處理的SS患者外周血CD19+表達(dá)量回歸正常,這表明UC-MSCs可以抑制SS患者外周B細(xì)胞功能。后續(xù)研究可繼續(xù)深入探究UC-MSCs對其它表型B細(xì)胞的激勵反饋過程。

雖然MSCs的免疫抑制能力已在幾種自身免疫性疾病中得到證實,如RA、SLE和EAE[14-15],但距離真正將UC-MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力應(yīng)用在臨床上還有很長的路要走。本研究結(jié)果證實了人體UC-MSCs可抑制SS患者外周血殺傷性T淋巴細(xì)胞和抑制性T淋巴細(xì)胞,并降低CD19+表達(dá)量,可在強化治療中起到應(yīng)用。但是UC-MSCs在體外對SS患者的具體作用機制還不明確,也沒有得到動物實驗驗證,UC-MSCs對不同表型的T細(xì)胞產(chǎn)生的抑制能力差異仍不清楚。這些疑問將在后續(xù)研究中進一步分析。