缺血性腦卒中患者的循環(huán)免疫circRNA-miRNA-mRNA軸預(yù)測(cè)*

薛如卉,劉 丹,張廣煒

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040;2. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科)

急性缺血性卒中(Acute Ischemic Stroke,AIS)是一種由大腦血液流量減少,導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷引起的醫(yī)療緊急情況[1]。最近的研究表明,對(duì)急性缺血性卒中的早期識(shí)別、緊急介入治療以及在專門的卒中中心進(jìn)行治療可以顯著降低卒中相關(guān)的發(fā)病率和死亡率[2]。MRI檢測(cè)急性缺血性卒中的敏感度優(yōu)于CT,是急性缺血性卒中診斷的重要手段[3]。由于計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)經(jīng)濟(jì)、便捷,CT仍然作為卒中診斷的首選影像學(xué)方法[4]。然而,由于院前快速識(shí)別卒中的方法有限,對(duì)AIS患者的及時(shí)干預(yù)往往受到阻礙。因此,目前迫切需要一種高效且便捷的方法用于急性缺血性腦卒中的快速診斷。隨著測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,越來越多研究提出AIS患者在外周血中差異表達(dá)某些circRNAs[5-6]、miRNAs[7]可能是診斷AIS的生物標(biāo)志物或潛在的治療靶點(diǎn)。據(jù)此,本研究采用生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)可能的免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),分析circRNAs、miRNAs在缺血性卒中的分子診斷和個(gè)體化治療中的作用。

1 材料與方法

1.1微陣列數(shù)據(jù) 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)中獲得了IS的3個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集GSE16561、GSE195442和GSE117064。GSE16561基于GPL6883平臺(tái),包括63個(gè)外周血樣本,病例組(共39例)入組標(biāo)準(zhǔn)為:年齡>18歲,MRI診斷為缺血性卒中,對(duì)照組(共24例)為非卒中神經(jīng)健康者。GSE195442是基于GPL31275平臺(tái),采用芯片技術(shù)對(duì)10例急性缺血性卒中患者和10例對(duì)照組患者的血漿外泌體進(jìn)行微陣列和生物信息學(xué)分析,研究了血漿外泌體中circRNA的圖譜和推定功能。GSE117064基于GPL21263平臺(tái),總共1 785份樣本的血清microRNA譜,其中包括173名腦血管疾病患者,1 612名非腦血管疾病對(duì)照。

1.2方法

1.2.1差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的鑒定 使用R軟件的limma包對(duì)下載的數(shù)據(jù)集GSE16561進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選。兩組間的DEGs采用學(xué)生t檢驗(yàn)和log2fold change(FC)值進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。在閾值P-Value<0.05和|log2foldchange(FC)|>0.5的情況下,通過R軟件ggplot2包構(gòu)建火山圖,識(shí)別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEGs。

1.2.2PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè)及模塊分析 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)是通過STRING v11.5在線工具[相互作用基因檢索搜索工具,STRING(https://string-db.org/)]構(gòu)建的。利用Cytoscape 3.9.1插件CytoNCA中的介數(shù)中心度(Betweenness Centrality)計(jì)算了PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。根據(jù)中心性評(píng)分,確定PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),然后推導(dǎo)出評(píng)分較高的前15個(gè)基因。

1.2.3功能富集分析 基于DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),我們對(duì)15個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析,GO分析包括以下領(lǐng)域:生物過程(Biological Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF),P-Value<0.05的具有統(tǒng)計(jì)意義。

1.2.4與靶基因相關(guān)的miRNAs 使用mirTargets 2.0,一個(gè)發(fā)現(xiàn)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miRNA-mRNA相互作用的平臺(tái),將前15個(gè)中心基因定位到相應(yīng)的miRNAs上,構(gòu)建miRNAs-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5差異表達(dá)circRNAs的篩選及靶標(biāo)miRNAs的預(yù)測(cè) 采用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE195442中的IS組和對(duì)照組的血清樣本進(jìn)行差異circRNAs的分析。具有P-Value<0.05和|log2foldchange(FC)|>1的circRNAs被認(rèn)為是差異表達(dá)的circRNAs。結(jié)合Yang等人[8]的文獻(xiàn)挑選出顯著差異[P-Value<0.05,|log2fold change(FC)|>1]并且已經(jīng)經(jīng)過PCR驗(yàn)證過的差異circRNAs。使用Circular RNA Interactome 預(yù)測(cè)circRNAs的靶標(biāo)miRNAs。通過Cytoscape 3.9.1繪制miRNAs和circRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè) 分別對(duì)根據(jù)基因預(yù)測(cè)的miRNAs和根據(jù)circRNAs預(yù)測(cè)的miRNAs取交集,預(yù)測(cè)可能的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。使用在線可視化軟件Draw Venn Diagram生成miRNAs的維恩圖。預(yù)測(cè)可能的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.7免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選 在ImmPort數(shù)據(jù)庫中獲得了免疫相關(guān)基因(Immune-related genes,IRGs),并將IRGs與我們預(yù)測(cè)可能的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因取交集,篩選出免疫相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.8免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNAs驗(yàn)證及構(gòu)建 使用GSE117064數(shù)據(jù)集對(duì)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證,并且進(jìn)一步構(gòu)建可能的免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1IS的差異基因(DEGs)的鑒定 根據(jù)限制條件,在GEO數(shù)據(jù)庫中有GSE16561,包括對(duì)照和IS樣本。測(cè)序信息來自于人外周血單個(gè)核細(xì)胞。GSE16561芯片屬于GPL6882,其中包括24個(gè)對(duì)照樣本和39個(gè)IS樣本。根據(jù)P-Value<0.05和|log2fold change(FC)|>0.5的標(biāo)準(zhǔn),在GSE16561數(shù)據(jù)集中,獲得了651個(gè)DEGs,其中502個(gè)表達(dá)上調(diào),149個(gè)表達(dá)下調(diào)。

2.2PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與樞紐基因的鑒定 用v11.5 STRING構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò),用Cytoscape 3.9.1進(jìn)行可視化。利用Cytoscope 3.9.1的CytoNCA確定PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),獲得STAT3、PTEN、FOXO3、CREBBP、GLTSCR2等15個(gè)關(guān)鍵基因。根據(jù)Cytoscope 3.9.1產(chǎn)生的節(jié)點(diǎn)度評(píng)分,確定潛在的前15個(gè)樞紐基因。結(jié)果顯示,STAT3(評(píng)分12 023.7)和PTEN分子(評(píng)分11 404.3)是最顯著的基因。其余為FOXO3(評(píng)分7 853.2)、CREBBP(評(píng)分7 664.1)、GLTSCR2(評(píng)分5 516)、RPL3(評(píng)分5 148)、STAT1(評(píng)分4 869.4)、MYH9(評(píng)分4 324.8)、SYNJ1(評(píng)分4 311.4)、ITGAM(評(píng)分3 988.3)、IL2RB(評(píng)分3 768.2)、AGO2(評(píng)分3 201.6)、MMP9(評(píng)分3 143.9)、TLR2(評(píng)分2 963.1)、CD247(評(píng)分2 923.0)。見圖1。

圖1 前15個(gè)關(guān)鍵基因

2.3GO功能富集分析和KEGG富集途徑 采用David平臺(tái)對(duì)15個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO功能富集分析,獲取48個(gè)顯著差異的GO項(xiàng)目,包括6個(gè)細(xì)胞組分(Cell Component,CC)、33個(gè)生物過程(Biological Process,BP)(取前10個(gè))、9個(gè)分子功能(Molecular Function,MF)。DEGs介導(dǎo)的BP主要集中在RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的正向調(diào)控等方面。CC的發(fā)生結(jié)果主要集中在胞液、細(xì)胞質(zhì)等部位。MF的結(jié)果表明,蛋白結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合是主要富集項(xiàng)目。KEGG富集途徑的結(jié)果顯示,DEGs主要參與癌癥通路、PD-L1在癌癥中的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、乙型肝炎、Th17細(xì)胞分化。見圖2～圖5。

圖2 GO功能富集分析(BP)

圖3 GO功能富集分析(CC)

圖4 GO功能富集分析(MF)

圖5 KEGG富集分析

2.4整合的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)mirTargets 2.0網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)前15個(gè)關(guān)鍵基因的靶標(biāo)miRNAs,構(gòu)建預(yù)測(cè)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.5差異表達(dá)circRNAs的篩選及靶標(biāo)miRNAs的預(yù)測(cè) 采用GEO2R對(duì)IS組和對(duì)照組的血清樣本進(jìn)行差異circRNAs的分析,具有P-Value<0.05和|log2fold change(FC)|>1的circRNAs被認(rèn)為是差異表達(dá)的circRNAs。結(jié)合文獻(xiàn)挑選出顯著差異[P-Value<0.05,|log2fold change(FC)|>1]并且已經(jīng)經(jīng)過PCR驗(yàn)證過的差異circRNAs。使用Circular RNA Interactome 預(yù)測(cè)目標(biāo)miRNAs。見圖6。

2.6circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè) 使用在線可視化軟件Draw Venn Diagram生成維恩圖。分別對(duì)根據(jù)基因預(yù)測(cè)的miRNAs和根據(jù)circRNAs預(yù)測(cè)的miRNA取交集,預(yù)測(cè)可能的circRNA-miRNA-mRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.7免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的篩選 在ImmPort數(shù)據(jù)庫中獲得了免疫相關(guān)基因(IRGs),并將IRGs與我們預(yù)測(cè)可能的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因取交集。結(jié)果表明,重疊基因CD247、IL2RB、STAT1、STAT3被鑒定為免疫相關(guān)樞紐基因,之后我們?cè)陬A(yù)測(cè)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中篩選出了免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.8免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNAs驗(yàn)證 使用GSE117064數(shù)據(jù)集對(duì)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證[P-Value<0.05,|log2fold change(FC)|>0.5],提示hsa-miR-892a、hsa-miR-1276、hsa-miR-938、hsa-miR-1208、hsa-miR-338-3p在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào),hsa-miR-1248在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)。

2.9免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0112036在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào),hsa-miR-892a、hsa-miR-1276、hsa-miR-938、hsa-miR-1208、hsa-miR-338-3p在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào),CD247、IL2RB在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào)。相反,hsa_circ_0093708在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào),hsa-miR-1248在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)下調(diào),STAT1在缺血性卒中患者體內(nèi)表達(dá)上調(diào)。發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0112036可能作為hsa-miR-892a、hsa-miR-938、hsa-miR-1276、hsa-miR-1208、hsa-miR-338-3p的分子海綿調(diào)控缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展。hsa_circ_0093708可能作為hsa-miR-1248的分子海綿調(diào)控缺血性卒中的進(jìn)展。并且構(gòu)建了免疫circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而,這些因子還需要在未來的研究中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證。見表1。

表1 預(yù)測(cè)的循環(huán)免疫circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵因子

3 討論

卒中仍然是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一[9],目前急性缺血性卒中(Acute ischemic stroke,AIS)患者的數(shù)量仍然普遍,因此發(fā)現(xiàn)一種新的機(jī)制來解決AIS至關(guān)重要。近年來,針對(duì)IS發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究已經(jīng)取得顯著性的成就,許多研究者報(bào)道了microRNA調(diào)控IS。例如,Tiedt等人[7]發(fā)現(xiàn)循環(huán)的microRNA(miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-143-3p)與AIS相關(guān),可能作為AIS早期診斷標(biāo)志物。Burlacu等人[10]薈萃分析提示血清miR-9和中性粒細(xì)胞miR-29b是深入隨訪研究IS最有希望的生物標(biāo)志物,相比microRNAs,circRNAs具有高穩(wěn)定性[11],并且circRNAs具有作為miRNA海綿的潛力[12],機(jī)制上,越來越多的研究結(jié)果表明circRNAs通過作為miRNAs的分子海綿參與IS的發(fā)生發(fā)展。有研究表明,circ_0101874過表達(dá)通過靶向miR-335-5p來增強(qiáng)PDE4D表達(dá),以促進(jìn)缺血性腦卒中的神經(jīng)元損傷[13]。circPRDX3通過海綿miR-641抑制IS的發(fā)展,從而增加NPR3表達(dá)并使MAPK途徑失活[14]。這些結(jié)果可能有助于尋找IS的潛在治療靶點(diǎn)。

目前,缺血性腦卒中中越來越多的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)被發(fā)現(xiàn)。Wang等人[15]成功構(gòu)建了circRNA介導(dǎo)的免疫相關(guān)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)網(wǎng)絡(luò)。Cao等人[16]構(gòu)建了免疫相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò),從分子機(jī)制上為調(diào)控IS提供了新的看法。研究表明,circ_0006459的消耗通過miR-940/FOXJ2通路保護(hù)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMEC)免受氧-葡萄糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation,OGD)誘導(dǎo)的損傷,為缺血性卒中提供了可能的治療靶點(diǎn)[17]。circFUNDC1敲低通過miR-375抑制PTEN,減輕氧葡萄糖剝奪引起的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[18]。circUSP36 通過 miR-139-3p/SMAD3/Bcl2 信號(hào)軸減輕缺血性卒中損傷[19]。circVRK1敲低通過調(diào)節(jié)miR-150-5p/MLLT1通路削弱了HBMEC中OGD誘發(fā)的損傷,可能為IS治療提供了靶點(diǎn)[20]。此外,藥物也可以通過circ_0008146/miR-709/Cx3cr1軸發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,抑制腦缺血/再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡和炎癥[21]。

目前關(guān)于非編碼RNA以及circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)與免疫反應(yīng)的研究也越來越多。研究表明,circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)被發(fā)現(xiàn)可以在免疫浸潤、免疫逃逸、免疫治療等多方面調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。例如,Chen等人[22]將circPRDM4鑒定為肝細(xì)胞癌中缺氧相關(guān)的circRNA,circPRDM4被發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下通過促進(jìn)HIF-1α募集到CD274啟動(dòng)子上,從而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌PD-L1,促進(jìn)肝細(xì)胞癌中的細(xì)胞免疫逃逸。circCRIM1的沉默驅(qū)動(dòng)IGF2BP1介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌免疫逃逸[23]。在免疫浸潤方面,Ying等人[24]發(fā)現(xiàn)FAS介導(dǎo)的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)可以調(diào)節(jié)腦梗死中的免疫細(xì)胞浸潤。在免疫治療方面,有研究表明,HNRNPL誘導(dǎo)的circFAM13B通過新型circFAM13B/IGF2BP1/PKM2級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終抑制免疫逃逸,增強(qiáng)免疫治療敏感性,因此,circFAM13B可作為指導(dǎo)膀胱癌患者免疫治療的生物標(biāo)志物[25]。有趣的是,microRNA也可以參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。通過影響免疫浸潤,被microRNA-92a家族調(diào)節(jié)的SYT1,NEFM,GAP43和GRIA1被確定為帕金森病的診斷生物標(biāo)志物[26]。miR-155被發(fā)現(xiàn)和炎癥、免疫密切相關(guān),miR-155的免疫和炎癥作用表現(xiàn)為調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化、NK細(xì)胞殺傷、Th17細(xì)胞和Th1/Th2細(xì)胞分化[27]。綜上所述,非編碼RNA以及circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在免疫中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用,免疫反應(yīng)又作為缺血性卒中病理生理過程中重要的環(huán)節(jié),所以進(jìn)一步研究與免疫相關(guān)的非編碼RNA以及circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò),為解決缺血性卒中提供了新的思路,既與缺血性腦卒中相關(guān)又與免疫相關(guān)的非編碼RNA,可能成為缺血性腦卒中治療的新興生物標(biāo)志物。

本研究采用生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)可能的免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0112036可能作為hsa-miR-892a、hsa-miR-938、hsa-miR-1276、hsa-miR-1208、hsa-miR-338-3p的分子海綿調(diào)控缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展。hsa_circ_0093708可能作為hsa-miR-1248的分子海綿調(diào)控缺血性卒中的進(jìn)展。盡管如此,所預(yù)測(cè)的免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要在未來的研究中得到進(jìn)一步的驗(yàn)證。基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在IS的病理生理過程中扮演著重要的角色。這一發(fā)現(xiàn)將有助于更好地了解腦卒中的發(fā)病機(jī)制,并為IS提供不同的治療角度。本研究也存在一些局限性,一方面,目前的研究涉及基因數(shù)量仍然有限;另一方面,在構(gòu)建的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中,還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述,本研究在IS中發(fā)現(xiàn)了潛在的circRNA-miRNA-mRNA免疫相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),且在文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。免疫相關(guān)circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可能性及其生物學(xué)意義仍有待進(jìn)一步研究,為今后從機(jī)制上尋找circRNA、miRNA與IS的關(guān)系提供更多可能。